淋巴滞留性脑病大鼠血管周围间隙扩张的研究

中枢神经系统(CNS）虽然缺乏衬有内皮细胞的淋巴管，但是有淋巴引流，所以淋巴引流进行阻断途径是研究脑淋巴系统功能的重要手段[1-2]。以往的研究发现，注入大脑实质的示踪剂可以经颈部淋巴系统对大脑蛛网膜下腔的放射性物质进行系统引流，由此证实了在调整颅内压和维持脑组织内环境稳定方面，脑淋巴引流均具有极为重要的作用[3]。在该途径受阻的情况下，可导致脑组织血浆蛋白等主流，进而使得脑形态结构和功能等发生改变，发生脑水肿，进而形成淋巴滞留性脑病(LE)[4]。对于头颈淋巴引流障碍引发的脑水肿，无论是原发性还是继发性，均可能发生LE，其临床主要表现为精力不集中、自主活动减少、表情淡漠、记忆力减退等症状，并伴有头晕、恶心、眩晕、呕吐等症状，影响较大。

本研究通过对大鼠双侧淋巴结进行结扎和摘除，并制备LE大鼠模型，通过对脑组织冰冻切片实施H-E染色，在光学显微镜下可较为清晰地观察到大鼠的脑组织病理改变，从而对大鼠脑淋巴液的迁移路径以及与全脑淋巴滞留后颅内血管周围间隙（VRS）的关系进行深入研究，探讨LE与VRS的关系，为临床提供病理机制。

1　材料和方法

1.1　实验动物

于广州中医药大学实验动物中心选择40只健康SD雄性大鼠，平均体重（250±10）g，所有大鼠均能自由饮水和进食，均保持常规实验室温度。将这40只大鼠随机分为四组，分别为24h对照组和模型组，48h对照组和模型组。

取得综合所得，需要办理汇算清缴的情形包括：一）从两处以上取得综合所得，且综合所得年收入额减除专项扣除的余额超过6万元；（二）取得劳务报酬所得、稿酬所得、特许权使用费所得中一项或者多项所得，且综合所得年收入额减除专项扣除的余额超过6万元；（三）纳税年度内预缴税额低于应纳税额；（四）纳税人申请退税。

In PC patients who have not received chemotherapeutical agents, transitory painkillers and not a definitive pain management approach will be a logical option, while waiting for the response to the treatment.

1.2　实验材料

本研究主要使用的实验材料包括体视显微镜、照相显微镜、江湾I型C立体定向仪、冰冻切片机、24 G静脉留置针、牙科钻、眼科镊、手术剪、丝线、10%水合氯醛、Mias 2000图像分析系统、1套手术器械、4%多聚甲醛。

1.3　全脑淋巴滞留模型的制备

在术后48h，模型组大鼠可见明显行为改变，包括对声音刺激敏感、躁动、易激惹，在颈部切口无明显红肿、渗出和感染等情况，在大鼠处死取脑后，肉碱可见脑膜紧张、脑沟变浅、脑表面饱满和脑回变宽等情况。

1.4　判断造模成功的标准

大鼠淋巴滞留性脑病采用阻断颈部淋巴引流法制备，应用10%水合氯醛对其实施腹腔麻醉，在无菌状态在，沿颈部正中切开，并将皮肤、皮下组织和肌层等进行逐层切开，分离气管和甲状软骨两侧肌层。将两侧颈深淋巴结进行分离后，输入管和输出管分别沿淋巴结上下缘进行结扎，完成上述处理后，摘除淋巴结，操作过程中应避免损伤颈部血管和神经，并对切口进行逐层缝合。对照组仅分离和暴露淋巴结，不结扎淋巴管，淋巴结未摘除，其他步骤与脑淋巴引流阻断组相同。

评价指标采用平均误差(Average Error，AE)，均方根误差(Root Mean Squared Error，RMSE)两项指标[15]对几种预测方法进行精度判别，两种计算方法如下：

通过对模型组大鼠使用显微镜进行观察，可见大鼠存在较典型的脑水肿征象，如果大鼠的颈部切口有明显肿胀或渗出，则表明颈淋巴未完全阻断，依然存在淋巴液渗出的情况，意味着手术操作不成功。本研究通过对颈部淋巴管进行结扎和摘取，可造成脑内大分子物质和液体引流阻断，从而导致全脑淋巴滞留性脑病，通过成功构建全脑淋巴滞留性脑部模型，可出现全脑淋巴引流障碍，且研究结果证实，阻断大鼠颈部淋巴引流后，可见明显脑水肿和行为学改变等变化，肉眼可见大鼠脑膜肿胀和粗糙等症状（见图1）。

1.5　标本制作及病理观察

通过对24h模型组大鼠的脑组织进行切片和H-E染色，可见VRS扩张明显，表现为椭圆形或圆形，主要环绕于血管周围，内含组织淋巴液，具有透明腔隙（见图2）。

1.6　统计学处理

在显微镜视野下，选择10个不同视野，拍取10个层面的切片，应用图像分析系统对图像进行处理，计数扩张的VRS和VRS截面积，取平均值，应用SPSS13.0软件进行统计学处理，对两组间扩张的VRS数目和截面积进行比较，行单因素方差和方差齐性检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

24h模型组脑组织可见VRS扩张，内含透明液体，VRS环绕血管，有丝状物附着，且周围脑组织染色平淡，可见组织疏松水肿（见图3）。

2　结果

2.1　病理学观察结果

2.1.1　模型组脑组织观察

采用SPSS 17.0软件对数据进行分析处理，计量资料以（均数±标准差）表示，采用t检验；计数资料以（n，%）表示，采用χ2检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

  

图1　造模后大鼠脑组织 表面不光滑，肿胀充血

2.1.2　模型组大鼠的VRS病理学表现

对照组、模型组分别在24h、48h实施腹腔麻醉，应用10%水合氯醛进行腹腔麻醉，并使用4%多聚甲醛固定并将大鼠处死，取出脑组织对其实施速冻切片后进行H-E染色，使用光镜进行观察和处理。

  

图2　24h模型组大鼠脑组织内VRS扩张

2.2.1　大鼠脑组织内扩张VRS数对比

（43）钝叶护蒴苔 Calypogeia neesiana（C.Massal.etc） K.Muller. 余夏君等（2018）

  

图3　48h模型组大鼠脑组织内VRS扩张

2.2　统计学结果

2.1.3　模型组大鼠VRS病理学表现

经析因分析法发现，对照组的扩张VRS数目为（1.95±1.10）个，模型组为（10.65±4.10）个，差异有统计学意义，各时间之间差异不明显（见表1、图4）。

 

表1　扩张的VRS数目的均数及标准差

  

分组对照组模型组合计t/F值P值时间24h　48h 1.90±0.99 10.10±3.51 6.00±4.90 7.107 0.000 2.00±1.25 11.20±4.73 6.60±5.80 5.944 0.000合计1.95±1.10 10.65±4.10 6.30±5.31 81.242 0.000 t/F值0.198 0.590 0.386(F=0.268,P=0.608)P值0.845 0.562 0.538

  

图4　各组大鼠扩张VRS数比较

2.2.2　大鼠脑组织内VRS截面积对比

通过对各组大鼠的VRS截面积应用析因分析法，结果发现，对照组与模型组各时间段的VRS截面积比较，差异具有统计学意义。对照组的VRS截面积为（6.17±2.49）μm2，模型组的VRS截面积为（0.39±0.28）μm2，具有显著性差异（F=107.019，P=0.000）。不同时间之间无显著差异性（F=0.850，P=0.363）（见表2、图5）。

 

表2　大鼠脑组织内VRS截面积的均数及标准差(析因分析)

  

分组对照组模型组合计t/F值P值时间24h　48h 0.31±0.26 5.58±2.65 2.95±3.27 6.251 0.000 0.47±0.30 6.76±2.30 3.61±3.60 8.572 0.000合计0.39±0.28 6.17±2.49 3.28±3.41 107.019 0.000 t/F值1.234 1.065 1.429(F=0.850,P=0.363)P值0.233 0.301 0.240

  

图5　各组大鼠脑组织内扩张的VRS截面积之间比较

3　讨论

脑淋巴液回流受阻或生成增多，可导致淋巴滞留性脑病，从而引发脑功能障碍。有研究报道，各种原因造成的脑淋巴液回流受阻，均有可能引发LE[2]。有资料显示，经血管周围淋巴管前引流系统、经神经周围淋巴管途径是脑内两条主要的淋巴回流通道[3]。可利用这两条途径引流到颅外淋巴系统，能够起到非常重要的维持脑正常生理功能作用，在两种途径被阻断的情况下，可导致淋巴滞留性脑病。有资料显示，阻断脑淋巴引流后，脑组织可出现明显水肿，并发颅内压升高，从而导致脑疝。通常情况下，在大鼠全脑不同部位均可见VRS扩张，且有大量蛋白质存在[4-5]。如果脑内的淋巴液病理性生成增多，可导致明显脑组织肿胀和脑功能障碍，从而引发淋巴滞留性脑病。

将大鼠双侧颈淋巴结进行结扎和摘除，构建的淋巴滞留性脑病模型较稳定，且该方法成功率高、操作简便，能够为理论研究提供重要依据。就目前来看，通过外科手术方法对动物颈部淋巴管进行结扎并摘除淋巴结，可阻断淋巴结引流，且与其他方法相比，该手术方法操作更为简单，能够比较完全的阻断脑淋巴途径，容易控制实验条件，具有较好重复性，且成功率高，动物死亡率低，比较符合临床LE病理过程。国内外研究结论和实验室结果均表明，在阻断动物脑淋巴引流后，可导致脑组织形态结构和脑组织功能变化，形态方面的变化主要表现在脑组织结构疏松，脑体积和脑室扩大，从而引发脑水肿现象。水肿通常以脑间质为主，部分可见神经元、胶质细胞等细胞肿胀、变性和死亡等情况。据有关研究显示[6]，在凋亡机制的参与下，实验性LE可造成海马锥体细胞死亡。阻断全脑淋巴引流后，会阻断淋巴液通过VRS引流的途径，使得脑组织出现淋巴滞留性脑水肿，且该情况的发生会增加血脑屏障通透性，损害神经细胞和血管源性脑水肿，导致脑组织损伤更加严重[7-8]。

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后脑淋巴回流受阻，导致脑组织内大量VRS扩张。本研究通过对双侧颈深浅淋巴结进行结扎和摘除，构建全脑淋巴滞留模型，从而导致脑淋巴液回流受阻，在全脑组织中出现大量VRS扩张的情况。

我们的研究结果显示，24h模型组通过实施脑组织H-E染色，对脑组织皮层、基底节区等部位使用普通光显微镜进行观察，结果显示这些部位均可见大量VRS扩张，横断截面可见椭圆形或圆形环状扩张，VRS在血管纵轴上表现为血管周围长腔，腔内可见透明组织液，部分可见VSR内大量组织细胞聚集。扩张的VRS数目及截面积显著高于对照组（P=0.000），模型组之间无显著差异（P=0.091）。可见，全脑淋巴回流受阻是VRS扩张机制之一。VRS可能是脑淋巴循环阻滞的潜在指标。

参考文献

[1]Raper D,Louveau A,Kipnis J.How Do Meningeal Lymphatic Vessels Drain the CNS?[J].Trends in Neurosciences,2016,39(9)：581.

[2]Louveau A,Smirnov I,Keyes T J,et al.Structural and functional features of central nervous system lymphatics[J].Nature,2015,523(7560)：337.

[3]赵越,李昀倩,李怀业,等.荧光及磁示踪法观测脑组织液的引流分区特征[J].北京大学学报(医学版)医学版,2017,49(2)：303-309.

[4]程龙凤,潘燕,刘尚明,等.脑淋巴液滞留对大鼠前额叶皮质区诱导型一氧化氮合成酶表达量的影响及羟基红花黄素A对神经元的保护作用[J].山东大学学报(医学版),2014,52(6)：7-11.

[5]贾春锋,戴庆辰,乐立盛.EAE大鼠模型的构建及外周血淋巴细胞中多种炎症因子表达的意义[J].福建医药杂志,2017,39(3)：77-80.

[6]王爱,潘立君,于秀石,等.自发性高血压大鼠外周血淋巴细胞连接蛋白43与炎性因子表达水平的相关性研究[J].中国全科医学,2017,20(2)：177-181.

[7]Nuñez S,Moore C,Gao B,et al.The human thymus perivascular space is a functional niche for viral-specific plasma cells.[J].Sci Immunol,2016,1(6)：eaah4447.

[8]Thrane A S,Rangroo T V,Nedergaard M.Drowning stars：reassessing the role of astrocytes in brain edema[J].Trends in Neurosciences,2014,37(11)：620.