混池法鉴定小豆F2群体

小豆(Vigna angularis)，又名红小豆、赤豆，起源于中国，具有悠久的栽培历史，是重要的食用豆之一。杂交对小豆遗传改良和作图群体构建具有重要意义，及时有效的鉴定真假杂种可提高小豆遗传改良效率。小豆进行全基因组测序并构建了高密度的SNP遗传连锁图谱，为小豆功能基因组学研究和遗传育种奠定坚实的基础[1]。

常用的真假杂种鉴定方法有常规表型鉴定、DNA分子标记鉴定和生化鉴定等[2]。DNA分子标记鉴定常用标记有SSR(Simple Sequence Repeat)、ISSR(Inter Simple Sequence Repeat)、SRAP(Sequence-Related Amplified Polymorphism)、RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)、RAPD(Random Amplified Polymorphic DNA)和SNP(Single Nucleotide Polymorphism)等。其中，SSR标记由于具有丰度高、多态性高、共显性等特点，被广泛应用于真假杂种鉴定。刘俊睿等[3]通过SSR标记和表型调查对43个小豆杂交组合的123个F1代材料进行真假杂种鉴定，鉴定出66个真杂种。曹广英等[4]利用微卫星(SSR)标记技术对花生的4个杂交组合F1代材料进行分子及形态学鉴定，鉴定出30粒真杂种。其他分子标记在真假杂种鉴定中亦有应用，韩燕等[5]利用花生的SNP位点建立了一套用限制性内切酶酶切的方法对花生F1代进行真假鉴定。郭建文等[6]利用ISSR标记和田间表型相结合对小黑麦F1代群体进行遗传多样性分析。薛丹丹等[7]通过SRAP标记对结缕草属植物杂交后代进行真实性鉴定。田保华等[8]通过RFLP标记对25份洋葱大葱种间F1杂种材料进行鉴定。以上研究均表明DNA分子标记可以高效鉴定真假杂种，多种鉴定方法相结合可提高真杂种鉴定的准确性。

供试材料为小豆缺铁敏感突变体与缺铁不敏感种质资源、耐低铁突变体与和缺铁敏感种质资源杂交F2代群体，缺铁敏感性鉴定需要在缺铁胁迫下进行，缺铁表型性状不易调查，因此用分子标记并参照其他表型性状进行鉴定。由于F2群体数量较多，单株鉴定工作量较大，采用混池法将每个F2群体混成一个池，利用SSR分子标记进行鉴定,结合表型性状验证，以提高杂交育种选择效率，减少工作量，为构建基因定位群体提供快速鉴定方法。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料F2杂交群体及其相应亲本，由北京农学院小豆研究团队提供，共9个杂交组合35份F2代群体材料。不同杂交组合(包含正反交)分为A(GM873 × FMY011和FMY011×GM873)、B(FMY011 ×CCA026),C(CCA026× FMY009和FMY009×CCA026)、D(FMY009 × GM684)、E(GM684 × FMY007和FMY007×GM684)、F(GM309 × MY076)(表1)。其中，每对亲本均由缺铁敏感或缺铁不敏感材料组成，FMY011、FMY009和FMY007为缺铁敏感突变体，GM309是缺铁敏感资源材料，缺铁时表现为新叶黄化；MY076为耐低铁突变体，GM873、CCA026和GM684为缺铁不敏感种质资源材料，缺铁时表现为正常绿叶。2017年6月份种植于北京农学院科技园。至7叶期时，各群体单株选取1 cm2大小幼嫩叶片，30株作一小混池，-80 ℃保存。

表1 F2代群体及对应亲本名称信息表 Tab.1 List of F2 populations and their relative parents

GroupNameofF2CrosscombinationGroupNameofF2CrosscombinationA17FMY2001-1GM873×FMY011E17FMY2007-3GM684×FMY00717FMY2001-2GM873×FMY01117FMY2007-5GM684×FMY00717FMY2001-3GM873×FMY01117FMY2007-6GM684×FMY00717FMY2002-1FMY011×GM87317FMY2007-7GM684×FMY00717FMY2002-2FMY011×GM87317FMY2007-8GM684×FMY007B17FMY2003-1FMY011×CCA02617FMY2007-10GM684×FMY00717FMY2003-2FMY011×CCA02617FMY2007-11GM684×FMY007C17FMY2004-1CCA026×FMY00917FMY2007-12GM684×FMY00717FMY2004-2CCA026×FMY00917FMY2007-13GM684×FMY00717FMY2004-3CCA026×FMY00917FMY2007-15GM684×FMY00717FMY2005FMY009×CCA02617FMY2007-16GM684×FMY007D17FMY2006-1FMY009×GM68417FMY2007-17GM684×FMY00717FMY2006-2FMY009×GM68417FMY2007-18GM684×FMY00717FMY2006-3FMY009×GM68417FMY2007-19GM684×FMY007F17FMY2009-1GM309×MY07617FMY2007-20GM684×FMY00717FMY2009-2GM309×MY07617FMY2008-1FMY007×GM684E17FMY2007-1GM684×FMY00717FMY2008-2FMY007×GM68417FMY2007-2GM684×FMY007

1.2 DNA提取与带型鉴定

2%CTAB法提取小豆基因组DNA，对提取的DNA母液进行浓度测定后，同一群体内的小混池(30株)DNA等量混成一个大混池(整个群体)，用于群体真假杂种鉴定。PCR反应为10 μL体系，其中模板DNA 1 μL(30 ng/μL)、引物1 μL(5 μmol/L)、ddH2O 3 μL和PCR MIX 5 μL(北京康为世纪生物科技有限公司)。PCR条件为预变性94 ℃ 5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，33个循环；最后72 ℃延伸5 min。用8%的聚丙烯酰胺凝胶对PCR产物进行电泳，银染显色，拍照记录。

2 结果与分析

2.1 亲本间多态性标记筛选

本文结合污水厂工程实际地基施工案例，通过夯实水泥土桩技术在该污水厂工程中的实际应用，总结出夯实水泥土桩技术的诸多优点与现实意义，为我国地基工程施工建设与相关基础设施建设提供相关参考意见。

图1 SSR标记亲本间多态性筛选 Fig.1 Polymorphic screening of SSR markers in parents

表2 引物信息表 Tab.2 Information of primers

引物名称Name染色体Chr．引物序列Primer(5＇→3＇)产物长度Productlength(bp)BAgs-00911F：gaaatgactctatgacaaccaaagtca225BAgs-09501F：ggttttaactcgattatttcaaaactga198BAgs-02622F：caattttgattgagtttttcaacgtg231BAgs-02632F：tgttcctgttttcatattcatcctga196BAgs-04673F：tttggtcgattctccctcttctct150BAgs-04693F：catgctttatttgtgtttggggtt137BAgs-15093F：ttctatgtagtggttgtgatactcatgc138BAgs-08274F：gttctttcttcaaatactatcacccca133BAgs-15624F：tgtgcaaaatatgttccctaccct236

2.2 F2群体真假杂种后代鉴定

参考文献：

图2 F2群体真实性鉴定 Fig.2 Identification of reliability in F2 populations

3 讨 论

美国战略界对“一带一路”倡议的认知，从属于其对中国的总体战略判断。近年来，美国战略界对中国的印象和战略判断日益负面，特别是自2015年的美国对华政策大辩论以来，到目前为止，美国战略界基本形成一种较为负面的对华战略共识，即过去几十年来的美国对华接触政策是失败的：中国从美国的对华接触政策中获得了巨大好处，国力蒸蒸日上，但无论内政还是外交上都没有发生美国期待的变化，相反在政治上日益保守，外交政策方面日益咄咄逼人，甚至试图取代美国在印太乃至全球的霸权地位，对美国利益构成了强劲挑战。总之，美国对华政策需要改弦易辙。

图3 17FMY2007-7亲本及群体叶形比较 Fig.3 The comparison of leaf shape between parents and 17FMY007-7 population

试验所用群体是小豆缺铁敏突变体×缺铁不敏感种质资源、缺铁不敏突变体×缺铁敏感种质资源杂交F2群体，缺铁敏感材料在石灰性土壤或缺铁胁迫下表现新叶黄化症状，由于试验田土壤非石灰性，群体并无新叶黄化性状呈现，多数亲本间性状差异及群体分离不明显，无法通过表型性状进行群体真实性鉴定。因此，试验用分子标记鉴定9个组合的35个F2群体，并结合田间长势和叶形等表型性状进行辅助鉴定，通过混池法降低分子标记鉴定的工作量，提高了效率。混池法常见于基因定位实验F2:3对F2基因型的鉴定中，Ouedraogo等[9]利用AFLP与BSA法结合研究豇豆寄生杂草抗性基因，各用了22个F3家系单株对F2基因型进行确定。Sibov等[10]在玉米耐铝胁迫基因基因研究中，采用56个F3家系单株对F2基因型进行鉴定。Li和Garvin[11]在花椰菜基诱导β-胡萝卜素积累的基因研究中，用12株F3家系确定基因型。Moury等[12]在辣椒番茄斑萎病毒病研究中选取了9株F3家系，对F2代单株基因型进行鉴定。但是，混池鉴定方法也存在一定误差，假设某一真杂种F2群体个体数为n，将其错误地鉴定为纯合子假杂种的概率为(1/2)n，则鉴定正确的概率为1-(1/2)n。因此，混池取样越大，鉴定正确的概率越高。试验为降低该误差，对F2群体全数采样构建混池。此外，在亲本多态性标记筛选过程中发现：1)亲缘关系较近的亲本多态性较低，多态性标记筛选困难；2)有多态的标记往往在多个亲本间多态率较高，而无多态的标记在各亲本间多态率通常也较低。因此，为提高杂交种选择效率，在配制杂交群体时，应尽可能选择表型标记明显(如叶形)、亲缘关系较远的亲本进行杂交。

迄今鲜见混池法应用于群体真实性鉴定的报道，试验将小豆不同杂交组合35个F2群体分别构成混池，并利用自主开发的SSR分子标记进行真杂种后代鉴定，并以表型性状分离作为佐证，筛选出10个真杂种群体。结果显示，混池法可以有效鉴定F2群体真实性、降低工作量、节约成本，为作图群体及其后代真实性鉴定提供新方法，以提高遗传育种选择效率。

目前小豆常用的真假杂种表型鉴定主要有叶形、株型、茎色、荚色等指标，F1代往往由于基因显性作用，无法直接从表型上判断是否为真杂种，鉴定尤为重要。刘俊睿等[3]通过群体荚色调查和SSR标记辅助鉴定相结合对小豆43个杂交组合的123个F1代材料进行真实性鉴定，鉴定出66个真杂种。F2及高代群体则可根据表型分离情况，更为直观地判断其真实性。试验群体由于是铁吸收相关基因突变的缺铁敏感作图群体，一般需要缺铁胁迫鉴定，许多组合的亲本间农艺性状差别不大，田间表型性状分离不明显，其中仅17FMY2007-7群体的亲本GM684和FMY007分别为戟形叶和卵圆叶，F2出现叶形分离(图3)，因此难以通过该表型标记鉴定F2分离群体的真实性。当父母本间表型标记不明显或者无差别时，只能借助分子标记进行鉴定，由于分离群体单株数量多，分子标记鉴定工作量较大，增加工作量和成本，混池法则可以有效地减少鉴定工作量和节约成本。

对9个杂交组合的35个杂交群体进行真假杂种群体鉴定，每组均用三对位于不同染色体的多态性引物进行鉴定。SSR标记为共显性标记，真杂种混池应同时具有父母本的谱带，假杂种混池只有母本的谱带。经鉴定，共有10个群体混池呈双谱带，为真杂种，包括17FMY2001-1、17FMY2001-2、17FMY2001-3、17FMY2002-1、17FMY2002-2、17FMY2003-2、17FMY2004-1、17FMY2004-3、17FMY2007-7、17FMY2009-2(图2)。其余群体混池均呈单一带型，其中D组合群体17FMY2006-1、17FMY2006-2、17FMY2006-3和E组合群体17FMY2007-13只呈父本带型，可能是杂交时父母本颠倒所致，亦为假杂种(图2)。此外，以上组合亲本在株型、茎色、粒色等表型性状均无明显差异，仅在长势和叶形中存在部分差异。通过对群体田间性状分离情况统计发现，以上真杂种群体部分表现出长势差异。其中仅17FMY2007-7的亲本存在叶形差异，GM684为戟形叶，FMY007为卵圆叶，为真假杂种鉴定提供了表型依据。群体17FMY2007-7表现出卵圆和戟形两种叶形(图3)，表型性状分离进一步佐证了SSR标记的可靠性。

如果单纯地将《胭脂扣》看作是痴男怨女间的爱恨情仇未免太过浅薄。李碧华虽自白爱写“男女”题材，可这些题材大抵都会被置放在相应的历史情境中，带有或多或少的香港记忆，像《青蛇》、《霸王别姬》、《秦俑》等作品皆是如此。李小良先生在《小说的文化认同与性别意识》一文中指出：“李碧华的小说是一种比较有意思的导向：就是紧扣香港当前和过去的特定历史时空和文化脉络来阅读。……更可以洞见她的作品在特定的文化空间的意义和跟历史政治现实的相关性。”《胭脂扣》中，作者将视线投放在回归前的香港，借如花所说所见重构起半个世纪之久的民间香港史。

[2] 曲志伟. DNA分子标记技术在玉米纯度检测中的应用研究[J]. 吉林农业, 2017(12):63-64

[3] 刘俊睿, 谢梦娇, 闫龙,等. SSR分子标记鉴定小豆F_1真假杂种[J]. 北京农学院学报, 2014, 29(1):1-5

健康教育前后风险识别能力、寻求帮助能力、协商能力、拒绝能力等防艾生活技能分别为 （1.76±0.21）、（1.80±0.17）、（1.78±0.18）和（1.80±0.16）分，均高于教育前，差异具有统计学意义 （χ2=30.850、52.860、41.564 和 40.225，P＜0.01），见表 1。

[4] 曹广英, 吴琪, 王云云,等. 利用SSR标记鉴定花生杂交F_1代真假杂种[J]. 山东农业科学, 2016(1):7-10

[5] 韩燕, 马登超, 刘译阳,等. 利用特异性 SNP 位点鉴定花生杂交 F1代真假杂种[J]. 山东农业科学, 2016, 48(4):14-17

2．1 不同组别的血清Cys－C、Cr和BUN的水平 随着窒息程度的加重，对照组、轻度窒息组和重度窒息组新生儿的血清Cys－C、Cr和BUN水平均依次增高，见表1。对Cys－C、Cr和BUN分别研究，每一项的重度窒息组、轻度窒息组与对照组两两比较，以Kruskal－Wallis H检验，差异均有统计学意义（P＜0．01）。

选取均匀分布在小豆11条染色体上的100对SSR引物进行亲本多态性筛选，引物由北京农学院小豆团队自主开发、深圳华大基因股份有限公司合成。经亲本间多态性鉴定后，从中筛选出9对多态性高的引物用于群体真实性鉴定，9对引物分布于小豆1～4号染色体上(表2)。用这9对高多态性引物在亲本间进一步验证，结果这些引物在8个亲本间均有较高的多态性(图1)。

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这一阶段主要表现为弹-靶撞击面上压力的突然下降，直至应力波的能量密度小于靶材变形所需的阻力为止。在主要、次要阶段中，弹、靶材料还会出现从坑中向外喷溅的现象。图2给出了球形弹丸撞击靶体成坑过程的示意图。

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[10] Sibov S T, Gaspar M, Silva M J, et al. Two genes control aluminum tolerance in maize: Genetic and molecular m. [J]. Genome, 1999, 42(3):475-482

第一，部分报账业务退返率较高，影响师生服务体验。因部分业务审核时间长，报销难度大，如出国业务报销，涉及的管理部门与经费较多，往往出现很多问题不能一次性解决，报销师生多次来回无法一次性处理完毕，久而久之产生抵触情绪，这必然降低网上预约报账的便利性，影响了用户体验。

[11] Li L, Garvin D F. Molecular mapping of Or, a gene inducing beta-carotene accumulation in cauliflower (Brassica oleracea L. var. botrytis) [J]. Genome, 2003, 46(4):588

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