乳腺癌组织中CCR 9和COX- 2蛋白表达及与乳腺癌患者临床特征的关系研究

乳腺癌是严重威胁女性身心健康的常见恶性肿瘤之一，其发病率逐年增高，并呈年轻化趋势[1-2]。内分泌治疗、化疗、放疗及手术治疗是临床治疗乳腺癌的常用手段[3]。乳腺肿瘤的浸润和转移是影响患者治疗及预后的主要因素。因此，了解乳腺癌发展的分子机制，预测其早期诊断的新指标，对乳腺癌的预防和治疗具有重大意义[4]。趋化因子受体 9（chemokine receptor 9，CCR9）可以通过激活磷脂酰肌醇-3激酶/丝苏氨酸蛋白激酶（phosphatidylinositol-3-kinase/serine-threonine kinase，PI3K/AKT）途径，上调肿瘤细胞抗凋亡蛋白，抑制肿瘤细胞凋亡，促进肿瘤细胞的侵袭、转移[5-6]。环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）能增加基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）活性，促进肿瘤侵袭淋巴结，发生转移[7-8]。CCR9和COX-2在多种肿瘤中均高表达，但在乳腺癌中的表达及相关性少有报道。为寻找最佳乳腺癌诊治标志物，本研究对乳腺癌组织中CCR9和COX-2的表达情况进行分析，旨在探讨CCR9和COX-2表达水平与乳腺癌患者临床特征的关系及其在乳腺癌发展过程的作用，为早期诊断乳腺癌提供依据。

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1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2014年4月至2016年4月宜宾市第一人民医院收治的行手术切除的乳腺癌患者的病历资料，并收集其于医院存档的乳腺标本。纳入标准：①均符合乳腺癌诊断标准；②均经病理学检查确诊为乳腺癌，且均为女性；③术前未行化疗、放疗等治疗；④无其他原发性恶性肿瘤；⑤术后标本保存完整。排除标准：①长期服用糖皮质激素或非甾体类抗炎药物者；②患有严重心、肝、肾等原发性疾病者；③妊娠期或者哺乳期妇女。根据纳入和排除标准，本研究共纳入乳腺癌患者96例，其中取患者的乳腺癌组织标本共96例，取对应的癌旁（距离肿瘤边缘2 cm）正常组织标本共35例。96例乳腺癌患者的年龄为28～67岁，平均年龄（43.63±11.90）岁；肿瘤直径：≤2 cm 25例，＞2 cm 71例；有淋巴结转移52例，无淋巴结转移44例；TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期51例，Ⅲ期27例；雌激素受体（estrogen receptor，ER）：阳性37例，阴性59例；孕激素受体（progestogen receptor，PR）：阳性33例，阴性63例。

1.2 检测方法

采用免疫组化SP法染色，检测乳腺癌组织和癌旁正常组织中CCR9、COX-2蛋白的表达。兔抗人CCR9和COX-2单克隆抗体及SP试剂盒均购自福州迈新生物技术开发有限公司，操作严格遵循试剂盒说明书。

采用SPSS 20.0软件对数据进行分析。计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.3 评价标准

多项研究报道，趋化因子受体及其配体在肿瘤细胞增殖、转移和血管形成等方面发挥着重要作用[14]。CCR9是CC族趋化因子受体，属于G蛋白偶联受体，其唯一配体为CCL25，CCL25/CCR9与肿瘤的发展密切相关[15]。相关研究表明，CCR9在乳腺癌细胞中呈高表达[16]。本研究结果显示，与癌旁正常组织相比，乳腺癌组织中CCR9的阳性表达率较高，并且CCR9的阳性表达与乳腺癌患者的组织分化程度、肿瘤直径、TNM分期和淋巴结转移情况有关。提示CCR9可能是乳腺癌发生过程的调控因子，可诱导乳腺癌淋巴结转移。分析其原因可能为，MMP-2和MMP-9能特异性降解人体细胞外基质的Ⅳ型胶原，促进肿瘤的转移，是临床诊断乳腺癌患者分期和预后的重要指标[17]。乳腺癌组织CCR9的高度表达能诱导PI3K/AKT途径的激活，促进MMP-2和MMP-9蛋白的合成和表达，从而有效加快乳腺癌细胞的侵袭和转移[18]。另外，CCL25与CCR9受体结合后，不仅能下调凋亡蛋白caspase 3表达，抑制乳腺癌细胞的凋亡；还能通过PI3K/AKT途径上调肿瘤细胞中的抗凋亡蛋白，如ERK1/2和GSK-3β的表达，从而增强乳腺肿瘤的存活能力[18]。随着乳腺癌细胞侵袭性增强，CCR9蛋白表达量逐渐增加，能有效诱导PI3K/AKT途径的活化，促进肿瘤细胞侵袭、转移，在乳腺癌发展中扮演着重要的角色。

1.4 统计学分析

这里使用DDR2存放算法的激励,具体内存条型号是MT4HTF3264HY。采用Xilinx的IP核MIG产生DDR2控制器,DDR2控制器经分层处理,可以简化设计并使其模块化[13]。

2 结果

2.1 不同组织中CCR 9、COX- 2蛋白表达情况的比较

低分化、肿瘤直径＞2 cm、TNM分期为Ⅲ期及有淋巴结转移的乳腺癌患者的乳腺癌组织中CCR9和COX-2蛋白的阳性表达率均分别高于中-高分化、肿瘤直径≤2 cm、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期及无淋巴结转移的乳腺癌患者，差异均有统计学意义（P＜0.05）。ER阴性、PR阴性的乳腺癌患者的乳腺癌组织中CCR9和COX-2蛋白的阳性表达率均分别高于ER阳性、PR阳性的乳腺癌患者，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表2）

图1 CCR 9、COX- 2蛋白在乳腺癌组织和癌旁正常组织中的表达情况（免疫组化染色，×100）

2.2 乳腺癌组织中CCR 9、COX- 2蛋白表达的相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，CCR9和COX-2蛋白在乳腺癌组织中的表达呈正相关（r=0.486，P＜0.01）。（表1）

2.3 CCR 9和COX- 2蛋白表达与乳腺癌患者临床特征的关系

免疫组化染色结果显示：CCR9蛋白在细胞膜上呈棕褐色颗粒或弥散到细胞质着色；COX-2蛋白在细胞质中呈现棕黄色颗粒（图1）。乳腺癌组织中CCR9、COX-2蛋白的阳性表达率分别为63.5%（61/96）、52.1%（50/96），均分别高于癌旁正常组织的11.4%（4/35）、17.1%（6/35），差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表1 乳腺癌组织中CCR 9和COX- 2蛋白表达的关系（ n=96）

CCR9阴性阳性合计COX-2阴性28 18 46阳性7 43 50合计35 61 96

表2 不同临床特征乳腺癌患者乳腺癌组织中CCR 9和COX- 2蛋白的表达情况（ n=96）

临床特征分化程度低分化中-高分化肿瘤直径（cm）≤2＞2 TNM分期Ⅰ～ⅡⅢ淋巴结转移例数CCR9阴性[n（%）]阳性[n（%）]χ2值COX-2阴性[n（%）]阳性[n（%）]χ2值13.86 P值＜0.0115.75 P值＜0.01 34 62 4（11.8）31（50.0）30（88.2）31（50.0）7（20.6）39（62.9）27（79.4）23（37.1）11.07＜0.0113.94＜0.01 25 71 16（64.0）19（26.8）9（36.0）52（73.2）20（80.0）26（36.6）5（20.0）45（63.4）5.220.025.030.02 69 27 30（43.5）5（18.5）39（56.5）22（81.5）38（55.1）8（29.6）31（44.9）19（70.4）6.430.014.060.04无有44 52 22（50.0）13（25.0）22（50.0）39（75.0）26（59.1）20（38.5）18（40.9）32（61.5）ER阴性阳性PR阴性阳性0.050.820.280.59 59 37 21（35.6）14（37.8）38（64.4）23（62.2）27（45.8）19（51.4）32（54.2）18（48.6）0.001.000.260.61 63 33 22（34.9）13（39.4）41（65.1）20（60.6）29（46.0）17（51.5）34（54.0）16（48.5）

3 讨论

乳腺癌是女性常见的一种恶性肿瘤，其恶性程度较高，具有高转移性，严重影响着女性患者的生活质量[9]。乳腺癌细胞的侵袭和转移机制极其复杂，其需要先降解细胞外基质，为远处转移提供一条通道，然后再离开原发部位经由通道侵入血管，黏附血管内皮细胞等，进而向邻近或远处组织侵袭[10-11]。乳腺癌的临床治疗目标在于早预防、早诊断、早治疗，从而改善患者的症状，提高患者健康水平[12]。因此，了解乳腺癌发展的分子机制，有助于发现乳腺癌早期诊断的参考指标[13]。CCR9和COX-2在多种人类恶性肿瘤中过表达，本研究主要探讨乳腺癌组织中CCR9和COX-2蛋白的表达情况及其与乳腺癌患者临床特征的关系。

免疫组化结果判定：以细胞膜或细胞质中呈现棕褐色颗粒为CCR9蛋白阳性表达；以细胞质中呈现棕黄色颗粒为COX-2蛋白阳性表达。每个标本选取5～6个高倍镜视野进行染色强度评分：0分，无染色；1分，浅黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。阳性细胞所占比例评分：0分，无阳性细胞或阳性细胞所占比例＜5%；1分，阳性细胞所占比例为5%～25%；2分，阳性细胞所占比例为25%～50%；3分，阳性细胞所占比例≥50%。两项评分相加，总分＜3分为阴性；3～6分为阳性。

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另有研究表明，COX涉及人类多种肿瘤的发生和转移。COX-2是合成前列腺素（prostaglandin，PG）的重要限速酶，正常机体中，COX-2处于低表达水平，在多数组织中难以检测到COX-2，但在肿瘤组织中过度表达，与肿瘤的发展密切相关[19-20]。本研究结果显示，相较于癌旁正常组织，乳腺癌组织中COX-2的阳性表达率较高，并且COX-2的阳性表达与乳腺癌患者的分化程度、肿瘤直径、TNM分期及淋巴结转移情况有关。提示COX-2可能在乳腺癌的发生过程中起着重要作用。分析其原因可能为，COX-2能通过诱导PG合成，促进乳腺癌血管生成和肿瘤细胞增殖，并增强肿瘤细胞的转移能力。另外，COX-2也能够诱导MMP-9合成，降解细胞外基质，促进乳腺癌细胞的侵袭和转移[19]。以上研究表明，COX-2的阳性表达与乳腺癌血管生成、淋巴结转移及肿瘤细胞增殖有关，可为临床乳腺癌的早期诊断提供依据。

进一步分析发现，乳腺癌组织中CCR9和COX-2蛋白的表达呈正相关。COX-2一般情况下处于静息状态，在受到生长因子、内毒素、致炎因子等一定刺激后，才会在炎性反应和致癌过程中发挥重要作用[21]。CCR9是趋化因子受体，属于G蛋白耦联受体，与配体结合后能诱导T淋巴细胞聚集到炎症局部组织，加重炎性反应；还能刺激血管的生成，促进肿瘤细胞的成熟[22]；揭示CCR9可能会通过某种途径诱导COX-2的合成。两者均可能参与乳腺癌的发展。

综上所述，乳腺癌组织中CCR9与COX-2表达呈正相关，两者能协同促进乳腺癌的发展。联合检测乳腺癌组织中CCR9与COX-2蛋白的表达情况，可为有效判断乳腺癌的发生、发展和转移提供参考指标，为临床治疗提供新靶点。

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