沉默YAP基因抑制胃癌SGC-7901细胞体外增殖和迁移侵袭能力

胃癌(gastric cancer)是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率居高不下，已经成为我国发病率最高的恶性肿瘤之一[1]。虽然传统的外科手术和化疗提高了部分患者的5年生存率，但是由于早期发病症状不明显，以及诊断条件所限，导致很多患者就诊时已处于中晚期，从而错过最佳治疗时机。因此，寻找胃癌特异的诊疗靶点非常重要。YAP(Yes-associated protein)，Yes相关蛋白，位于染色体11q22位点，是一种转录共激活因子，属于Hippo信号通路的一个关键蛋白[2]。在细胞正常的生长发育过程中，YAP能够通过调控细胞凋亡以及增殖之间的平衡，维持器官正常大小[3]。研究表明，YAP基因在肝癌、结肠癌和卵巢癌中都高表达，提示YAP基因的高表达与肿瘤的侵袭、转移以及不良预后有关[4-6]。2015年11月至2016年7月本研究通过RNA干扰技术下调人胃癌细胞SGC-7901中YAP基因的表达，检测RNA干扰后胃癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化，从而为胃癌的诊断和治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 人胃癌细胞系SGC-7901(中科院上海生命研究所)；RPMI-1640培养基；胎牛血清(Gibco公司)；Lipofectamine3000转染试剂(Invitrogen公司)；YAP基因RNAi寡核苷酸(广州锐博生物科技公司)、YAP基因和GAPDH基因PCR引物(北京擎科新业公司)；CCK8试剂盒(碧云天公司)；结晶紫(武汉谷歌生物科技公司)；Transwell小室(BD公司)。靶向YAP基因的siRNA和control siRNA由广州锐博生物科技有限公司设计并合成。靶向YAP基因的siRNA的序列如下：5′-GGUGAUACUAUCAACCAAA-3′。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 胃癌细胞SGC-7901用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，培养条件为37℃、5%CO2恒温箱。当细胞处于80%～90%汇合度时，用胰蛋白酶消化接种于6孔板。当细胞培养至30%～50%汇合度时，用Lipofectamine3000(Invitrogen公司)转染。转染方法按照Lipofectamine3000说明书。细胞分为3组：转染YAP siRNA的实验组、转染siRNA-control的对照组和不处理的空白组。

1.2.2 Western blot法检测YAP蛋白的表达水平 转染72 h后，收集6孔板细胞，提取总蛋白，采用BCA法定量检测蛋白浓度。取40 μg蛋白上样、进行SDS-PAGE凝胶电泳、转PVDF膜、5% 脱脂牛奶封闭2 h、加入YAP的抗体(Proteintech公司，1∶500)、和GAPDH的抗体(谷歌公司，1∶2 000)于4℃摇床孵育过夜。次日，加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)标记的羊抗兔二抗IgG(武汉谷歌生物科技公司，1∶2 000)，室温孵育2 h，TBST洗膜，使用ECL化学发光试剂显影，以GAPDH为内参，计算灰度值，对目的蛋白表达量进行分析。

1.2.3 克隆形成检测细胞增殖能力 转染24 h后，胰酶消化细胞，计数，以100个/孔的密度接种于12孔板，每组设置3个复孔。将平板放置于37℃，5%的CO2培养箱中培养。培养至第14天，去掉培养基，1×PBS清洗，用0.1%的结晶紫染色。计数>50 μm的细胞克隆数目。

1.2.4 CCK8检测细胞增殖 转染24 h后，胰酶消化细胞后，以5×103/孔的密度接种于96孔板，每组设置3个复孔。放置于37℃、5%的CO2培养箱中培养。在培养24、48、72和96 h向各孔中分别加入10 μL CCK8溶液，37℃孵育2 h，使用酶标仪分别测定培养后细胞在波长450 nm处的吸光度值(A值)，绘制增殖曲线。

1.2.5 Transwell体外迁移实验 胃癌细胞系转染相应siRNA 48 h后，消化细胞，用无血清的RPMI-1640培养基重悬，调整细胞汇合度为2×105 cells/mL。采取孔径为8 μm的Transwell小室进行体外迁移实验。上室中加入100 μL细胞悬液，下室加入500 μL的含有10%FBS的完全培养基，继续在37℃、5% CO2培养箱中培养24 h。取出小室，吸尽液体，1×PBS冲洗1遍，用棉签小心擦去小室内上面的细胞，甲醛固定，0.1%的结晶紫染色。荧光倒置显微镜拍照，随机选取4个视野计数迁移到下室的细胞数，取其平均值。每组实验重复3次。

1.2.6 Transwell小室侵袭实验 Transwell小室上室中加入用无血清培养基1∶2稀释的Matrigel 100 μL，放入37℃培养箱中30 min，使其凝固。其余步骤同1.2.5。

1.3 统计学方法 所有试验重复3次，计量资料以表示。使用SPSS 17.0软件进行统计学分析，正态分布变量多组间比较采用方差分析，两组间均数的比较采用t检验，检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 Western blot检测siRNA干扰YAP基因的表达 YAP siRNA干扰细胞后，在蛋白水平YAP基因的表达量显著降低(P<0.05)。空白组、对照组和实验组蛋白表达量依次为0.99±0.12、1.02±0.08、0.20±0.13。与空白组和对照组比较，实验组YAP蛋白表达明显下调(P<0.05)。由于YAP基因被成功干扰，因此可以继续进行后续功能验证，见图1。

  

图1 YAP-siRNA干扰YAP蛋白表达

2.2 下调YAP基因表达能够显著抑制细胞的增殖 空白组、对照组和实验组细胞形成的克隆数依次为52±8、48±3、25±6。与空白组和对照组比较，实验组克隆形成能力明显下调(P<0.05)。克隆形成实验显示实验组胃癌SGC-7901细胞的克隆形成能力相比空白组和对照组明显降低(P<0.05)，见图2。

  

A:空白组；B:对照组；C:实验组

 

图2 克隆形成实验检测细胞增殖效率

CCK8实验检测转染YAP-siRNA的实验组胃癌细胞增殖效率在第2天和第3天明显低于空白组和对照组水平(P<0.05)，见图3。

YAP-siRNA组的倍增时间明显长于空白组和对照组(P<0.05)，见表1。

1 000 例糖尿病患者均接受相关疾病宣教及疾病教育后，自愿接种肺炎疫苗患者有104例，自愿接种肺炎疫苗率为10.40%（104/1 000）。

2.3 下调YAP基因抑制胃癌细胞的迁移 YAP-siRNA和control-siRNA分别转染胃癌细胞，实验组细胞的迁移速度明显低于对照组和空白组(P<0.05)。空白组、对照组和实验组细胞的迁移穿膜数依次为124±15、130±22、60±12。与空白组和对照组比较，实验组细胞的迁移穿膜能力明显下调(P<0.05)。

2.4 下调YAP基因抑制胃癌细胞的侵袭能力 YAP-siRNA和control-siRNA分别转染胃癌细胞，实验组细胞的侵袭能力明显低于对照组和空白组(P<0.05)。空白组、对照组和实验组胃癌细胞穿膜的数量依次为24±2、26±6、8±2。与空白组和对照组比较，实验组细胞的侵袭穿膜能力明显下调(P<0.05)。

  

*与对照组比较P<0.05

 

图3 胃癌SGC-7901细胞的增殖曲线图

 

表1 3组细胞的倍增时间(n=3)

  

组别种植细胞数(×103)第7天细胞数(×105)倍增时间(h)空白组5.02.43±0.04525.93±0.169对照组5.02.29±0.06126.06±0.175实验组5.00.48±0.01339.58±0.339*

 

*与对照组比较P<0.05

3 讨论

胃癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，胃癌的5年生存率从ⅠA期的95%降至ⅢC期的10%，到Ⅳ期5年生存率就只有3%[7]。因此寻找治疗胃癌的新靶标非常重要[8]。

③节水灌溉模式的确定。项目区属于西夏渠灌域，根据规划西夏渠灌域内新建扬水灌区采用小管出流和滴灌灌溉方式。考虑灌区水源条件、地形条件、气象、土壤、作物种类、管理水平等影响因子，分析认为灌区适宜的田间节水灌溉模式应以滴灌为主。

YAP是Hippo信号通路的重要组成部分，是一种转录激活子。Hippo信号通路最先是在果蝇中发现的[3]。Hippo能够通过促进细胞凋亡以及抑制细胞增殖来控制器官的大小[9]。研究发现，Hippo-YAP通路与人类肿瘤的发生和发展紧密相关。YAP在多种肿瘤组织中高表达，例如肺癌、肝癌、结肠癌以及卵巢癌等[10-12]。但是YAP在胃癌SGC-7901细胞里的研究目前还不是很多。因此，本研究通过利用siRNA技术下调SGC-7901细胞中YAP基因表达，通过WB实验确定YAP表达被下调。CCK8和克隆形成实验结果显示，下调YAP基因表达后，胃癌SGC-7901细胞的增殖能力下降，表明下调YAP基因抑制胃癌细胞SGC-7901增殖。通过Transwell小室模型研究下调YAP基因对于胃癌细胞的迁移和侵袭能力的影响。结果表明，下调YAP基因表达后，实验组穿透Transwell基底膜的细胞数量明显减少，表明下调YAP表达能够抑制胃癌细胞的迁移和侵袭能力。

综上所述，YAP基因的表达高低与胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭有关。利用siRNA技术下调YAP基因表达可以抑制胃癌SGC-7901细胞的增殖能力、抑制胃癌SGC-7901细胞的迁移和侵袭能力，从而对胃癌SGC-7901细胞的恶性表型进行干预。本研究表明YAP基因可以作为胃癌诊断和治疗的潜在靶点。

参考文献

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