6种石斛的水溶性多糖和碱溶性多糖的含量测定与分析

石斛属于多糖类成分较多的植物，且多年来一直以多糖作为石斛的重要有效成分之一。传统认为石斛“质重、嚼之黏牙、味甘，无渣者为优”，现实经验也表明石斛鲜品或枫斗热水泡开2 h以上或重复煎煮仍具有一定的黏性。现代对于铁皮石斛、金钗石斛和霍山石斛的水溶性多糖质量分数和结构的研究较多[1]，而对其他石斛的水溶性多糖的研究较少，但已有文献报道贵州兴义4种石斛(束花、金钗、流苏、美花石斛)中多糖质量分数最高的为束花石斛，约22.70%[2]。在最优提取条件下测得霍山产铜皮石斛(又叫细茎石斛)多糖质量分数为25.24%;铜皮石斛多糖具有显著的卤虫毒活性[3]。齿瓣石斛在不同采收期以及不同海拔地区种植，其内多糖质量分数变化较大，成熟鲜条随着采收时间的延长，其多糖质量分数整体呈下降的趋势；海拔越高齿瓣石斛所含多糖质量分数越高[4]。

此外，现代对石斛碱溶性多糖的研究甚少，《中国药典》对石斛碱溶性多糖也无规定。然而，已有研究发现石斛碱溶性多糖具有一定的生物活性[5-7]。

本文采用HPLC内标法研究铁皮石斛与细茎石斛、齿瓣石斛、兜唇石斛、玫瑰石斛、束花石斛的水溶性多糖和碱溶性多糖的质量分数和单糖组成差异，为石斛多糖的研究利用与产品开发提供依据。

从图3(a)、(b)可以看出ADRC和PID系统在6s已经稳定，在6s时给系统加入阶跃干扰，仿真结果如图4(c)、(d)所示：(c)是对摆杆角度的抗扰控制曲线，可以看出改进型ADRC在0.2s就对阶跃干扰作出响应，调节时间只需要1.35s；(d)是双闭环PID的抗扰曲线，对误差的响应时间为0.6s，调节时间则需要3.65s；从(c)、(d)中还可以看出改进型ADRC加入干扰调整稳定后对摆杆角度和小车位置都能达到目标位置，而双闭环PID系统小车位置稳定后存在+0.015m的误差，不能精确回到目标位置。改进型ADRC比双闭环PID对一级直线倒立摆的控制有更好的抗干扰能力。

1 仪器与试药

LC-20AT(DAD)型高效液相色谱仪(日本岛津)；DHG-9245A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司)；CP225D型分析天平(德国Sartorius公司)；HC-3018高效离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；HWS24型电热恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；TYXH-1漩涡混合器(上海乔跃电子有限公司)。

取L-岩藻糖适量，精密称定，加水制成每1 mL约含12.5 mg的溶液，作为内标溶液。

可见，铁皮石斛、细茎石斛和齿瓣石斛的水溶性多糖的单糖组成均只有D-甘露糖和D-葡萄糖；各石斛的碱溶性多糖的质量分数均较高，特别是铁皮石斛和齿瓣石斛，质量分数均>15%。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

分别精密吸取各浓度D-甘露糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸对照品溶液各1 mL，分别置于10 mL量瓶中，精密加入L-岩藻糖内标溶液(12.500 mg/mL)0.1 mL，加水稀释刻度，即得系列混合对照品溶液。

 

表1 6个品种石斛的来源信息Table 1 The origins and batches of six species of Dendrobium

  

品种产地批号品种产地批号铁皮石斛广东丹霞31211细茎石斛安徽霍山40115浙江温州40405安徽大别山40122福建连城40503安徽霍山40114齿瓣石斛云南龙陵40506兜唇石斛广东30316云南高山40516广西百色40821云南文山40515云南昆明30721玫瑰石斛广东30519束花石斛广东30316广东30316广东30511云南昆明30721云南昆明30721

2.2 内标溶液的制备

无水乙醇、三氯甲烷(天津致远化学试剂有限公司)；甲醇(广州光华科技股份公司)；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP，批号A1216009，阿拉丁试剂上海有限公司)；乙酸铵(天津大茂化学试剂厂)；乙腈(色谱纯，德国Merk公司)；水为纯化水；其他试剂均为分析纯。

2.3 混合对照品溶液的制备

他只好尽力摆出极其威风的样子，握紧猎刀，狠命地盯着那头熊。它笨拙地向前挪了两步，站直了，发出试探性的咆哮。

金小丽等[8]研究发现，开花可显著消耗铁皮石斛药材中的多糖及多糖中甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖的量，而开花过程可能有利于木糖、阿拉伯糖累积。本文结果显示，6种石斛的水溶性多糖和碱溶性多糖的单糖组成成分或各单糖质量分数均有不同，表明2种多糖的结构、类型或连接糖的多少等存在差异，可能与生长环境、生长年限、是否开花、是否仿野生等有关。由于样品数量的限制和购买时难以确定是否开花和生长年限等原因，有待更全面地完善多种石斛的多糖特征图谱。

2.4 供试品溶液的制备

2.4.1 水溶性多糖供试品溶液的制备 取石斛粉末0.5 g，精密称定，80%(体积分数，下同)乙醇超声(功率为150 W)处理1 h，取出，滤过，重复多次乙醇超声至溶液基本无色，烘干。加蒸馏水100 mL，再精密加入内标溶液2 mL，煎煮1 h并经常搅拌，取出，趁热抽滤，残渣及滤瓶用热水洗涤4次，每次10 mL，重复用水煎数次，合并滤液与洗液浓缩并定容至50 mL。加4倍无水乙醇沉淀(慢加快搅)，置4 ℃冰箱中放置过夜，取出，离心(5 000 r/min)10 min，弃去上清液，沉淀分别加80%乙醇、无水乙醇洗涤2次，每次10 mL，离心(5 000 r/min)10 min，弃去上清液，沉淀加热水溶解，转移至25或50 mL容量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀。吸取上清液1 mL，置安瓿瓶中，加3.0 mol/L的HCl溶液0.5 mL，封口，混匀，110 ℃水解1 h，放冷，用3.0 mol/L的NaOH溶液调节pH值至中性，吸取400 μL，加0.5 mo1/L的PMP甲醇溶液250 μL与0.3 mol/L的NaOH溶液400 μL，混匀，70 ℃水浴反应100 min。再加0.3 mol/L的HCl溶液450 μL，混匀，用三氯甲烷洗涤3次，每次2 mL，弃去三氯甲烷液，水层即为水溶性多糖供试品溶液。

2.4.2 碱溶性多糖供试品溶液的制备 取“2.4.1”项下水提后的滤渣，加入0.5 mol/L的NaOH溶液100 mL和内标溶液2 mL冷浸过夜，翌日90 ℃热回流提取1 h，滤过，重复NaOH热回流提取1次，合并滤液，HCl中和，浓缩并定容至25 mL。醇沉、水解、衍生与“2.4.1”项同，水层即为碱溶性多糖供试品溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 线性关系考察 精密称取D-甘露糖对照品30 mg、D-葡萄糖对照品30 mg、D-木糖对照品10 mg、D-半乳糖对照品10 mg、D-半乳糖醛酸对照品10 mg，分别置于10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，制成各单糖对照品溶液。另分别配置3.00、2.25、1.50、0.75、0.15、0.75、0.5、0.25、0.10 mg/mL的单糖系列对照品液。

色谱柱：以Kromasil100-5C18(250 mm×4.6 mm)；流动相：0.02 mol/L乙酸铵溶液(冰乙酸调pH=6.7)(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～18 min，83.2%A；18～20 min，83.2%～75%A；20～30 min，75%～70%A；30～45 min，70% A)；检测波长：250 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；流速：1 mL/min。

精密吸取上述混合对照品溶液按“2.3”项下自“吸取400 μL”起，依法操作，取上清液10 μL，注入液相色谱仪。以各单糖的峰面积与L-岩藻糖内标峰面积比值(Ag/As)为纵坐标，单糖对照品的质量浓度为横坐标，绘制标准曲线，得各单糖的回归方程如下：D-甘露糖，y=0.692 7x-0.002 8，R2=0.999 8；D-葡萄糖，y=0.782 4x-0.045 0，R2=0.999 2；D-半乳糖醛酸，y=0.294 9x-0.001 5，R2=0.999 5；D-半乳糖，y=0.852 9x-0.007 3，R2=0.999 1；D-木糖，y=1.034 4x-0.013 7，R2=0.999 2。

2.5.2 专属性考察 分别取D-甘露糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、L-岩藻糖对照品，分别配制成D-甘露糖+L-岩藻糖、D-半乳糖醛酸+L-岩藻糖、D-葡萄糖+L-岩藻糖、D-半乳糖+L-岩藻糖、D-木糖+L-岩藻糖等5种对照品溶液以及L-岩藻糖对照品溶液、阴性对照液，按“2.3”项下方法制备各对照品溶液，按“2.1”项色谱条件进行测定，结果见图1-图3。

  

1. D-甘露糖； 2. D-半乳糖醛酸； 3. D-葡萄糖； 4. D-半乳糖； 5. D-木糖； 6. L-岩藻糖； S1. D-木糖+L-岩藻糖； S2. D-半乳糖醛酸+L-岩藻糖； S3. D-甘露糖+L-岩藻糖； S4. D-葡萄糖+L-岩藻糖； S5. D-半乳糖+L-岩藻糖。

 

图1 各单糖对照品的HPLC图谱

 

Figure 1 HPLC chromatogram of monosaccharide reference substances

2.5.3 精密度试验 精密吸取铁皮石斛(批号31211)碱溶性多糖供试品溶液10 μL，连续进样6次，结果所测的特征图谱与所得的共有模式的相似度均大于0.999，各共有峰相对峰面积与相对保留时间的RSD值均小于5.0%，表明精密度良好，符合特征图谱研究要求。

  

图2 阴性对照液的HPLC图谱Figure 2 HPLC chromatogram of negative control

  

图3 L-岩藻糖对照品溶液的HPLC图谱Figure 3 HPLC chromatogram of L-fucose

2.5.4 稳定性试验 精密吸取铁皮石斛(批号31211)碱溶性多糖供试品溶液10 μL，分别在0、4、8、12、16、24 h进样，结果所测的特征图谱与所得的共有模式的相似度均大于0.997，各共有峰相对峰面积与相对保留时间的RSD值均小于5.0%，表明24 h内供试品溶液稳定性较好，符合特征图谱研究要求。

2.5.5 重复性试验 取铁皮石斛(批号31211)，依法制备6份碱溶性多糖供试品溶液并进样分析，结果所测的特征图谱与所得的共有模式的相似度均大于0.995，各共有峰相对峰面积与相对保留时间的RSD值均小于5.0%，表明重复性良好，符合特征图谱研究要求。

2.5.6 加样回收试验 称取6份已知含量的铁皮石斛(批号31211)样品，每份约0.1 g，精密称定，加入相当于样品D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、D-木糖的质量分数80%、100%、120%的对照品(各2份)，按“2.4.2”项下方法制备，按“2.1”色谱条件进行测定，记录峰面积，并计算回收率和RSD，结果D-甘露糖平均回收率为98.12%，RSD为2.78%，D-葡萄糖的平均回收率为95.18%，RSD为2.83%，D-半乳糖醛酸平均回收率为97.01%，RSD为1.63%，D-半乳糖平均回收率98.37%，RSD为2.96%，D-木糖的平均回收率为99.59%，RSD为3.00%。

2.6 样品测定

取对照品溶液及“2.4”项下的水溶性多糖和碱溶性多糖供试品溶液按“2.1”项下的色谱条件进行测定，各石斛的水溶性多糖和碱溶性多糖的单糖组成、质量分数及D-甘露糖/D-葡萄糖的比值见表2、表3，典型色谱图见图4、图5。

 

表2 6种石斛水溶性多糖的单糖组成及质量分数Table 2 The contents and the monosaccharide composition of water-soluble polysaccharides from six species of Dendrobium

  

品种批号各单糖质量分数/%D⁃甘露糖D⁃半乳糖醛酸D⁃葡萄糖D⁃半乳糖D⁃木糖D⁃甘露糖/D⁃葡萄糖比值总质量分数/%铁皮石斛3121122．1506．69003．3128．844040525．3205．31004．7730．634050327．2804．84005．6432．12细茎石斛401159．4703．44002．7512．914012210．7204．40002．4415．124011414．0404．76002．9518．82齿瓣石斛4050619．0005．28003．6024．284051623．1105．68004．0728．794051522．1705．40004．1127．57兜唇石斛3031615．200．617．440．901．042．0425．194082115．460．289．280．250．301．6725．573072113．810．437．620．120．401．8122．39玫瑰石斛3051920．80018．820．450．501．1140．573031620．92019．160．390．581．0941．053072120．87019．760．400．631．0643．66束花石斛3031621．160．2415．750．260．211．3433．223051122．240．2616．530．230．221．3536．033072122．090．2316．320．240．261．3534．87

 

表3 6种石斛碱溶性多糖的单糖组成及含量Table 3 The contents and the monosaccharide composition of alkali-soluble polysaccharides from six species of Dendrobium

  

品种批号各单糖质量分数/%D⁃甘露糖D⁃半乳糖醛酸D⁃葡萄糖D⁃半乳糖D⁃木糖总质量分数/%铁皮石斛312111．310．2114．970．701．8519．04404050．390．3715．220．691．4118．08405030．270．2215．360．531．4717．84细茎石斛401150．290．891．630．831．545．18401220．290．881．740．901．615．42401140．230．901．480．871．675．14齿瓣石斛4050600．4014．580．891．2317．104051600．4514．300．791．1616．704051500．4812．860．841．3515．53兜唇石斛303160．650．251．180．450．933．47408210．590．231．030．450．903．20307210．750．351．170．501．023．79玫瑰石斛305190．130．296．930．803．0311．18303160．240．387．590．853．7712．83307210．210．369．640．672．7513．63束花石斛303160．300．406．891．134．9013．61305110．310．356．391．333．2011．57307210．310．366．631．433．3212．06

6个品种石斛各3批，经广州中医药大学魏刚研究员鉴定为兰科植物铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)、细茎石斛(Dendrobium moniliforme (L.) Sw.)、齿瓣石斛(Dendrobium devonianum Paxt.)、兜唇石斛(Dendrobium aphyllum (Roxb.) C. E. Fischer)、玫瑰石斛(Dendrobium crepidatum Lindl. ex Paxt.)和束花石斛(Dendrobium chrysanthum Lindl.)的茎，具体信息见表1。

  

1. D-甘露糖； 2. D-半乳糖醛酸； 3. D-葡萄糖； 4. D-半乳糖； 5. D-木糖； S1.铁皮石斛； S2.细茎石斛； S3.齿瓣石斛； S4.兜唇石斛； S5.玫瑰石斛； S6.束花石斛。

 

图4 6种石斛的水溶性多糖的特征图谱

 

Figure 4 Characteristic spectrum of water-soluble polysaccharides from six species of Dendrobium

  

1. D-甘露糖； 2. D-半乳糖醛酸； 3. D-葡萄糖； 4. D-半乳糖； 5. D-木糖； S1.铁皮石斛； S2.细茎石斛； S3.齿瓣石斛； S4.兜唇石斛； S5.玫瑰石斛； S6.束花石斛。

 

图5 6种石斛的碱溶性多糖的特征图谱

 

Figure 5 Characteristic spectrum of alkali-soluble polysaccharides from six species of Dendrobium

3 讨论

土体的破坏一般都是剪切破坏，因此研究土的抗剪强度对土体的影响也就有着重要的意义。本试验本着研究植物根系对土体的抗剪强度是否有影响，有什么样的影响，希望试验研究成果可以为重庆地区的边坡防护提供一定的理论支持。

2010年版《中国药典》规定用高效液相色谱法测定铁皮石斛D-甘露糖的质量分数应为13.0%～38.0%，甘露糖与葡萄糖的峰面积比应为2.4∶8.0；另外，还规定按干燥品计算，含铁皮石斛多糖以无水D-葡萄糖计，不得少于25%。本文结果显示，3批铁皮石斛的水溶性多糖均符合《中国药典》的规定，2批齿瓣石斛也均符合《中国药典》对铁皮石斛多糖的规定，因此，采用《中国药典》的方法并不能真正鉴别铁皮石斛，还有待完善。本文结果还显示，玫瑰石斛和束花石斛的水溶性多糖的质量分数均较铁皮石斛高，故市面上多用此类石斛冒充铁皮石斛，有必要加大监管力度。

取D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、D-木糖对照品约10 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，精密加入内标溶液1 mL，加水适量使溶解并稀释至刻度，摇匀。吸取400 μL，加0.5 mo1/L的PMP甲醇溶液250 μL与0.3 mol/L的NaOH溶液400 μL，混匀，70 ℃水浴反应100 min。再加0.3 mol/L的HCl溶液450 μL，混匀，用三氯甲烷洗涤3次，每次2 mL，弃去三氯甲烷液，水层即为混合对照品溶液。

目前4K与8K逐渐成为人们选购电视产品的主流选择。原因是随着视像行业技术的不断进步与网络信号传输速率的提高，人们对于高画质的需求在技术上已经能够得到满足。4K分辨率能够为用户带来相比1080P多4倍的像素显示，图像边缘更加锐利，细节丰富，8K技术也在不断提高过程中，部分电台、机构已经开始针对性开发8K摄录技术并开始试播。

本文结果显示，6种石斛的碱溶性多糖的质量分数均较高，特别是铁皮石斛和齿瓣石斛，质量分数均>15%。除齿瓣石斛以外，其余5种石斛碱溶性多糖的单糖组成都以D-甘露糖、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-木糖为主，因此，可结合碱溶性多糖的种类来鉴别区分铁皮石斛和齿瓣石斛。

At a certain point, the court found that only one translator bithesi is not enough.For example, in the 12th month of the 52nd year of Qianlong (1787) the emperor ordered the Grand Minister of the State :

目前，对石斛多糖的研究多集中于水溶性多糖，而忽视了石斛碱溶性多糖的价值。已有文献研究发现，金钗石斛的碱溶性多糖相对于水溶性和酸溶性多糖的抗疲劳作用较明显，可显著延长小鼠游泳时间,提高血糖和甘油三酯含量并降低血乳酸和血氨含量,降低游泳后肝糖原及肌糖原的消耗[7]。目前发现的含有硫酸根的碱溶性多糖具有较强的抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等生物活性，多糖硫酸化修饰及生物活性构效关系研究将成为将来很长时间的研究热点[9]。从本文结果可见，石斛碱溶性多糖的质量分数均较高，提示对石斛碱溶性多糖进一步研究具有长远的意义。

参考文献:

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[2] 黄明进,罗春丽,赵致，等.贵州兴义四种石斛的多糖和总生物碱含量分析[J].时珍国医国药，2014，25(6)：1359-1361.

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[6] 严慕贤,魏刚,刘康阳.等.金钗石斛水溶性多糖与碱溶性多糖对Hela细胞增殖的影响 [J].中药新药与临床药理,2015,26(2)：195-198.

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[9] 熊双丽，李安林．酸性多糖的最新研究进展[J].食品科技，2010，35(5)：80-83.