Wnt/β-catenin信号通路对套细胞淋巴瘤中细胞增殖、侵袭性生长的影响

套细胞淋巴瘤是非霍奇金淋巴瘤的特殊亚型，具有较强的侵袭性生长特性，预后较差[1，2]。Wnt/β-catenin通路是调节细胞增殖、分化、迁移、侵袭等生物学行为的关键信号通路，该通路的过度激活被证实与多种恶性肿瘤的发生密切相关[3]。经典Wnt通路的激活能够阻碍GSK-3β对β-catenin的降解作用，使β-catenin在细胞内聚集并向核内转移，进而引起下游多种基因表达的改变并发挥调节细胞增殖、分化、迁移、侵袭的生物学效应。关于套细胞淋巴瘤的体外研究证实，干扰Wnt/β-catenin通路中关键分子β-catenin的表达后能够有效抑制淋巴瘤细胞的生长[4]，但关于套细胞淋巴瘤内Wnt/β-catenin通路功能的变化及意义尚未明确。在下列研究中，我们讨论了Wnt/β-catenin信号通路对套细胞淋巴瘤中细胞增殖、侵袭性生长的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2015年3月～2017年5月期间在华中科技大学同济医学院附属同济医院诊断为套细胞淋巴瘤的患者作为研究的淋巴瘤组，所有患者均经淋巴结活检诊断为套细胞淋巴瘤，共56例，包括男性32例，女性24例，年龄34～61岁；选择同期经淋巴结活检诊断为反应性增生的患者作为对照组，共28例，包括男性16例，女性12例，年龄33～60岁。两组患者一般资料的比较无显著性差异(P>0.05)。

1.2 研究方法

1.2.1 标本采集及保存方法 取两组患者切除的淋巴结活检组织，生理盐水清洗1～2遍后用液氮短暂冷冻，取出后放置在-80℃超低温冰箱保存。

1.2.2 分子蛋白含量检测方法 取两组患者的淋巴结组织，加入蛋白裂解液后进行超声破碎，而后采用酶联免疫吸附试剂盒测定β-catenin、p-GSK-3β、Tcf/Lef、DKK1、WIF-1的含量。

内部控制对于医院的意义更多的是为了能够落实控制目标，通过一系列的内部控制流程将经济活动的风险进行遏制。而且医院作为市场经济中特殊的组织，内部控制的主要目的就是为了提升医疗质量，内部控制将会计信息质量进行提升，为资产安全提供保障。从而确保医院的各项业务能够在遵循法律法规的前提下进行落实，综述就是医院的内部控制是否具有高效的运营直接关系到医院运营管理好坏。

在淋巴瘤病灶内，多种受到Wnt/β-catenin通路调控的增殖基因与肿瘤细胞的异常增殖有关。C-myc和CyclinD1是与淋巴瘤细胞异常增殖密切相关的促增殖基因，C-myc能够在细胞核内发挥转录激活作用并促进细胞增殖，CyclinD1能够在细胞质内与CDK4、CDK6形成复合物并加速细胞周期、促进细胞增殖[12，13]。Bax是线粒体凋亡途径的调节分子，能够通过促进细胞凋亡来抑制细胞增殖。Bax所形成的孔道能够促进线粒体内的细胞色素C进入胞浆，进入胞浆后的细胞色素C通过与Apaf-1相互作用来启动级联放大反应、引起Caspase-3活化并介导细胞凋亡；TNFAIP3是由A20基因编码的产物，能够使NF-κB通路中的受体作用蛋白发生泛素化降解，进而抑制NF-κB通路所介导的细胞增殖[14]。我们通过分析淋巴瘤组织中上述增殖基因表达量的变化可知：淋巴瘤组患者淋巴结组织中C-myc、CyclinD1的mRNA表达量显著高于对照组，Bax、Apaf1、Caspase-3、TNFAIP3的mRNA表达量显著低于对照组。这就说明促增殖基因的高表达、增殖抑制基因的低表达与套细胞淋巴瘤的发生密切相关。进一步分析淋巴瘤中Wnt/β-catenin通路变化与增殖基因表达量变化的相关性可知：C-myc、CyclinD1的mRNA表达量与β-catenin、p-GSK-3β、Tcf/Lef的蛋白含量呈正相关，与DKK1、WIF-1的蛋白含量呈负相关；Bax、Apaf1、Caspase-3、TNFAIP3的mRNA表达量与β-catenin、p-GSK-3β、Tcf/Lef的蛋白含量呈负相关，与DKK1、WIF-1的蛋白含量呈正相关。这就说明淋巴瘤组织中Wnt/β-catenin通路的激活能够增加促增殖基因的表达、减少增殖抑制基因的表达，进而促进淋巴瘤细胞的增殖。

1.3 统计学处理

采用SPSS20.0软件录入数据并对两组间数据的差异进行t检验分析、对相关性进行Pearson检验分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Wnt/β-catenin信号通路分子的含量

淋巴瘤组患者淋巴结组织中C-myc、CyclinD1的mRNA表达量显著高于对照组，Bax、Apaf1、Caspase-3、TNFAIP3的mRNA表达量显著低于对照组。Pearson检验显示：淋巴瘤组织中C-myc、CyclinD1的mRNA表达量与β-catenin、p-GSK-3β、Tcf/Lef的蛋白含量呈正相关，与DKK1、WIF-1的蛋白含量呈负相关；Bax、Apaf1、Caspase-3、TNFAIP3的mRNA表达量与β-catenin、p-GSK-3β、Tcf/Lef的蛋白含量呈负相关，与DKK1、WIF-1的蛋白含量呈正相关。见表2。

 

表1 两组患者淋巴结组织中Wnt/β-catenin信号通路分子的比较

  

组别nβ-catenin(ng/mL)p-GSK-3β(pg/mL)Tcf/Lef(pg/mL)DKK1(ng/mL)WIF-1(ng/mL)淋巴瘤组564.27±0.69203.8±33.6287.4±36.90.93±0.111.77±0.25对照组281.33±0.1785.9±10.3113.5±12.93.26±0.583.65±0.51t19.28813.47514.02823.27211.938P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

2.2 增殖基因的表达量

两组患者淋巴结组织中Wnt/β-catenin信号通路分子β-catenin、p-GSK-3β、Tcf/Lef、DKK1、WIF-1含量的分析如下：淋巴瘤组患者淋巴结组织中β-catenin、p-GSK-3β、Tcf/Lef的蛋白含量显著高于对照组，DKK1、WIF-1的蛋白含量显著低于对照组。见表1。

 

表2 两组淋巴结组织中增殖基因的比较

  

组别nC-mycCyclinD1BaxApaf1Caspase-3TNFAIP3淋巴瘤组562.89±0.423.37±0.510.37±0.070.26±0.050.44±0.070.52±0.09对照组281.02±0.150.98±0.121.03±0.170.97±0.161.04±0.180.95±0.11t17.85823.12817.69824.58612.6779.282P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

2.3 侵袭基因的表达量

3.认识困境。在网络反恐国际合作进程中，不容忽视的一个阻碍为国家之间意识形态差异导致的认识困境。每个国家都有自己的文化和价值体系，在此基础上形成不同的意识形态，反映在网络反恐中，表现为对打击恐怖主义的方式、策略、手段等的不同，部分国家对恐怖主义的看法和对打击恐怖主义方式上存异，是难以形成反恐合力的现实因素。这也符合构建主义合作观下对文化认同的基本界定。

 

表3 两组淋巴结组织中侵袭基因的比较

  

组别nEst-1MMP9MMP26TIMP2TIMP4淋巴瘤组563.11±0.462.78±0.423.49±0.510.29±0.050.34±0.07对照组281.04±0.170.98±0.121.05±0.140.97±0.161.02±0.16t20.39317.38324.58529.39316.584P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

3 讨论

笔者针对食品科学与工程本科专业果蔬加工工艺学课程教学中存在的问题，分析了目前比较流行的工作坊教学模式的内涵和特点，并引入果蔬加工工艺学的理论、实验教学中，并应用以赛代考工作坊进行实效评价。结果发现，工作坊教学模式在提高学生运用专业知识的能力、产品开发能力和实践能力的同时，还激活了学生的自主学习动力，提高了创新意识、人际沟通、团队合作、语言表达能力等综合素质，达成了教学目标，提高了教学实效性。

套细胞淋巴瘤具有极强的侵袭性生长特性，治疗难度大、复发率高、预后差[5,6]。目前，套细胞淋巴瘤的发病机制仍未明确。Wnt/β-catenin通路是细胞内调控增殖、分化、迁移、侵袭等生物学行为的关键信号通路，与多种恶性肿瘤的发生有关。Wnt蛋白家族是该通路的上游信号分子，与细胞膜表面的卷曲蛋白受体及辅助受体LRP5/6结合后能够启动细胞内的下游信号转导[7]。Wnt与受体结合后，能够使细胞内Axin/APC/CK1α/GSK3β复合体发生解离，使GSK3β发生磷酸化并阻碍GSK3β对β-catenin的降解，进而造成β-catenin在细胞内蓄积并不断向细胞核内转移；进入细胞核的β-catenin能够与转录因子Tcf/Lef结合并调节多种靶基因的表达[8，9]。DKK1和WIF-1是Wnt信号通路的抑制分子，前者能够与卷曲蛋白受体结合并阻碍Wnt通路下游信号分子的激活、后者能够直接与Wnt分子竞争性结合卷曲蛋白受体[10，11]。为了明确Wnt/β-catenin通路在套细胞淋巴瘤病情发展变化过程中的作用，我们对该通路中效应分子及抑制分子表达量的变化进行了分析，结果显示：淋巴瘤组患者淋巴结组织中β-catenin、p-GSK-3β、Tcf/Lef的蛋白含量显著高于对照组，DKK1、WIF-1的蛋白含量显著低于对照组。这就说明套细胞淋巴瘤中Wnt/β-catenin通路中效应分子呈高表达趋势、抑制分子呈低表达趋势，Wnt/β-catenin通路的过度激活与套细胞淋巴瘤的发生有关。

1.2.3 基因mRNA表达量检测方法 取两组患者的淋巴结组织，加入RNA裂解液后进行超声破碎，而后采用试剂盒抽提RNA并反转录合成为cDNA，设计C-myc、CyclinD1、Bax、Apaf1、Caspase-3、TNFAIP3、Est-1、MMP9、MMP26、TIMP2、TIMP4的引物并对cDNA进行荧光定量PCR反应，根据反应曲线计算mRNA表达量。

套细胞淋巴瘤中Wnt/β-catenin信号通路显著激活；异常激活的Wnt/β-catenin信号通路对套细胞淋巴瘤中细胞的增殖及侵袭性生长具有促进作用。

淋巴瘤组患者淋巴结组织中Est-1、MMP9、MMP26的mRNA表达量显著高于对照组，TIMP2、TIMP4的mRNA表达量显著低于对照组。Pearson检验显示：淋巴瘤组织中Est-1、MMP9、MMP26的mRNA表达量与β-catenin、p-GSK-3β、Tcf/Lef的蛋白含量呈正相关，与DKK1、WIF-1的蛋白含量呈负相关；TIMP2、TIMP4的mRNA表达量与β-catenin、p-GSK-3β、Tcf/Lef的蛋白含量呈负相关，与DKK1、WIF-1的蛋白含量呈正相关。见表3。

淋巴瘤内细胞具有侵袭性生长的特性，侵袭性生长的过程同时依赖于细胞的增殖和侵袭，而与细胞侵袭关系最密切的生物学环节则是细胞外基质及细胞基底膜的降解。MMPs家族是一族锌离子依赖的蛋白水解酶，其中多种成员对细胞外基质及细胞基底膜中的成分具有水解作用[15]。MMP9、MMP26是已知与淋巴瘤病灶内细胞外基质及细胞基底膜降解有关的MMP分子，通过水解胶原蛋白、弹性蛋白等成分来促进细胞的侵袭[16，17]；Est-1是Est转录因子家族的成员，通过与MMPs启动子区域的特定序列结合来增强其转录，进而使多种MMPs分子表达增多、水解能力增强并有利于细胞的侵袭。TIMP2和TIMP4是MMPs家族的特异性抑制分子，通过与MMPs形成共价结合来抑制其水解活性，进而阻碍细胞的侵袭。我们通过分析淋巴瘤组织中上述侵袭基因表达量的变化可知：淋巴瘤组患者淋巴结组织中Est-1、MMP9、MMP26的mRNA表达量显著高于对照组，TIMP2、TIMP4的mRNA表达量显著低于对照组。这就说明促侵袭基因的高表达、侵袭抑制基因的低表达与套细胞淋巴瘤的发生密切相关。进一步分析淋巴瘤中Wnt/β-catenin通路变化与侵袭基因表达量变化的相关性可知：Est-1、MMP9、MMP26的mRNA表达量与β-catenin、p-GSK-3β、Tcf/Lef的蛋白含量呈正相关，与DKK1、WIF-1的蛋白含量呈负相关；TIMP2、TIMP4的mRNA表达量与β-catenin、p-GSK-3β、Tcf/Lef的蛋白含量呈负相关，与DKK1、WIF-1的蛋白含量呈正相关。这就说明淋巴瘤组织中Wnt/β-catenin通路的激活能够增加促侵袭基因的表达、减少侵袭抑制基因的表达，进而促进淋巴瘤细胞的侵袭性生长。

综上所述，自贸园区与自由贸易协定两者同时存在相互冲突与相互协调的矛盾关系，因而如何防止两者之间互相掣肘，而发挥两个贸易制度工具之间的协同效应，是构建两种法律制度应当思考的重要问题。

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