冻融周期中不同发育天数单囊胚移植的临床结局比较

欧洲人类生殖与胚胎学会（ESHRE）认为多胎妊娠是辅助生殖技术的一种并发症，而不是理想的助孕结果[1]。研究表明，多胎妊娠孕妇剖宫产率、妊娠期并发症发生率、低出生体质量儿率和早产率显著高于单胎妊娠[2]。而多胎妊娠主要来源于双囊胚移植，其多胎妊娠率可高达50%[3]。一项回顾性研究分析了277 042个冻融单囊胚移植周期，结果表明单囊胚移植显著降低了早产儿、低出生体质量儿以及小于胎龄儿等并发症的发生率[4]。因此，单囊胚移植是目前减少多胎妊娠的有效方法。本研究回顾性分析了2008年1月—2015年12月在成都市锦江区妇幼保健院（我院）行冻融单囊胚移植1 675个周期的临床资料，旨在探讨根据囊胚发育天数及囊胚评分行单囊胚移植对妊娠结局的影响。

1.4 统计学相关概念[7] 准确度=(a+d)/(a+b+c+d)×100%，灵敏度=a/(a+c)×100%，特异度=d/(a+c)×100%，假阳性率=b/(b+d)×100%，假阴性率=c/(a+c)×100%，其中a为真阳性例数，b为假阳性例数，c为假阴性例数，d为真阴性例数。

1 对象与方法

1.1 研究对象 自2007年我院囊胚冻融采用玻璃化冷冻法（KITAZATO，日本）。本研究选取2008年1月—2015年12月在我院接受冻融后单囊胚移植（single frozen-thawed blastocyst transfer，SFBT）的1 675个周期。所有冷冻囊胚均为D5或D6的扩张期囊胚。根据移植囊胚评分及发育天数分为6组：D5BB级及以上，D5BC/CB级，D5CC级，D6BB级及以上，D6BC/CB级，D6CC级。

1.2 方法

1.2.1 促排卵方案 患者年龄20～44岁，月经第2～3 d检测基础性激素水平，卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）＜10 IU/L，B型超声（B超）监测窦卵泡数（antral follicle count，AFC）≥5个，促排卵方案采用短效长方案。所有患者均于前一个月经周期第3～5 d口服避孕药（达英-35，德国拜耳公司）17 d或排卵后1周皮下注射促性腺激素释放激素激动剂[GnRHa，达菲林，益普生（天津）制药有限公司]0.01 mg或0.05 mg，共14～16 d。降调节达标后启动促排卵，当至少3个优势卵泡直径≥18 mm时注射人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG，丽珠集团丽珠制药厂）10 000 IU或艾泽（默克雪兰诺有限公司）250 μg，36 h后行B超介导下经阴道穿刺取卵术。

4)模型预测结果与实验得到的侵彻深度、侵彻模式、残余质量和时程曲线等数据吻合得较好，验证了本文理论模型的准确性。

由上可知，韩国以堪舆为主题的汉文小说，往往与“报恩”有着千丝万缕的关系，无论是地师为报他人恩德为其占地，还是婢女奚得吉地后报地师或主家的恩德，都体现了古代朝鲜人民对个人品德操守的看重以及对滴水之恩涌泉相报的价值理念。

2.2 6组妊娠结局比较 6组临床妊娠率、晚期流产率及活产率差异有统计学意义（均P＜0.05）。在发育天数相同的情况下，囊胚评分越高，临床妊娠率和活产率呈上升趋势。见表2。

2.3 组间妊娠结局比较 对差异有统计学意义的临床妊娠率、晚期流产率及活产率进行组间两两比较，结果显示，D5囊胚中，D5BC/CB级及以上的临床妊娠率和活产率高于D5CC级，差异有统计学意义（P＜0.05）；D6囊胚中，D6BB级及以上的临床妊娠率高于D6CC级，差异有统计学意义（P＜0.05）；D5BC/CB级及以上的临床妊娠率和活产率高于D6BC/CB级和D6CC级，差异有统计学意义（P＜0.05）；其他各组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

1.4 统计学方法 采用SAS 9.3软件进行统计学分析。定量资料用均数±标准差（s）表示，组间比较采用单因素方差分析；定性资料用率（%）表示，组间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

由于囊胚比卵裂期胚胎更加符合妊娠生理，因此妊娠结局更好[6]。而且，临床医生更愿意接受单囊胚移植来减少多胎妊娠的发生。传统的慢速程序化冷冻难以避免对囊胚造成损伤，使其复苏成活率不稳定，而玻璃化冷冻技术在卵母细胞和囊胚的冷冻保存中具有显著的优势[7-8]。黄映琴等[9]对高反应患者新鲜周期与冷冻周期单囊胚移植的妊娠结局进行比较，发现冷冻周期的临床妊娠率、种植率和活产率均较新鲜周期高。随着玻璃化冷冻技术的发展，囊胚冻融存活率显著提高，冻融囊胚移植可获得比新鲜囊胚移植更高的种植率和临床妊娠率[10-11]。因此本研究针对冻融周期单囊胚移植进行分析，对于取卵周期不适合移植的患者，可以考虑选择性单囊胚冷冻及复苏移植。

1.2.3 内膜准备及黄体支持 内膜准备有2种方案，自然周期和激素替代周期。自然周期于排卵后第5天，子宫内膜厚度≥8 mm时移植；激素替代周期于月经第3天口服补佳乐（德国拜耳公司）或芬吗通红片（雅培制药），递增方案，内膜≥8 mm时行黄体转化5 d移植，移植后给予黄体支持。D5与D6囊胚黄体转换时间与黄体支持相同，黄体支持维持至妊娠77d。1.2.4 囊胚分级 囊胚分级标准按Gardner标准执行[5]。冷冻标准：囊胚腔形成在3至6期，内细胞团及滋养外胚层评分均在C级及以上。优质囊胚标准：囊胚腔形成在3至6期，内细胞团及滋养外胚层评分至少有一项评分为B级及以上。

1.3 观察指标 移植后14 d血清hCG阳性提示生化妊娠，移植后28 d超声见妊娠囊为临床妊娠。临床妊娠率（%）=临床妊娠周期数/移植周期数×100%；单胎妊娠率（%）=单胎妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；双胎妊娠率（%）=双胎妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；异位妊娠率（%）=异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%；早期流产率（%）=早期流产周期数/临床妊娠周期数×100%；晚期流产率（%）=晚期流产周期数/临床妊娠周期数×100%；早产率（%）=早产周期数/临床妊娠周期数×100%；足月产率（%）=足月产周期数/临床妊娠周期数×100%；活产率（%）=活产周期数/移植周期数×100%；低出生体质量儿率（%）=低出生体质量儿数量/新生儿数量×100%。

1.2.2 囊胚冻融 采用玻璃化冷冻法（KITAZATO，日本）。囊胚冷冻：先对囊胚行辅助孵化，囊胚充分皱缩后，室温下移至平衡液，停留10 min，再转入玻璃化冷冻液，反复冲洗数次，以连续点滴的方式将囊胚放置在Cryotop的前端。迅速浸入液氮，套上盖子，最后投入液氮中保存。囊胚解冻：将囊胚迅速从液氮中浸入到事先预热至37℃的解冻液中，1 min后转移至平衡液中，停留3 min后，转移至冲洗液1，停留5 min后，转移至冲洗液2，反复冲洗数次，37℃停留5 min，移入囊胚培养液中培养至移植。

 

表1 6组患者一般情况比较

  

注：年龄、体质量指数和内膜厚度用x±s表示；激素替代周期和自然周期用n（%）表示。

 

组别 周期数 年龄（岁） 体质量指数（kg/m2） 内膜厚度（cm） 内膜准备方法激素替代周期 自然周期D5BB级及以上 152 31.79±4.32 21.84±3.16 0.97±0.19 97（63.82） 55（36.18）D5BC/CB级 283 31.75±4.54 21.42±2.89 0.95±0.17 171（60.42） 112（39.58）D5CC级 312 32.29±4.34 21.63±2.72 0.96±0.18 197（63.14） 115（36.86）D6BB级及以上 81 31.86±3.72 21.38±2.91 0.94±0.19 54（66.67） 27（33.33）D6BC/CB级 245 31.46±4.26 21.28±3.38 0.96±0.16 162（65.98） 83（34.02）D6CC级 602 32.10±4.44 21.67±2.77 0.97±0.18 390（64.78） 212（35.22）F或χ2 1.30 1.13 0.72 2.493 P 0.262 0.342 0.608 0.778

 

表2 6组患者妊娠结局比较 [%（n/n）]

  

注：*Fisher确切概率法。

 

分组 周期数 临床妊娠率 单胎妊娠率 双胎妊娠率 异位妊娠率 早期流产率D5BB级及以上 152 61.18（93/152） 94.62（88/93） 3.23（3/93） 2.15（2/93） 11.83（11/93）D5BC/CB级 283 55.83（158/283） 94.94（150/158） 3.80（6/158） 1.27（2/158） 13.29（21/158）D5CC级 312 44.50（139/312） 93.52（130/139） 5.03（7/139） 1.44（2/139） 17.99（25/139）D6BB级及以上 81 51.85（42/81） 95.24（40/42） 4.76（2/42） 0.00（0/42） 23.81（10/42）D6BC/CB级 245 40.00（98/245） 95.92（94/98） 0.00（0/98） 4.08（4/98） 18.37（18/98）D6CC级 602 39.04（235/602） 97.02（228/235） 2.55（6/235） 0.43（1/235） 23.4（55/235）χ2 41.774 - - - 10.214 P＜0.000 1 0.672* 0.213* 0.185* 0.069分组 周期数 晚期流产率 早产率 足月产率 活产率 低出生体质量儿率D5BB级及以上 152 2.15（2/93） 9.68（9/93） 59.14（55/93） 42.11（64/152） 8.70（6/69）D5BC/CB级 283 1.90（3/158） 13.92（22/158） 60.13（95/158） 41.34（117/283） 6.45（8/124）D5CC级 312 6.47（9/139） 5.76（8/139） 63.31（88/139） 30.77（96/312） 2.91（3/103）D6BB级及以上 81 2.38（1/42） 7.14（3/42） 57.14（24/42） 33.33（27/81） 5.56（1/18）D6BC/CB级 245 3.06（3/98） 11.22（11/98） 60.20（59/98） 28.57（70/245） 8.33（6/72）D6CC级 602 0.85（2/235） 8.09（19/235） 62.13（146/235） 27.41（165/602） 7.51（13/173）χ2 - 7.077 0.912 25.823 -P 0.047* 0.215 0.969 ＜0.000 1 0.557*

 

表3 6组患者临床妊娠率、晚期流产率和活产率组间两两比较

  

注：*Fisher确切概率法。

 

组别 临床妊娠率 晚期流产率 活产率χ2 P χ2 P χ2 P D5BB级及以上vs.D5BC/CB级 1.161 3 0.281 2 - 1.000 0* 0.023 7 0.877 7 D5BB级及以上vs.D5CC级 11.310 4 0.000 8 - 0.207 0* 5.813 6 0.015 9 D5BB级及以上vs.D6BB级及以上 1.888 5 0.169 4 - 1.000 0* 1.708 2 0.191 2 D5BB级及以上vs.D6BC/CB级 16.862 6 ＜0.000 1 - 1.000 0* 7.683 9 0.005 6 D5BB级及以上vs.D6CC级 24.220 5 ＜0.000 1 - 0.319 0* 12.395 2 0.000 4 D5BC/CB级vs.D5CC级 7.551 5 0.006 0 3.993 8 0.045 7 7.218 6 0.007 2 D5BC/CB级vs.D6BB级及以上 0.402 7 0.525 7 - 1.000 0* 1.689 6 0.193 7 D5BC/CB级vs.D6BC/CB级 13.175 3 0.000 3 - 0.677 7* 9.364 0 0.002 2 D5BC/CB级vs.D6CC级 21.992 2 ＜0.000 1 - 0.395 2* 17.215 5 ＜0.000 1 D5CC级vs.D6BB级及以上 1.379 5 0.240 2 - 0.457 2* 0.196 6 0.657 5 D5CC级 vs.D6BC/CB级 1.162 9 0.280 9 - 0.368 2* 0.316 9 0.573 5 D5CC级 vs.D6CC级 2.585 1 0.107 9 - 0.002 9* 1.137 6 0.286 2 D6BB级及以上vs.D6BC/CB级 3.489 8 0.061 7 - 1.000 0* 0.660 4 0.416 4 D6BB级及以上vs.D6CC级 4.8636 0.027 4 - 0.390 6* 1.240 1 0.265 5 D6BC/CB级vs.D6CC级 0.0677 0.794 6 - 0.154 0* 0.117 4 0.731 8

3 讨论

2.1 6组一般情况比较 6组年龄、体质量指数、移植日内膜厚度和内膜准备方法差异均无统计学意义（P＞0.05），见表1。

目前囊胚评价方法包括形态学、代谢组学和基因组学评价方法，临床常用的是Gardner等[5]提出的囊胚标准形态学评分方法。有研究显示，选择性移植评分在BB级及以上的单囊胚可明显降低双胎妊娠率，并有效维持总体妊娠率[12]。研究表明，囊胚的内细胞团及滋养外胚层的优劣与流产率及持续妊娠率相关，形态学差的囊胚，染色体异常的发生率高，而染色体异常是流产的主要因素，因此从形态学筛选优质囊胚进行移植，从一定程度上淘汰了部分染色体异常胚胎，从而减少流产率，提高活产率[13-14]。汪彩珠等[15]研究显示在SFBT周期中，随着囊胚质量的下降，其临床妊娠率和活胎分娩率也显著下降，而流产率则呈显著上升趋势。本研究中，胚胎发育速度正常囊胚（D5囊胚）优质囊胚（BC/CB级及以上）的临床妊娠率及活产率高于非优质囊胚（CC级）。但在胚胎发育速度慢的囊胚（D6囊胚）中，仅D6BB级临床妊娠率较D6CC级高，其他各组间差异均无统计学意义。表明在D5囊胚中可通过囊胚评分筛选优质囊胚进行单囊胚移植，可提高妊娠率和活产率。

移植D5囊胚和D6囊胚的妊娠结局，目前研究报道结果不一。李城等[16]回顾性分析922例SFBT，结果显示D5囊胚组临床妊娠率显著高于D6囊胚组。El-Toukhy等[17]的研究表明，D5与D6优质囊胚相比，临床妊娠率、活产率及早期流产率差异无统计学意义。Yang等[18]研究发现D5囊胚临床妊娠率和着床率高于D6囊胚，但D5优质囊胚和D6优质囊胚临床妊娠率及着床率差异无统计学意义；通过胚胎植入前遗传学筛查（preimplantation genetic screening，PGS）检测后正常的D5囊胚和D6囊胚临床妊娠率差异无统计学意义。陈清汾等[19]研究表明冻融周期非优质单囊胚移植中，D5组非优质囊胚临床妊娠率高于D6组，优先考虑滋养外胚层评分高的D5囊胚，可提高妊娠率，降低早期流产率。本研究显示D5囊胚与D6BB级及以上囊胚妊娠率和活产率差异无统计学意义，D5优质囊胚临床妊娠率和活产率较D6BC/CB级和D6CC级高；D5CC级囊胚与D6囊胚临床妊娠率和活产率差异无统计学意义，但D6BB级及以上囊胚妊娠率和活产率比D5CC级有增高趋势。表明囊胚发育速度也是筛选囊胚的重要指标之一，因此需结合胚胎发育的速度和囊胚形态来综合评判囊胚的质量。

辅助生殖技术助孕的最终目标是使不孕夫妇成功获得健康后代，而多胎妊娠目前被认为是辅助生殖技术的一项并发症，单囊胚移植是目前公认的减少多胎妊娠的有效办法。目前国内大多数生殖中心未开展PGS技术，在选择性单囊胚移植中，多数中心仍使用形态学评分来筛选囊胚。本研究结果显示，卵巢功能正常、子宫内膜正常的患者首选D5优质囊胚冷冻及复苏移植，其次可选择D6BB级及以上囊胚，可获得较为理想的妊娠结局。

在政论语体中，修辞主体以摆事实讲道理、论辩说理为主要内容，这就需要有较为缜密的逻辑思维，注重修辞语义表达的逻辑严密性。在修辞话语的内里，讲究修辞语义的承转起合，论证推导周密严谨，语句间关系畅通，上下连贯，语义贯通。例如：

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