红景天类脂质制剂对缺氧所致PC12细胞凋亡抑制作用及相关机制

红景天苷是提取自红景天中的一种苯乙醇化合物，在药理方面具有很多活性。近些年来，关于红景天苷的药理活性研究热度越来越高。目前的研究已经证实红景天苷具有抵抗衰老[1]、缓解疲劳[2]、保护心脑血管[3]、调节机体免疫系统、抗炎症[4]、抗肿瘤[5-7]等功效。现有实验已经表明，因为中毒和缺氧诱导的小鼠生存能力降低，寿命减少的状况能够被红景天苷治疗[8]。本研究采用缺氧12 h诱导的PC12细胞损伤模型，对以红景天苷为主要成分的红景天类脂质制剂(Rho-lip)的抑制缺氧所致的PC12细胞凋亡活性及相关机制进行初步探究。

同位素示踪法的基本原理： 利用同位素及其化合物与相对应普通元素及其化合物具有相同化学和生物学性质，但核物理性质不同的特点，将同位素作为标记物，制备成含有同位素的化合物，代替相应非标记化合物进行标记。由于放射性同位素能够放出射线，因此可通过射线的感光作用进行放射自显影，或利用射线的电离作用、荧光现象进行核探测器检测。而稳定同位素虽不具有放射性，但其在原子质量上与普通的相应同位素有差别，因此可以通过质谱仪、气相层析仪、核磁共振仪等质量分析仪来测定。

1 材料与方法

1.1 材料 PC12细胞(来自于嗜铬细胞瘤)从ATCC采购；培养基DMEM、胎牛血清(FBS)、Fluo-4-AM钙离子荧光探针、神经生长因子(NGF)均购买自美国Invitrogen；MTT、JC-1 线粒体膜电位荧光探针、2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)、Hoechst33342细胞核染色试剂盒、蛋白酶抑制剂、免疫印迹沉淀检测缓冲液购买自美国的Sigma-Aldrich；ROS试剂盒从南京建成采办；L-谷氨酸(L-Glu)从北京鼎国昌盛采办；二甲基亚砜(DMSO)购买自天津光复公司；化学发光检测试剂盒购买自英国GEHealthcare企业；Bcl-xL、Bcl-2、P-Akt、T-Akt、T-GSK3β、P-GSK3β、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)等样品均购买自英国，Abcam集团。

1.2 器材 超净工作台从Airtech公司采办，荧光显微镜在北京斯内克集团采购，细胞培养箱在美国的Steri-Cycle采购，SYNERGY4酶标仪从美国BioTek采购，凝胶成像仪从美国UVP采购。

1.3 细胞培养 PC12细胞用含1%体积的青霉素/链霉素，5%体积的胎牛血清(FBS)和10%的灭活马血清的DMEM作为生长环境，放在温度为37℃、含5%CO2培养箱中繁育。PC12细胞用浓度为50 ng/mL的NGF诱导48 h使细胞发生分化，等细胞生长到平板面积的75%以后继续进行其他研究。

在构建教学环境的过程中，为了激发出学生对课堂的兴趣，则可以将“游戏场”这一概念应用在其中。在此过程中将学生作为教学的中心，使其感受到学习的乐趣，进而激发出学生对课堂的学习兴趣。在该种教学情境中，学生能够主动参与到学习中，教师能够将实际生活场景与知识相互结合，最终达到培养学生批判性思维的目的。在此过程中，在正式上课之前，教师需要预测课堂中可能会出现的问题，对学生的情绪展开适当调节，这种方式能够使学生在课堂中始终保持较高的积极性。

1.10 Rho-lip对缺氧诱导的PC12损伤细胞中Akt和GSK3β表达的影响 将PC12细胞以4.0×106个/孔的量添加在6孔板中，用Rho-lip和无氧给氧处理，随后用磷酸盐缓冲液(PBS)将孔板清洁3次，再加入RIPA 80 μL在冰上裂解蛋白半个小时，随后进行离心，离心速度为10000 r/min，离心时间是10 min，离心的温度为4℃，弃沉淀留清澈的液体用来测定细胞中的蛋白量。随后将样品稀释到相应浓度，按照文献中的操作方法研究Bcl-xL、Bcl-2、P-Akt、T-Akt、T-GSK3β以及P-GSK3β蛋白的表达水平，并以GAPDH作为内参对相应蛋白量进行标准化。

2.1 Rho-lip对缺氧诱导的PC12细胞活性的影响 PC12细胞活性测定如图1所示，用不同浓度(1 μg/mL、2 μg/mL、4 μg/mL和8 μg/mL)的Rho-lip处理PC12细胞后，PC12细胞的活性无明显变化(P＞0.05)；在厌氧培养箱中缺氧处理12 h后，PC12细胞的活性严重下降，生存能力也明显降低(P＜0.001)；而与单独缺氧处理的模型组相比，用4 μg/mL和8 μg/mL的Rho-lip预处理的PC12细胞的生存能力提高了将近28.9%和30.8%(P＜0.01)。

Fluo-4-AM可以检测胞内Ca2+的水平。在由缺氧导致的模型组细胞中，可以看到绿色荧光的亮度增加很多；而4 μg/mL和8 μg/mL的Rho-lip预处理4 h后，红色荧光亮度提升了较多。可知Rho-lip显著缓解由无氧引发的PC12细胞Ca2+含量的上升。

清代的《红楼梦》更是为后人所称道，无论是艺术上，还是思想上都成为古典小说的经典之作，鲁迅在《中国小说的历史变迁》中就讲：“自有《红楼梦》出来以后，传统的思想和写法都打破了。”其中，涉及到爱情、婚姻方面，曹雪芹讲述了宝、黛、钗的爱情婚姻故事，以宝玉、黛玉追求的“木石前盟”与贾薛两家期望的“金玉良缘”相对抗，也演绎了宝玉、黛玉这一对才子佳人反对封建礼教，追求自由爱情的故事。

2.4 Rho-lip对缺氧导致的PC12细胞线粒体膜电位的影响 细胞线粒体膜通透测定如图4A所示，缺氧处理PC12细胞12 h后，用荧光显微镜观察，可以看出绿光的强度有所增大，而红光也有所减弱，表明细胞内线粒体的跨膜电位(MMP)降低，说明缺氧对PC12细胞的线粒体造成严重损伤。4 g/mL和8 g/mL Rho-lip进行预处理之后再进行12 h的缺氧处理，显微镜观察结果表明，细胞内绿色荧光的区域减少，红色荧光的面积增加，表示细胞内线粒体的MMP有着显著的提高，同时膜透过性有所减弱。如图4B所示，在缺氧处理PC12细胞12 h后，模型组细胞内Bcl-xL和Bcl-2的含量显著减少(P＜0.01)；而与模型组的损伤细胞比较，用8 g/mL Rho-lip先孵育3 h的给药组Bcl-xL和Bcl-2蛋白的表达水平分别提高了19.8%及50.1%。

1.8 细胞内Ca2+浓度分析 在NEST6孔板内接种PC12细胞，细胞量为2.0×106个/孔，用Rho-lip先处理PC12细胞4 h，在每孔加入浓度5 m/L的Fluo-4-AM试剂，在培养箱暗室中孵育半个小时，将孔板用PBS荡涤3次去除多余染料。最后在显微镜下观察每个实验组信号强度的改变情况。

1.9 细胞线粒体膜通透性测定 把PC12细胞随机划成四个实验组，其中涵盖健康小鼠的空白组(不进行缺氧处理)、模型组(直接进行缺氧处理)、实验组(4 g/mL和8 g/mL Rho-lip预处理后再进行缺氧处理)，从实验结果图可以得知，铬瘤细胞处理半天后，采用JC-1染料进行染色，使用荧光显微镜来研究Rho-lip对细胞内线粒体膜通透性的影响。

1.4 细胞缺氧-复氧损伤凋亡模型(NHC) 把神经细胞置于标准培养箱内生长4 d后，添加不同浓度红景天类脂质体制剂预处理4 h，随后放入含有82%N2、5%CO2、10%H2三种混合气的厌氧培养箱中，缺氧繁育12 h，随后放在饱和湿度37℃、5%CO2培养箱中复氧繁育24 h。

1.11 统计学方法 实验数据以均数±标准差(x-±s)表示，使用SPSS16.0软件(IBM公司，Armonk，NY)进行单因素方差分析(ANOVA)，然后进行事后多重比较(Dunn′s检验)以计算统计学显著性。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

1.5 细胞活性测定 分别用浓度为1 μg/mL，2 μg/mL，4 μg/mL和8 μg/mL的Rho-lip或空白培养基对PC12细胞进行预处理4 h，随后缺氧处理12 h后，然后将细胞放在标准培养箱中复氧繁育24 h，然后加入10µL MTT处理4 h，随后弃去孔板中培养液，并在每个孔中添加100µL的DMSO，再放于37℃培养箱中培养15 min，使结晶甲瓒溶于DMSO，最后使用酶标仪检测490 nm和540 nm下的OD值。

Bach依据标准化的非字面意义(standardized non-literality)假说来解释隐意的解读机制。在他看来，隐意系话语以标准化形式表达的非字面意义，其解读基于语言形式的默认认知和共享背景自动获得，不需要特殊的规约或特定的语境。［14］也就是说，从话语到隐意的交际推理过程中，听话者不用考虑与所言相关的其他可替代选项而直接得出结论。［15］如话语(2)通常传达的并非其语言编码的字面意义或所言解释(2a)，而是其标准化的典型意义或隐意(2b)。

  

图1 Rho-lip对缺氧12 h致PC12细胞损伤的影响

 

注：与空白组比较，aP＜0.01；与缺氧模型组比较，bP＜0.01。

2.2 Rho-lip对缺氧导致PC12细胞凋亡的影响 细胞凋亡形态分析如图2所示，细胞缺氧12 h，复氧24 h后，亮蓝色荧光细胞含量增加，凋亡比例显著升高。而与单独缺氧处理的损伤细胞不同，4 μg/mL和8 μg/mL的Rho-lip预处理后的PC12细胞凋亡比例显著降低。结果显示Rho-lip能够显著阻止由缺氧引起的细胞损伤。

高速铁路运输是一种新型的交通运输方式，对我国交通运输结构有着重大影响，促进交通业转型。目前高铁的客流运输极大地改善了我国的交通运输情况，促进我国向高速运输时代迈进。京沪线高铁的运营对民航业带来了一定程度的影响，目前要根据旅客出行方式具体情况进行分析研究，协调二者的发展。

1.6 细胞凋亡形态分析 在NEST6孔板内接种PC12细胞，细胞量为2.0×106个/孔，待PC12细胞发生分化后，加入Rho-lip继续繁殖4 h，随后无氧处理12 h后，再将细胞放在标准培养箱中给氧生长1 d，按照说明书在每孔添加浓度为5 μg/mL的Hoechst染料，在培养箱暗室中孵育30 min，将NEST6孔板用磷酸盐缓冲液(PBS)荡涤3次去除多余的染料，最后在荧光显微镜下检测每组信号强度的变化。

  

图2 Rho-lip对无氧培养12 h引发的PC12细胞凋亡的改变情况(标尺为100 μm)

  

图3 Rho-lip对缺氧诱导PC12细胞中ROS过度释放及钙离子内流的抑制作用(标尺为100 μm)

 

注:A，Rho-lip对缺氧诱导PC12细胞中ROS过度释放的抑制作用；B，Rho-lip对钙离子内流的抑制作用。

1.7 活性氧簇(ROS)活性测定 在NEST6孔板内接种PC12细胞，细胞量为2.0×106个/孔，用Rho-lip先处理4 h后，随后在厌氧培养箱中无氧处理12 h后，将细胞放在标准培养箱中有氧生长1 d，然后向每孔添加10 μmol/L的DCFH-DA，在37℃的培养箱中繁殖20 min。将孔板用PBS荡涤3次去除多余染料，最后在荧光显微镜下检测每组信号强度的变化。

2.3 Rho-lip对缺氧PC12细胞内ROS和Ca2+浓度的影响 细胞内活性氧簇(ROS)活性测定及Ca2+浓度分析如图3所示。DCFH-DA分析结果显示，PC12细胞无氧孵育12 h后，ROS的含量有着显著的增加；而与PC12细胞的模型组相比，4 μg/mL和8 μg/mL的Rho-lip预处理4 h后，再缺氧处理12 h，PC12细胞荧光强度会有很明显的降低。说明Rho-lip能够显著阻止由缺氧诱导的PC12胞内ROS含量的增加。

2.5 Rho-lip对缺氧诱导的PC12细胞中Akt和GSK3β表达的影响 Rho-lip对由缺氧诱导的PC12损伤细胞中Akt和GSK3β含量变化如图5，缺氧处理PC12细胞12 h后会显著减少P-Akt及P-GSK3β的含量(P＜0.01)；用Rho-lip先孵育细胞4 h，能够显著地抑制缺氧所致的磷酸化GSK3β和Akt的表达显著下降(P＜0.01)。结果表明Akt/GSK3β通路的激活可以介导Rho-lip对缺氧所致的PC12细胞凋亡保护作用。

房门又推开了。有个兵送来两碗肉丝面，放桌上就转身走了。赛十娘对我说：“这是托你的福。来了新人，头两天他们会给点儿好吃的，让你先尝点甜头儿。平素可冇得这好的伙食。”

  

图4 Rho-lip对缺氧引发的PC12细胞中线粒体膜透过性的变化(标尺为100 μm)

 

注：A，细胞线粒体膜透过性变化；B，Bcl-2及Bcl-xL蛋白的表达水平。与空白组比较，aP＜0.01；与缺氧模型组比较，bP＜0.05，cP＜0.01。

  

图5 Rho-lip对缺氧诱导的PC12细胞中磷酸化Akt及GSK3酸表达的调节作用

 

注：与空白组比较，aP＜0.01；与缺氧模型组比较，bP＜0.01。

3 讨论

凋亡是机体为了维持自身的稳定和适应周围环境而进行的死亡程序，对于细胞有很重要的意义，但在某些损伤因素的影响下，细胞会发生过度的异常凋亡，细胞凋亡的过程中会发生很多特异的形态学变化。本研究发现，缺氧处理12 h后，PC12细胞的损伤显著增加致使细胞凋亡数目增加。经不同浓度的Rho-lip预处理后，PC12细胞损伤程度明显减小，凋亡数目显著降低，起到保护缺氧所致的PC12细胞凋亡作用。

ROS是细胞生命活动过程中产生的一系列因子，主要包括包括：H2O2、O2-、及OH-等。有前期研究报道，细胞内ROS过度累积能够引起细胞凋亡乃至死亡[9-10]。本实验结果证明，Rho-lip能够显著降低缺氧诱导的PC12胞内ROS的升高，从而抑制细胞的过度凋亡。近几年的实验报道表明，神经细胞胞内Ca2+过度累积会致使细胞发生病理改变，最后引发细胞的死亡；细胞内Ca2+超负荷会引发很多细胞功能产生故障，最终会诱发神经元的损伤，甚至发生死亡。细胞内Ca2+超负荷是缺血性神经元变性的一个特征[10-12]。本实验结果表明Rho-lip能够显著降低缺氧诱导的PC12细胞内钙离子含量的增多，进而阻止由Ca2+超负荷而引发的一系列导致神经细胞的损伤和死亡反应发生。

Bcl-2家族蛋白是参与内源性死亡的重要成员，这也与细胞凋亡密切相关，其中，Bcl-2和Bcl-xL的作用为阻碍凋亡，Bax则加速凋亡[13-15]。本实验结果说明，Rho-lip显著地提高细胞中Bcl-xL以及Bcl-2蛋白的浓度，Rho-lip通过促进凋亡抑制蛋白表达，以及线粒体依赖途径来阻碍细胞的过度凋亡。GSK3β是Akt的底物，Akt能够使GSK3β磷酸化，磷酸化的GSK3β蛋白质表达量的降低能诱导细胞的凋亡，这一过程与抑制细胞内Bcl-xL蛋白的表达水平密切相关[16-17]。Rho-lip能够显著地抑制缺氧所致的磷酸化GSK3β和Akt的表达下降。表明Akt/GSK3β通路的激活可以介导Rho-lip对缺氧所致的PC12细胞凋亡保护作用。

总之，Rho-lip可以显著抑制由缺氧引发的细胞凋亡，并抑制胞内Ca2+浓度的提高，减少MMP降低，阻止细胞内ROS过度累积，并增加了PC12内Bcl-2、Bcl-xL的含量，引发Akt/GSK3β通路从而阻碍了由缺氧引发的细胞凋亡。实验结果表明，Rho-lip保护缺氧所致细胞凋亡与线粒体相关的途径和Akt/GSK3β通路的激活密切相关。

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