miRNA在骨肉瘤治疗中的研究进展

骨肉瘤是0～20岁青少年最常见的恶性骨肿瘤。它起源于骨间质组织，具有高度恶性﹑侵袭和早期肺转移的特点，因此骨肉瘤患者的预后差，截肢术后5年存活率仅5～15%[1]。微小RNA是一类长度约为18～24 nt的内源单链小RNA，参与基因转录后水平调控，对基因的表达、生物的发育和行为具有重要影响[2]。在正常骨组织和骨肉瘤中miRNA的表达也存在较大差异，可作为诊断的生物标志物，为骨肉瘤的治疗提供一条新的途径[3，4]。本文综述近年来miRNA分子在骨肉瘤治疗中的研究进展，以期为骨肉瘤临床治疗提供参考。

1 miRNA的生物学性状

miRNA相关研究最早开始于1993年，Lee等[5]在秀丽新小杆线虫中发现了miRNA Lin-4分子，并通过定位克隆方法将Lin-4分离出来，随后研究发现该基因不编码蛋白质，却可以调控胚胎发育。2002年Lagosquintana等[6]通过Northern Blot和定位克隆法在小鼠心脏、肝脏和大脑等器官中发现了34种miRNA，实验研究发现miRNA可与靶基因mRNA的3’端非编码区结合后发挥生物学作用。miRNA对靶基因的调控作用依赖于miRNA分子自身结构和功能的完整性。

2 miRNA与骨肉瘤的发生发展

目前已有众多miRNA与骨肉瘤发生发展相关的文献报道[7-12]。新近研究显示，miRNA参与调控骨肉瘤细胞的增殖分化过程，Liu课题组[13]收集了62个病人的肿瘤组织以及周边的正常组织标本，通过miRNA芯片分析显示，其中有29个miRNA表达上调，26个miRNA表达下调，尤以miR-499a-5p表达下调最为明显，然而蛋白磷酸酶1D(protein phosphatase 1D, PPM1D)的表达水平比正常组织高。此外他们还发现，与非转移性肿瘤和处于Ⅰ期的肿瘤病灶相比，转移病灶和处于Ⅲ+Ⅳ期的肿瘤组织中，miR-499a-5p的表达显著降低。通过在人骨肉瘤细胞MG63中转染miR-499a-5p mimics发现，miR-499a-5p表达水平提高，且PPM1D的mRNA和蛋白表达降低。综合以上研究他们认为，PPM1D是miR-499a-5p作用的靶分子。与正常对照组相比，转染miR-499a-5p mimics的MG63细胞中PPM1D相关下游蛋白如蛋白磷酸化蛋白激酶(p-Akt)和磷酸化糖原合成酶激酶3β (p-GSK-3beta)表达下调。与临近的非肿瘤组织相比，肿瘤组织内的p-Akt和p-GSK-3beta表达明显升高。研究还发现，与正常对照相比，转染了miR-499a-5p的MG63细胞的生长和增殖活力明显降低。因此推测，miR-499a-5p抑制骨肉瘤细胞增殖分化，可能是它靶向作用于PPM1D蛋白，通过调节Akt/GSK-3beta信号通路而实现的。不仅如此，Nugent等[14]的研究也显示，miRNA分子参与成骨细胞的增殖和发育过程，其机制可能与它们抑制靶基因的翻译后修饰过程有关。miRNA分子不仅存在于外周血，还在多种肿瘤病变组织中被检测到，它们的表达存在一定的差异，其中一些miRNA可通过激活Notch信号通路促进骨肉瘤的形成，而骨肿瘤细胞的增殖﹑侵袭和迁移行为也受到miRNA差异表达的影响[15]。国内外众多学者对骨肉瘤细胞和组织中miRNA的表达进行了大量测试分析，发现了miRNA在骨肉瘤中表达的差异性，促使miRNA成为了骨肉瘤诊断和治疗的重要靶点(见表1)。

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表1 骨肉瘤中miRNA的表达情况及其意义

miRNA表达水平靶基因在骨肉瘤中的意义参考文献miR-27a上调CCNG1促进细胞侵袭[16]miR-411上调MTSS1促进细胞增殖[17]miR-27-3p上调ING5调控细胞周期,促进细胞增殖[18]miR-21上调PTEN调控PTEN/PI3K/AKT信号通路[19]miR-433上调PDCD4抑制肿瘤细胞凋亡[20]miR-378上调KLF9促进细胞增殖[21]miR-19上调SOCS6调控JAK2/STAT3信号通路[22]miR-143-3p下调FOSL2抑制细胞增殖、迁移和侵袭[23]miR-567下调FGF5抑制细胞增殖、迁移和侵袭[24]miR-302a下调IGF-1R抑制细胞迁移和侵袭[25]miR-328-3p下调H2AX抑制细胞增殖和促进细胞凋亡[26]miR-505下调HMGB1抑制细胞生长、迁移和侵袭[27]miR-638下调PIM1抑制细胞增殖[28]miR-503下调IGF-1R抑制细胞增殖和侵袭[29]miR-34a下调Bcl-2调控细胞周期,抑制细胞迁移和侵袭[30]miR-448下调EPHA7抑制细胞增殖、集落形成和迁移[30]miR-365下调CYR61抑制细胞增殖、迁移和侵袭[31]miR-491-5p下调FOXP4抑制细胞增殖、侵袭和诱导细胞凋亡[32]miR-124下调SPHK1抑制细胞周期、增殖和侵袭[33]

注：CCNG1：细胞周期蛋白G1(confirm cyclin G1)； MTSS1：转移抑制1基因(metastasis suppressor protein 1)； ING5：生长抑制因子5(inhibitor of growth family member 5)； PTEN：同源性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog)； PDCD4：细胞程序性死亡4基因(programmed cell death 4)； KLF9：kruppel样因子9(kruppel-like factor-9)； SOCS6：细胞因子诱导的信号传导抑制因子6(suppressor of cytokine-induced signaling 6)； FOSL2：FOS样抗原2(FOS-Like antigen 2)； FGF5：成纤维细胞生长因子5(fibroblast growth factor 5)； IGF-1R：胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor)； H2AX：组蛋白之一； HMGB1：高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1)； Bcl-2：B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2)； EPHA7：ephrin受体A7(eph receptor A7)； CYR61：富半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich angiogenic inducer 61)； FOXP4：人类相关癌基因forkhead-box P4； SPHK1：鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1)

3 miRNA与骨肉瘤的治疗

近年多项研究显示，miRNA分子不仅参与调控骨肉瘤生长微环境、肿瘤耐药性以及肿瘤细胞外泌体功能，还可被用于制备纳米颗粒，靶向治疗骨肉瘤。而miRNA分子在上述事件中作用机制的解析，将有助于为骨肉瘤的临床治疗提供新的途径与方法。下面分别简介参与调控骨肉瘤生长微环境﹑肿瘤耐药性﹑肿瘤细胞外泌体功能以及用于纳米靶向治疗的miRNA分子及其功能特征。

3.1 调控骨肉瘤生长微环境的miRNA分子

许多miRNA在不同类型的肿瘤微环境中表达上调或者下调，有效调控这些miRNA的表达，可抑制肿瘤生长。Xu等[34]研究发现，骨肉瘤组织和细胞中miR-150表达下调，随后应用miR-150 mimics转染骨肉瘤细胞﹑ZEB1(zinc finger E-box binding homeobox 1)siRNA技术﹑MTT实验和Transwell实验，结果发现，miR-150可作为抗癌调控子，作用于ZEB1，抑制骨肉瘤的发展进程。Jiang等[35]研究发现，在骨肉瘤细胞中miR-208b低表达，随后经细胞转染、PCR和WB检测发现，miR-208b可下调ROR2(receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2)基因的表达。将ROR2-siRNA转染到骨肉瘤细胞中发现，ROR2沉默可抑制骨肉瘤细胞的增殖及侵袭迁移行为，因此miR-208b可作为一个防止肿瘤转移的新靶点。Zhang等[36]发现miR-210在骨肉瘤细胞的去分化过程中表达明显增加。miR-210表达上调后，参与低氧和TGF-β1诱导的骨肉瘤细胞去分化过程。在MNNG/HOS细胞中miR-210与TGF-β1表达呈正相关，且miR-210可通过活化TGF-β1及其下游因子促进骨肉瘤细胞去分化，从而促进肿瘤的发展及转移。进一步的研究数据表明NFIC(nuclear factor I/C)是MNNG/HOS细胞中miR-210作用的一个靶基因，而miR-210表达与NFIC表达呈负相关，因此推测NFIC可能是骨肉瘤细胞去分化的一个潜在靶点基因。Xu等[37]研究发现，抑制miR-106b表达后，骨肉瘤细胞的增殖率明显降低，而WB检测分析显示，PI3K/AKT信号通路中的关键蛋白AKT的磷酸化水平以及PI3K的催化亚基P110的表达水平明显降低，说明miR-106b可以促进骨肉瘤细胞PI3K/AKT信号通路的激活，调节细胞周期G1/S转换，从而调控U2OS骨肉瘤细胞的侵袭能力。Ye等[18]观察到骨肉瘤细胞中miR-27-3p表达上调，利用骨肉瘤细胞U2OS和MG63培养，发现外源性miR-27-3p过表达可直接靶向作用于肿瘤生长抑制因子ING5，进而抑制ING5的抗癌作用，促进骨肉瘤细胞增殖。以上研究表明，miRNA可通过不同调控方式调节骨肉瘤细胞增殖、侵袭、迁移等微环境，抑制骨肉瘤的生长及发展。

3.2 靶向调控骨肉瘤耐药相关miRNA分子

骨肉瘤患者长期大量使用某些化疗药物易诱发基因突变，产生耐药，增加了骨肉瘤治疗难度。针对这一问题，许多学者对骨肉瘤耐药性的发生机制以及参与调控耐药性的关键miRNA分子展开了研究。Zou等[38]研究发现，对顺铂耐药的骨肉瘤MG63细胞(MG63-DDP)miR-133b的表达水平升高。将miR-133b前体(pre-miR-133b)转染入该细胞中，miR-133b的表达上调，且对顺铂的耐药性更强。依此推测，骨肉瘤患者长期顺铂化疗后，其miR-133b表达升高，致使肿瘤细胞对顺铂的药物抗性增强。因此miR-133b可作为检测是否产生耐药的生物标志物。Yan等[39]研究发现，在骨肉瘤细胞中miR-340表达下调，同时ZEB1表达上调。进一步研究发现，miR-340和ZEB1表达水平与药物抗性有关，通过MG63-DDP细胞转染miR-340，使miR-340表达上调，作用于ZEB1基因，进而降低了骨肉瘤的药物抗性行为。因此miR-340可作为缓解骨肉瘤药物抗性的生物标记。Tang等[40]检测了20对骨肉瘤和非肿瘤组织的miR-223表达水平，结果发现，骨肉瘤组织中miR-223表达显著下调。运用miR-223 mimics转染MG63细胞，miR-223表达上调，且细胞增殖速率减慢。miR-223可负向调节顺铂治疗中骨肉瘤细胞 Hsp70表达，通过JNK/JUN信号通路产生顺铂的药物抗性。综上所述，miRNA分子参与骨肉瘤的药物抗性行为，它不仅可作为判断骨肉瘤是否产生药物抗性的新颖生物标志物，还可调控骨肉瘤药物抗性行为，成为了骨肉瘤治疗的重要靶点。

3.3 肿瘤细胞外泌体功能相关miRNA分子

稳定性：取同一批稻谷，在 0h、2h、4h、6h、8h 各测定一次，计算出叶黄素提取量的RSD为1.22%，表明样品溶液在8h内基本稳定。

骨肉瘤细胞外泌体中的miRNA可被释放到体液(例如血液、尿等)中，这些miRNA可以作为疾病潜在的生物标志物。Liu等[41]通过PCR检测95位骨肉瘤患者和95位健康者的血清发现，骨肉瘤患者的血清中miR-375比健康者低，该指标检测的敏感性和特异性分别为82.1%和74.7%，提示miR-375可作为骨肉瘤诊断的生物标志物。Fujiwara等[42]收集了14位骨肉瘤患者、14例年龄相仿的非骨肉瘤患者以及8位正常人血清，对比研究了以上三类不同人群血清和骨肉瘤细胞中的miR-25-3p和miR-17-5p表达水平变化，结果发现，骨肉瘤细胞能分泌miR-25-3p和miR-17-5p，且骨肉瘤患者血清miR-25-3p表达水平显著高于其他两类对照组人群，该指标(血清miR-25-3p)的特异性和灵敏性(分别为71.4%和92.3%)均要优于传统的碱性磷酸酶检测，这使得血清miR-25-3p成为了骨肉瘤患者肿瘤监测和预后评估的重要无创生物标记。遗憾的是，由于临床样本资源有限，使其在临床骨肉瘤早期治疗中的应用甚少，相信未来大样本的临床研究将为其临床治疗提供理论支撑。因此，外泌体相关的miRNA分子在骨肉瘤早期诊断和治疗中均具有潜在的应用价值。

3.4 纳米靶向治疗相关miRNA分子

随着纳米技术的快速发展，应用纳米颗粒运载miRNA，通过纳米尺寸效应(EPR效应)，实现肿瘤的靶向治疗已成为可能。Zhang等[43]研究发现，miR-199a-3p在骨肉瘤细胞中表达降低，上调其表达能抑制骨肉瘤的生长。因此他们设计并合成了一种脂质修饰的葡聚糖基聚合物纳米粒体系，用以包裹miR-199a-3p分子，实现肿瘤靶向运载和投递，抑制骨肉瘤生长及发展。实验以具有肿瘤抑制效应的miRNA-let-7a作为阳性对照，通过荧光显微镜和real time PCR检测发现，葡聚糖基聚合物纳米粒能将miR-199a-3p和let-7a递送至KHOS和U2OS骨肉瘤细胞内，进一步研究发现，装载有miR-199a-3p的聚合物纳米粒能有效地下调相关靶蛋白的表达，从而抑制骨肉瘤细胞的生长。该研究说明，脂质修饰的葡聚糖基聚合物纳米粒是一种有效的非病毒载体，这种纳米载体可用于递送miRNA分子，具有提高miRNA的靶向作用潜能。因此，结合先进的纳米制备技术以及miRNA分子自身的功能特点，将包被有miRNA的纳米颗粒应用于骨肉瘤的治疗不仅可能，而且是可行的。

4 小结

骨肉瘤是青少年最常见的恶性骨肿瘤，好发于四肢长骨干骺端，临床上易早期复发、血行肺转移，其治疗一般采用大剂量化疗和手术的综合治疗策略。由于诊断技术或者术后预防措施不完善，最终导致治疗不彻底或肿瘤复发。miRNA在骨肉瘤的发生、增殖、侵袭、转移过程中发挥了重要作用。然而当前人们在对miRNA的理论认知和实践应用中仍然存在诸多困难，使其临床应用受到了极大限制：如miRNA序列库的序列误差、RNA提取方法不良、检测分析的多变性、生物信息资料分析的多样性、miRNA临床检验的非标准化等[44]。相信未来随着人们对miRNA分子在骨肉瘤的发生、增殖、侵袭、转移等重要事件中的作用机理的不断深入理解和认识，将为miRNA应用于骨肉瘤的精准治疗和预后评估带来希望。

后现代主义是一种从西方引进的反美思潮，但是它依然是为了表达某种情感和思想，因此它依然属于一种表现的艺术。后现代主义的产生也使得一些年轻的钢琴家的诞生。

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