黑龙江不同地点嗜群血蜱核糖体和线粒体基因遗传变异分析

嗜群血蜱（Haemaphysalis concinna）属于硬蜱科，血蜱属，广泛分布于我国各地，尤其是北方地区。嗜群血蜱不仅寄生在家畜和野生动物的体表，有时也会侵袭人，不仅通过叮咬给宿主造成机械性损伤，还可以通过叮咬传播疾病给宿主，如斑点热、莱姆病等。不仅给畜牧业造成了极大的经济损失，而且还严重影响了人类的公共健康。

核糖体DNA（rDNA）内转录间隔区（ITS）序列在种内具有高度保守性，种间具有序列多态性，同时受外界环境因素影响较小，进化速度较快，具有种内变异小而种间变异大的特性，广泛用于探讨虫种内或种间亲缘关系[1]。线粒体DNA具有分子量小、结构基因保守性强且结构简单等特点，被广泛应用于遗传变异、分子分类等相关研究。先前的研究表明，一些线粒体基因组基因比如16S rDNA、cox1、cytb等均可以作为分子标记，有于研究蜱的种内或种间遗传变异[2-3]。但是目前，关于嗜群血蜱的多态性研究还未见报道。因此，实验对来自黑龙江5个地点嗜群血蜱的ITS2序列和线粒体的2个16S rDNA、cox1基因进行分析，研究其种内遗传变异特征。

1　材料与方法

1.1　蜱的来源

在桦南向阳、宝清三岔河、勃利种畜场、双鸭山岭东区和桦南林河村，使用布旗法采集嗜群血蜱，每个地点随机抽取5只，以地点拼音首字母为缩写，分别标记为 HNXY1～5、BQSCH1～5、BLZCC1～5、SYSLD1～5、HNLHC1～5。标本均保存在 75%的酒精溶液中。

1.2　DNA的提取

将蜱在依次递减浓度的酒精中进行清洗，最后使用蒸馏水清洗。在研钵中使用液氮将蜱磨碎，再使用DNA提取试剂盒进行DNA的提取，提取出的DNA在-20℃冰箱保存。

1.3　序列的扩增

使用参考文献中的引物[4-5]，扩增ITS2序列、16S rDNA基因、cox1基因。引物序列具体情况如表1。发送引物序列到上海生工生物公司进行合成。

 

表1　引物序列Table 1　Primers sequences

  

引物名称ITS2F ITS2R 16SF 16SR cox1F cox1R序列（5'-3'）CGAGACTTGGTGTGAATTGCA TCCCATACACCACATTTCCCG TTACGCTGTTATCCCTAGAG CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG TGTTACTGCTCACGCTTTCAT AAGTCTGGGTAATCTGAATAACGA

研究采用BI法构建的线粒体进化树与核糖体进化树是相似的，均形成二个大的分支，蒿草血蜱单独形成一小支，所有的嗜群血蜱均聚集在一起并高度支持。但两个树嗜群血蜱的位置有所不同。来自同一地区的样品不总是聚在一起，不存在明显的地理差异（图 1A、1B）。

测得的序列使用软件DNAStar和测序峰图进行分析拼接，得到25条序列。用Clustal X 1.83软件和DNAstar 5.0中的Align程序进行DNA同源序列排列，并人工核对校正，然后对序列进行分析。使用BI法，分别以ITS2序列，16S rDNA和cox1基因串联为标记基因，以草原革蜱为外群，将本研究中5个地点25条ITS2序列与同属的蒿草血蜱构建系统进化树，探讨不同地点虫体间的进化关系。

1.4　序列分析和进化树构建

环境影响评价会商平台主要利用互联网和云计算服务等其他先进的技术对不同级别的技术评估部门和环境管理部门进行评估和服务，环境影响评价会商平台能够提供更加标准化和系统化的评估方案和结果，在一定程度上提高了环境评估管理的能力；而环境影响评价智慧监测平台不但能够为不同级别的环评构建审批信息，还能够实现全国各个级别的环境评估审批信息相互交流；环境影响评价互联网服务平台已经为环评事业大大降低了数据处理时间和经费支出，还推进了群众对环评的公信力度。

2　结果

2.1　序列比较分析

根据规划，2011—2020年，湖南省水利建设市场主要分布在防洪、治涝、供水、灌溉、水力发电、水资源保护、水生态与环境治理和保护、水土保持、航运、水利血防、河道治理及岸线开发利用等11个领域。

 

表2　不同地点嗜群血蜱3个片段种内变异情况Table 2　Intraspecific variation of 3 fragments of the H.concinna sequence in different locations

  

地点SYSLD HNLHC HNXY BQSCH BLZCC ITS2/%0～0.1 0～0.1 0～0.2 0～0.1 0 16S rDNA/%0～0.4 0 0～0.8 0～1.2 0～1.5 cox1/%0～1.2 0.1～1.2 0～1.4 0～0.9 0.1～1.4

使用软件比对分析发现在5个不同地点的25条ITS2序列，16S rDNA基因，cox1基因分别有不同程度的碱基位点突变。ITS2序列上，有5个碱基突变位点，16S rDNA基因序列上，有6个碱基突变位点，cox1基因序列上，有16个碱基突变位点，具体情况如表3。研究表明不同个体的嗜群血蜱的基因之间存在一定的差异。

为了掌握家长参与家园共育的状况，笔者在济南市历城区范围内随机选择了180位幼儿家长作为调查对象。其中，个体工商户11人，占6.11%；公司职员37人，占 20.56%；工人 112人，占 62.22%；干部 8人，占4.44%；医生2人，占1.11%；从事其他职业的10人，占5.56%。本次调查发放问卷180份，回收有效问卷180份。调查数据统计与处理的结果显示，当前家长参与家园共育的情况不容乐观。笔者围绕家长对家园共育内涵的理解、参与家园共育的意愿、参与家园共育的身份和参与家园共育活动的形式等方面对家长参与家园共育的现状进行了梳理。

 

表3　嗜群血蜱ITS2序列、16S rDNA基因、cox1基因的碱基突变位点Table 3　Base mutation site of ITS2 sequence，16S rDNA gene，and cox1 gene of the H.concinna

  

虫体SYSLD-1 SYSLD-2 SYSLD-3 SYSLD-4 SYSLD-5 HNLHC-1 HNLHC-2 HNLHC-3 HNLHC-4 HNLHC-5 HNXY-1 HNXY-2 HNXY-3 HNXY-4 HNXY-5 BQSCH-1 BQSCH-2 BQSCH-3 BQSCH-4 BQSCH-5 BLZCC-1 BLZCC-2 BLZCC-3 BLZCC-4 BLZCC-5 93 A G A A G A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A 681 T T T T T C C T T C T T T C C T T C T T T T T T T碱基突变位点ITS2 95010071022-G--G-----------------------------------G---------G G G G G G G G G G C G G G G G G G G G G G G G G 4T T T T T T T T T T T T T T T T T A T T T T A T T 36 T T T T T T T T T T T T T T T T T A T T T T A T T 16S rDNA 148156 T T T T T T T T T T T T T T T T T T T A T T T T A T C T C C C C C C C C C C T T C C C C C C C C C C 159 C C C C C C C C C C C C T C C C C C C C C T C T C 215 C C C C C C C C C C C C C C C C G C G C C C C C C

 

续表3　嗜群血蜱ITS2序列、16S rDNA基因、cox1基因的碱基突变位点Continued table 3 Base mutation site of ITS2 sequence，16S rDNA gene，and cox1 gene of the H.concinna

  

虫体32122161167179245碱基突变位点cox1 353359389419449494497506681771 SYSLD-1 SYSLD-2 SYSLD-3 SYSLD-4 SYSLD-5 HNLHC-1 HNLHC-2 HNLHC-3 HNLHC-4 HNLHC-5 HNXY-1 HNXY-2 HNXY-3 HNXY-4 HNXY-5 BQSCH-1 BQSCH-2 BQSCH-3 BQSCH-4 BQSCH-5 BLZCC-1 BLZCC-2 BLZCC-3 BLZCC-4 BLZCC-5 T T C T T T T C T T T T T C C T T T T T T C C C T G G A G G A G G A A G G A A A A G G A G G A G A G A A A A C A C A A A C A A A A A A A A C A A A A C C C C C C C C C C C C C C T T C C C C C C C C C C A A A A A G A A G A A A G A A A A A A A A A A A A G G G G A G A G G G A A G G G G G G G A G G G G A A A A A A A G A A A A A A A A A A A A G A A A A A T T T T A T A T T T A A T T T T T T T A T T T T A C C C C T T T C C C T T C C C C C C C T C C C C T C C T C C C C T C C C C C T T C C C C C C T T T C C C C C C C C C C C T C C C C C C C C C C C C C T G G A G G G G G G G G G G A A G G G G G A G G G A G G A G G G G G G G G G G A A G G G G G G G A G G T T C T C C C C C C C T C C C C C C C C C C C C C G G A G A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A C C C C C C A C C C C C A C C A C C C C C C C C A

2.2　系统进化分析

PCR反应的总体系为30 μL，具体情况如下：Ex Taq Mix 15 μL，引物 0.6 μL，DNA 1 μL，然后加蒸馏水至30 μL。PCR反应条件：94℃ 预变性3 min，94℃变性30 s，退火温度30 s（ITS2～55 ℃、16S～53℃、cox1～52℃），72℃延伸 1 min，38个循环，最后 72℃延伸7 min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶进行电泳实验鉴定，凝胶使用溴化乙锭染色。将正确PCR产物送至北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。

25只嗜群血蜱的ITS2、16S rDNA、cox1的长度分别 1 130～1 330 bp、281～298 bp、805～842 bp。A+T含量分别是 37.93%～39.32%（ITS2）、76.85%～78.65%（16S rDNA）、68.65%～70.29%（cox1）。5个地点 ITS2序列的A+T含量分别是38.41%～38.81%（SYSLD）、37.98%～38.82%（HNLHC）、37.93%～39.32%（HNXY）、38.13%～39.21%（BQSCH）、39.10%～39.20%（BLZCC）；16S rDNA序列的A+T含量分别是77.74%～78.29%（SYSLD）、76.85%～78.17%（HNLHC）、77.08%～78.65%（HNXY）、77.51%～77.66%（BQSCH）、77.35%～77.93%（BLZCC）；cox1序列的 A+T含量分别是 68.65%～69.30%（SYSLD）、69.19%～69.83%（HNLHC）、68.92%～70.29%（HNXY）、69.26%～69.76%（BQSCH）、69.26%～69.79%（BLZCC）。这3个片段种内的变异率分别为0%～0.2%（ITS2）、0%～1.5%（16S rDNA）和 0%～1.6%（cox1）。在这5个地点中，同一个地点嗜群血蜱3个片段的种内变异情况如表2。

3　讨论

核糖体ITS序列选择压力小，受环境影响小，进化速度快，可以提供丰富的位点信息，常用来探讨种间遗传差异，已经广泛应用ITS2序列进行蜱类种间或种内的系统进化分析[1]。线粒体DNA的序列一般保守，变异迅速，已经广泛应用于近缘种的鉴定及遗传变异等相关研究，分子标记主要有线粒体16S rDNA基因和cox1基因，16S rDNA基因和cox1基因进化速度较慢，序列相对保守，存在很少的插入与缺失，含有较少的信息位点，均可以作为蜱种内或种间遗传变异的分子标记[2-3]。所以，研究选择16S rDNA和cox1基因来分析嗜群血蜱种内的进化分析。5个地点25只嗜群血蜱ITS2序列的长度为1 130～1 330 bp，与之前研究的长角血蜱和褐黄血蜱相似[4]，比网上的嗜群血蜱部分ITS2长，且明显要长于线虫的ITS2序列[6]。16S rDNA序列的长度为281～298 bp，cox1序列的长度为805～842 bp，略短于网上蜱的相应序列[7]，与线虫长度相似[6]。A+T含量分别是37.93%～39.32%（ITS2）、76.85%～78.65%（16S rDNA）、68.65%～70.29%（cox1），核糖体ITS2序列的A+T含量低于线虫的含量，线粒体的16S rDNA和cox1序列的A+T含量均高于G+C含量，这与之前蜱类的线粒体研究一致[7]，cox1的A+T含量与线虫的含量相似[6]。

两组患者均无心源性死亡和再发心肌梗死（0例），治疗组和对照组分别有5例、6例患者行靶血管重建。两组患者MACE比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

  

图1　A　基于核糖体ITS2序列构建的进化树Fig.1A　Phylogenetic relationships of the ticks reconstructed by BI methods based on the ITS2 sequences

  

图1　B　基于线粒体16S rDNA+cox1序列构建的进化树Fig.1B　Phylogenetic relationships of the ticks reconstructed by BI methods based on the 16S rDNA+cox1 sequences

在这3个片段中，不同地点的嗜群血蜱种内的变异率分别为 0～0.2%（ITS2）、0～1.5%（16S rDNA）和0～1.6%（cox1），ITS2种内的变异率与之前对长角血蜱的研究相一致[8]。ITS2最保守，突变率低且同源性高，适合用于种内间的鉴定。3个片段的种内变异率均小于2%，说明不同地区的嗜群血蜱存在种内差异，但差异率较小，这与其他学者对于寄生虫的研究结果一致[9]。ITS2序列上，有5个碱基突变位点，其中950和1 007位存在碱基缺失或添加，且这一现象仅在核糖体ITS2序列上出现，线粒体16S rDNA基因序列和cox1基因序列并没有碱基缺失或添加这一现象，线粒体16S rDNA基因碱基突变多为A-T，C-T，仅在215位为C-G，cox1基因碱基突变多为A-G，T-C，在161和771位为A-C，359位为A-T，之前的研究表明核苷酸变异主要在第三位密码子上，第一、二位密码子很少出现变异情况[6]，而研究中5个地点25只嗜群血蜱核苷酸变异分布在三位密码子上，并没有主次之分。

研究构建的进化树显示，同一地区的嗜群血蜱并不是总在同一个分支上，说明嗜群血蜱的ITS2序列、16S rDNA和cox1基因在地理位置方面没有明显的差异，这个结果与Duan（2016）对4个地区鼠蛲虫的研究结果相似[6]。但与Wang（2013）对来自甘肃、四川两地寄生于牦牛的矛形双腔吸虫研究不同，他研究发现所有的23个样品聚集在一起，具有高度的统计学支持[10]。分析，研究中的嗜群血蜱虽然来自于不同地点，但还仅限于黑龙江省，地理位置差异较小，因此变异较小；鼠蛲虫虽然来自于全国各地，地理位置变化较大，但中国的实验小鼠多来自一个共同的繁殖种群，因此差异也不大。因此，应该采集更多的不同地理位置的样品，最好是有国外的样品，使用更多的遗传基因标记，来研究他们的遗传多态性将更有意义。

参考文献：

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