饲料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的测定——高效液相色谱法

1　引言

2015年9月中华人民共和国农业部发布公告决定在食品动物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种兽药（中华人民共和国农业部公告 第2292号）。公告内容：为保障动物产品质量安全和公共卫生安全，我部组织开展了部分兽药的安全性评价工作。经评价，认为洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种原料药的各种盐、酯及其各种制剂可能对养殖业、人体健康造成危害或者存在潜在风险。根据《兽药管理条例》第六十九条规定，我部决定在食品动物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种兽药，撤销相关兽药产品批准文号。因此本文建立了高效液相色谱方法对饲料中的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星进行测定。

2　材料与方法

2.1　试剂与材料

除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。磷酸二氢钾；氢氧化钠；甲醇：色谱纯；乙腈：色谱纯；磷酸：色谱纯；三乙胺：色谱纯；氨水；提取液：磷酸盐缓冲溶液（取磷酸二氢钾6.8g，加水使溶解并稀释至500 mL，用5.0mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0）375mL与125mL乙腈混匀；氨水-甲醇溶液：将30mL氨水与70mL甲醇混合均匀；对照品：洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星 （纯度≥98%）；对照储备液：精确称取对照品50mg（精确到0.1mg），用0.03mol/L氢氧化钠溶液溶解并稀释，该溶液浓度为1.0mg/mL；对照工作液：准确移取适量对照储备液，用流动相配成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0μg/mL；0.22μm 微孔滤膜；混合型阳离子固相萃取柱（60 mg/3 mL）。

2.2　仪器与设备

高效液相色谱仪（配有紫外检测器）；分析天平：感量0.00001g和0.001g；固相萃取装置；旋涡混匀器；离心机；恒温振荡器；氮吹仪。

在当前的新生儿当中，先天性面部畸形的一种常见表现就是唇裂，在目前的临床的当中达到了千分之一，不仅会造成新生的面部美观受到影响，同时也会使得新生儿出现一些语言障碍、吸吮乳头困难以及牙齿不齐等等问题，通过进行早期的筛查，能够更好的进行诊断[1]。在当前的孕前检查当中，二维超声与三维超声的应用比较广泛，而三维超声在诊断的准确率方面要明显高于二维超声，能够更好的提升孕妇的产前检查效果[2]。因此，通过从本院在2016年11月—2018年7月间进行孕前检查的孕妇当中进行抽取，选取3200例孕妇作为样本，回顾性分析孕妇的相关临床资料，更好的了解二维超声与三维超声的差异。

2.3　液相色谱条件

检测波长：287nm； 色谱柱：C18 柱，5μm，250mm*4.6mm；流动相：移取1.7mL磷酸用水稀释至 1L，三乙胺调 pH 至 3.0，并按 82∶7∶11 的比例和甲醇、乙睛混合，用前超声脱气5min；流速：1.0 mL/min；进样量：20μL。

将 分 别 配 制 为 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0μg/mL的标准工作液，分别注入色谱仪，测定各浓度工作液的峰面积，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2.4　样品前处理

其中，参数λ>0和R分别表示耦合强度和噪声强度； 表示独立白噪声标量；aij(x)表示个体之间的连接强度,满足定义1,具体表达形式为aij(x)=1/(1+‖xj(t)-xi(t)‖2)β(β≤0.5)。

2.5　标准曲线的绘制

城市是区域经济发展的火车头，对区域经济发展具有重要推动作用。一方面，城市发展对周围地区自然资源和社会经济资源的开发极大地促进了区域的工农业生产。通过吸收资金和技术，利用区域内外的资源进行生产，促进区域经济总量的扩大，并对区域内其他产业和部门带来乘数效应，推动区域整体经济的快速发展。另一方面，城市发展和工业化为城乡居民的就业提供了更多机会。城市发展对基础设施的巨额投资会带动相关产业的发展，工业与人口的集聚也带动乡村土地流转加快，进而耕地也得到了保护，促进江阴经济的良性发展。

2.6　灵敏度的测定

该方法测定洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的检测限为1.0 mg/kg，定量限为5.0 mg/kg。

2.7　回收率的测定

空白饲料、阳性添加饲料、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星对照品溶液的液相色谱见图 1～图 3。

3　结果

称取空白配合饲料2.0g，分别添加一定量的标准工作液，使得添加浓度分别为1.0，5.0，10.0mg/kg，每一浓度的样品设置5个重复，按样品处理方法测定，用外标法根据峰面积计算其含量和添加回收率。

准确称取试样2.0g,置于50mL具塞离心管中,准确加入10.00mL提取液，振荡摇床振荡15min。置于离心机中15000r/min离心10min，取上清液备用。用3mL甲醇、3mL水活化固相萃取柱，准确移取5.00mL备用液过柱，用3mL水、3mL甲醇淋洗，真空抽干。3mL氨水-甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，于50℃下氮气吹干。准确移取1.00mL流动相溶解残留物，涡旋混合1min，过微孔滤膜后，供高效液相色谱分析。

  

图1　空白饲料色谱图

  

图2　阳性添加饲料色谱图（5.0 mg/kg）

  

图3　洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星对照品色谱图（5.0mg/L）

3.1　标准曲线

在选定的条件下，做定量校准曲线。以洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的浓度对峰面积绘制标准曲线，结果见表1，表明洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星在0.5～50.0μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。

环境检测数据包括水和废水监测，空气与废气监测，土壤、底泥和固废监测，噪声和振动检测，以及生物检测等项目，涉及水环境（地下水、地表水）、空气环境及声环境等环境要素，还涉及工业废水、工业废气、厂界噪声、生活污水及社会生活噪声等各类污染源．依据国家标准分析方法中的100多项污染物计算方法和实验室的检测原始记录，开发污染物分析结果计算的模块，实现结果计算自动化．

3.2　方法的检测限

称取5份配合饲料各2.0g，按样品处理方法测定，测得基线噪音值，按3倍信噪比计算，求得该方法的检测限。

 

表1　洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星浓度范围线性关系

  

标准工作液范围(mg/L)线性方程　线性回归系数洛美沙星　Y=1.01e+005 X-2.94e+004　0.999 0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，50.0培氟沙星　Y=8.36e+004 X-4.21e+004　0.999氧氟沙星　Y=9.45e+004 X-3.01e+004　0.999诺氟沙星　Y=1.16e+005 X-4.78e+004　0.999

4　讨论与分析

4.1　波长的选择

洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星呈碱性，具有较强的极性，其在反相色谱上保留时间比较好控制。采用反相色谱时有机相的比例对洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的保留影响比较大，选择合适比例的有机溶剂是很必要的。甲醇的洗脱能力低于乙腈，因此选择乙腈作为有机相。随着流动相中乙腈比例的加大，洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的保留时间降低。但单独使用乙腈作为有机相时，等度或梯度流动相中氧氟沙星、诺氟沙星出峰时间重叠，无法分离，所以用部分甲醇代替乙腈，作为有机相组成。为了避开色谱图中氧氟沙星、诺氟沙星峰重叠的干扰，试验比较了多种不同甲醇、乙腈组成比例的色谱图，结果发现采用流动相组分为82%磷酸溶液∶7%甲醇∶11%乙腈的比例时，可有效洗脱洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星，并分离氧氟沙星、诺氟沙星组份，从综合效率考虑此流动相组成比例为最佳。

4.2　流动相的选择

由洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星在分光光度计的扫描图可知，洛美沙星、氧氟沙星最佳吸收波长为287nm，培氟沙星、诺氟沙星最佳吸收波长为278nm。在278nm波长处洛美沙星、氧氟沙星吸收值与培氟沙星、诺氟沙星吸收值相差较大，而在287nm波长处培氟沙星、诺氟沙星吸收值与洛美沙星、氧氟沙星吸收值相差较小，因此确定最佳检测吸收波长为287nm。

4.3　提取溶剂的选择

试验中采用了0.1mol/L氢氧化钠溶液，磷酸盐缓冲溶液（pH7.0），0.1mol/L盐酸溶液；0.025mol/L磷酸-三乙胺溶液（pH3.0），等作为提取溶液。通过试验比较各种溶液的回收率，磷酸盐缓冲溶液（pH7.0）提取液能较好的减少杂质对提取饲料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的影响，但回收率较低。为提高回收率，所以在提取液中加入乙腈，经过比较从5%～50%乙腈比例，得出25%乙腈比例回收率最佳。

当前大多小学生的写作能力不高，并且在写作的过程中不明白怎样使用作文素材，甚至不知道怎样去完成一篇高水平的文章。因此，教师和家长在对学生进行教育的过程中应注重阅读对于学生的重要意义，为学生构建高质量的阅读平台，从而支持学生开展课外阅读，激发其阅读兴趣，使学生喜欢阅读，提高学生的阅读能力以及写作能力。

4.4　净化条件的选择

洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星为碱性化合物，难溶于其他有机溶剂，通过比较HLB、C18、PCX、AluminumN、SCX、MCX、MAX　等固相萃取小柱的回收率和净化效果，最终确定选择回收率高，净化效果好的混合型阳离子固相萃取柱进行净化。

5　结论

采用高效液相色谱检测技术测定饲料中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星含量的检测方法，在饲料中添加浓度为1.0，5.0，10.0mg/kg时，测得洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星的平均回收率分别为60.0%～95.0%，变异系数分别为1.0%～8.8%，各组分的检测限为1.0mg/kg，定量限为5.0mg/kg。方法具有较好的灵敏度、准确度和精密度，定量限符合相关规定。

高效液相色谱法有“高压、高速、高效、高灵敏度、应用范围广”的特点，最低一级基层实验室均可满足本方法的实验条件，具有很高的推广价值。但由于紫外检测器本身的局限性，导致在检测的过程中，可能存在假阳性的问题，就需要使用更高级的质谱或者串接质谱检测器来做精确辨别。

参考文献（略）