关于真菌的文献

丝状真菌即是霉菌；霉菌是丝状真菌的俗称，意即"发霉的真菌"，它们往往能形成分枝繁茂的菌丝体，但又不象蘑菇那样产生大型的子实体。在潮湿温暖的地方，很多物品上长出一些肉眼可见的绒毛状、絮状或蛛网状的菌落，那就是霉菌。由于丝状真菌是一类真菌即霉菌的总称，所以并未确切到谁第一个发现，比如4000年前你的老祖先走路不小心看到一堆长了毛的牛粪，你能说是他发现的么，开个玩笑 呵呵，真菌的发现历史可以列给你看： 真菌是一个古老的生物类群，在泥盆纪（4亿多年前）的第一批化石 植物中，就有腐生和寄生的真菌。中国古代文献记载有黄帝与歧伯讨论醪醴（即酒）、夏代仪狄酿酒、周代杜康制酒的传说，从龙山文化出土的陶器中有盛酒的樽、冲酒的盉、煮酒的斝，这表明中国在新石器时期已经有了酒。宋代陈仁玉所著《菌谱》（1250)描述了食用菌11种，明代潘之恒所著《广菌谱》（1500)描述了食用菌19种。1977年在浙江余姚县河姆渡村进行考古发掘，出土物中就有菌类，这表明在仰韶文化时期（距今6000～7000年），中国人已经采食蘑菇。 　　在1700～1850年间，各国科学家广泛开展对大型真菌的研究，意大利的PA米凯利、荷兰的DCH佩尔松、瑞典的EM弗里斯家族、英国的MJ伯克利、捷克的CJ柯尔达、法国的LR蒂拉纳兄弟等，都对真菌学的发展有重大的贡献。 　　1851～1950年间是近代真菌学全面发展的时期。德国植物学家HA德巴里由于对真菌的系统发育、多型性和生活史的精湛研究而被誉为近代真菌学的奠基人。意大利PA萨卡尔多的巨著《真菌汇刊》是这一时期对真菌分类学的巨大贡献。 　　20世纪50年代以来，现代真菌学飞速发展，如：①研究真菌的细微结构；②应用新技术和新方法；③医学真菌飞跃发展；④出现真菌毒素学；⑤抗癌真菌药物受到重视；⑥创立分子真菌学；⑦发展食用真菌，提出健康食品的名称；⑧改变生物分类法，将真菌独立成界等。 　　20世纪初中国用现代方法研究真菌，1915年胡先骕发表《菌类鉴别法》，为中国真菌鉴定打下了基础。戴芳澜于1927年出版《江苏真菌名录》，于1930年发表南京钓丝壳新种，是中国人用现代方法研究中国真菌的第一个新种。1939年邓叔群出版《中国高等真菌志》；1951年王云章出版《中国锈菌索引》。此外，还有不少植物学家、植物病理学家、工业真菌学家和医学真菌学家，也从事一些有关真菌学的研究。1980年成立中国真菌学会，1982年创刊中国《真菌学报》，现已开始筹编中国真菌志。

药用真菌桑黄液体发酵工艺的研究摘 要 目的：研究不同培养基、不同培养条件对桑黄菌丝生长的影响。方法：通过液体发酵培养，并利用L9(34)正交试验筛选出了桑黄液体发酵的优化培养基。结果与结论：玉米粉为最佳碳源，麸皮为最佳氮源，优化培养基配方为：玉米粉5%、麸皮3%、磷酸二氢钾3%、硫酸镁15%、维生素B1 20μg/100 mL、维生素B2 30μg/100 mL；最适菌丝体生长的液体发酵条件为：培养温度为26 ℃，摇瓶转速130 r/min，pH值5，接种量15%~20%，种子液培养时间为5 d，装液量(500 mL三角瓶)为140 mL，发酵时间为7 d。 关键词 桑黄；药用真菌；液体发酵；菌丝产量 Study on liquid fermentation technology of medicative fungus phellinus igniarius YANG Quan,LI Yan�hui,YAN Han�jing,WANG Qi ( Section of Medical Plant and Pharmacognosy, Guangdong College of Pharmacy, Guangzhou Guangdong 510240; Chendu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chendu,Sichuan 610041; Faculty of Traditional Chinese Medicinal Crops, Jilin Agricultural University, Changchun,Jilin 130118) Abstract AbstractTo study the effects on mycelia by various media and conditions, including shaking culture and L9(34)orthogonal The result showed that corn flourwas the optimalcarbon source andbran is the optimalnitrogen The optimalculture mediumwas: corn flour 5%，bran 3%,KH2PO4 3%,MgSO4 15%,VitB120 μg/100 mL,VitB230 μg/100 mLThe optimalfermented condition was: culture temperature 26 ℃，rotation speed130 r/min, pH 5, inoculationsize 15%～20%,incubation time for seed liquid 5 days, the amount of liquid 140 mL(500 mL canonicalflask), and fermentationtime 7 Key words Phellinus igniarius；medicinal fungus;liquid fermentation; mycelial yield 桑黄Phellinus igniarius(LxF)Quel [1]属于担子菌亚门，多孔菌科的药用真菌。子实体入药，味微苦，能利五脏，排毒，止血，活血；多用于和胃止泻，民间用于治疗淋病，崩漏带下，癖软，脾虚泄泻。热水提取物对小白鼠的肉瘤S-180的抑制率为87%。艾氏腹水癌的抑制率为80%[2]。传统上，桑黄的活性成分多糖是从子实体中提取，但是，受生理生态的特殊性和复杂性以及外部环境条件的制约，在自然界中形成的子实体稀少，人工栽培难度较大，资源匮乏[3]。所以，桑黄的开发和利用也受到限制。为了解决这个难题，本实验对其液体发酵的工艺进行了研究，筛选出适宜菌丝体生长的液体培养基和生长环境。人工培养菌丝体，提取其活性成分多糖，通过药理实验，结果表明菌丝体多糖和子实体多糖具有相同的药理活性。现仅将液体发酵工艺报道如下。 1 材料与方法 1 桑黄菌种 由采自长白山地区的子实体分离获得，经吉林农业大学菌物研究所鉴定。 2 原料 大米粉、土豆、小麦粉、玉米粉、麸皮、黄豆、米糠粉等烘干粉碎过60目筛。 3 药品 葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、蛋白胨、酵母粉、硫酸氨、稀盐酸(ρ=1%)、稀氢氧化钠(ρ=1%)、维生素B1、维生素B2。 4 培养 1 液体摇瓶种子培养基配方 采用通用药用真菌培养基[4]。其组成(ω/%) ：蔗糖 3、蛋白胨0�3、酵母粉2、硫酸氨2、磷酸二氢钾1、硫酸镁05。 2 液体摇瓶种子培养 250 mL摇瓶装液体培养基50 mL，接活化后的斜面母种4块,每块0�5cm2。置旋转式摇床，转速120 r/min，25 ℃震荡培养5 d。即得液体摇瓶种子。 3 二级摇瓶发酵培养 500 mL摇瓶装液体培养基140 mL，接种量20%(液体摇瓶种子种龄5 d)，培养7 d，培养方法同液体摇瓶种子培养。 4 发酵培养基正交实验 采用玉米粉作碳源，麸皮作氮源，磷酸二氢钾、硫酸镁作为矿质元素，按L9(34)设计三水平四因素试验[5]。九个组合，两次重复，采用500 mL摇瓶随机置摇床培养，见表1。表1 L9(34)试验因素及水平(略) 5 测定 发酵液用布氏漏斗过滤后，菌丝体用清水冲洗干净，置60 ℃烘箱烘干至恒重，称量。pH值用pH计测定。菌球大小用测总长度法；菌球密度用平皿划线记数法。 2 结果与分析 1 培养基成分对菌丝产量的影响 1 液体培养基中碳源的确定 碳素是真菌最重要的营养，它不仅是碳水化合物和蛋白质的基本组成元素，同时，又是重要的能量来源[4]。选择10种常见的原料作碳源比较，见表2，试验浓度2%。碳源试验培养基其他组分：蛋白胨1%，磷酸二氢钾1%，硫酸镁05%，维生素B1 20μg/100 mL，维生素B2 30μg/100 mL。 氮源试验培养基其他组分：葡萄糖3%，磷酸二氢钾1%，硫酸镁05%，维生素B1 20μg/100 mL，维生素B2 30μg/100 mL。从表2可知桑黄对碳的利用相当广泛，对单糖、寡糖、多糖均可利用。而以大米粉的浸出汁做碳源最好，其次是小麦粉、玉米粉，但是，三者的桑黄菌丝体的产量相差不多。玉米粉来源容易，且成本低，所以本试验选用玉米粉做碳源。表2 不同碳源对菌丝产量的影响(略) 2 液体培养基中氮源的确定 氮素是真菌合成蛋白质、核酸的必要原料，对菌丝的生长发育至关重要。我们选择6种原料作氮源比较，试验浓度为2%，结果表明不同的氮源对菌丝体生长有明显的差异，麸皮作氮源显著好于其他原料。且麸皮成本低、来源广，所以本试验选麸皮做氮源，如表3。表3 不同氮源对菌丝产量的影响(略) 3 液体培养基中矿物质元素的确定 据资料报道[6]，液体培养基中缺乏P、S、K、Mg，菌丝体生长发育不良，菌丝体产量低。但这四种元素对菌丝体生长作用大小不存在显著差异。同等重要，因此本实验选取常用的磷酸二氢钾和硫酸镁作矿质元素添加。 4 维生素用量的确定 据资料报道[6]真菌是维生素B1、维生素B2的天然缺陷型，必须外界添加才能生长良好。维生素B1 、维生素B2对真菌的生长相当重要，他们以一种辅酶的形式存在，对菌丝的生长起促进的作用。而他们的需要量甚少，培养基的适宜浓度为10~40 μg/100 mL。根据本试验结果，在液体培养基中维生素B1的用量20μg/100 mL，维生素B2用量30μg/100 mL时，菌丝体的产量最高。 5 优化培养基配方的确定 综合上述实验结果，又考虑原料来源及成本价格，选用玉米粉作碳源，麸皮作氮源；选用磷酸二氢钾和硫酸镁作矿质元素，进行L9(34)正交试验,结果见表4。采用直观分析法分析正交试验结果，从9组试验的菌丝产量来看第六组试验的菌丝产量最高达到47 g/100 mL。较优的组合是A2B3C1D2。而经方差计算所得的较优组合是A2B3C3D2，于是将未做试验的A2B3C3D2的组合和已做过试验的A2B3C1D2的组合进行对比试验，2次重复，测定菌丝干重，试验的结果是A2B3C3D2组合的菌丝产量最高，达到58 g/100 mL。所以确定了桑黄的液体深层发酵的培养基配方为：玉米粉5%、麸皮3%、磷酸二氢钾3%、硫酸镁15%、维生素B1 20μg/100 mL、维生素B2 30μg/100 mL。表4 各组分正交试验结果(略) 2 液体发酵条件对菌丝产量的影响 1 液体种子培养时间对菌丝产量的影响 进行二级摇瓶发酵培养7 d后，测菌丝产量。从菌丝体的产量可以看出，培养5 d的液体种子最适宜接种，菌丝产量最高。同时，观察了培养5 d的液体种子，培养5 d时开始形成大量均匀的菌丝球，表面具放射状小刺，镜检菌丝，有大量的锁状联合，此时菌丝生长正处于增殖期，适宜接种。见图1。 2 培养温度对菌丝产量的影响 在影响菌丝生长发育的各种物理因素中，温度是最重要的一个因素[7]。本试验设计6个温度梯度进行发酵培养，从菌丝的产量可以看出，26 ℃的发酵培养菌丝产量最高。见图2。 3 培养基起始pH值对菌丝产量的影响 液体培养基作为菌丝体生活的外部环境，pH值的高低直接影响菌丝体的新陈代谢。据报道[8，9]，真菌喜欢在偏酸的环境下生长。本实验设计几个pH梯度进行液体培养，从菌丝的产量来看，pH5~5之间适宜菌丝的生长，而pH5的环境下菌体产量最高，见图3。 4 摇瓶装液量对菌丝产量的影响 500 mL三角瓶装液量120~160 mL时,菌丝产量较理想，而装液量140 mL最高，说明装液量过多影响了菌丝体的好氧需求，从而影响菌丝的产量。而装液量过少菌丝体所能吸收利用的营养不足而影响菌丝的产量。见图4。 5 摇瓶转速对菌丝产量的影响 在转速为130 r/min时，菌丝产量最高。转速慢，培养基内的溶解氧少，菌球过大，而菌球中间的菌丝处于饥饿状态，影响菌丝的生长。致使菌丝的生物量降低。转速过快摇瓶内的机械刺激过于强烈，也影响菌丝的生长。同时转速过高，还容易引起培养液的飞溅，弄湿棉塞，引起污染。见图5。 6 接种量对菌丝产量的影响 以菌丝体干重计，接种量以15%~20%为宜。接种量少，接入的小菌球就少，所形成的大菌球相对就少，随之，菌丝体的产量就少。接种量过多时，小菌球的数量过多，导致培养基内缺氧及培养基内营养成分迅速被消耗，菌丝体无法很好的生长，而影响菌丝体的产量。见图6。 7 发酵时间对菌丝产量的影响 桑黄菌丝体发酵时间7 d，菌丝体长势最好，产量最高。在初期生长比较缓慢，随着发酵进程的不断深入，菌丝体生长越来越旺盛，到第7天菌丝体产量达到最高峰，之后生长趋于稳定。到第9天菌丝出现自溶现象，生物量有所下降。见表5。表5 发酵时间对菌丝产量的影响 3 讨 论 1 摇瓶培养过程中的污染率的控制。一旦发现发酵液有杂菌污染，会造成物力、人力、时间的浪费。发酵液被杂菌污染时，培养液变得混浊，味酸臭，所以降低污染的几率也是试验成败的关键之一。培养基灭菌时要彻底，液体培养基灭菌时一定要严格掌握灭菌程序，时间过长或温度过高都会破坏培养基的营养成分。灭菌时间不足，压力、温度未达到要求，而导致灭菌不彻底都会污染。接种时超净工作台要先打开至少30 min，另外接种过程要严密，动作要稳、准、快，否则污染几率要大大增加。 2 在摇瓶培养过程中，振荡频率对菌丝体的生长也有很大的影响。振荡频率过慢菌球形成数量少，导致单个菌球长势过大，菌球中间出现中空状态，而且出现菌丝体自溶现象，另一方面培养基内的溶解氧减少影响菌丝生长，结果菌丝体产量降低。振荡频率过快，培养基容易飞溅到棉塞上引起污染，造成不必要的人力、物力等的浪费。 3 用正交实验方法筛选出了菌丝体生长发育的浓度和培养基的配方。适合桑黄菌丝体发酵培养的培养基配方为：玉米粉5%，麸皮3%，磷酸二氢钾3%、硫酸镁15%，维生素B1 20μg/100 mL 、维生素B2 30μg/100 mL；最适合菌丝体生长发育的理化因子为：摇瓶发酵的适宜温度为26 ℃，摇瓶转数为130 r/min，pH值为5，接种量15%~20%，摇瓶装液量为500 mL装140 mL，发酵时间为7 d，液体种子的培养时间为5 d。 4 本实验的结果表明利用液体发酵技术，不仅能在短期内能获得大量的桑黄的菌丝体，而且周期短，不受季节和环境的限制。为工业化生产菌丝体提供了依据。为进一步研究其发酵液的生物活性奠定了基础，且可以大幅度地降低桑黄作为新药开发的成本。所以采用液体发酵技术生产桑黄菌丝体将是一种重要的方法，具有广阔的前景。 参考文献 [1]卯晓岚中国经济真菌[M]北京：科学出版社, [2]卯晓岚,蒋长坪西藏大型经济真菌 [M]北京:科学技术出版社, [3]李国俊，吴国用，崔基成,等裂蹄目层孔菌菌丝培养及其应用研究[J]中国食用菌,1998，17(5): [4]徐锦堂中国药用真菌学[M]北京：北京协和医科大学, 235- [5]盛骤线性代数与数理统计[M]吉林：吉林科技出版社,293- [6]向世华食用真菌的营养生理[J]中国食用菌,1990,9(6): [7]乐银，邵伟，刘庆刚,等猴头菌液体发酵条件的研究[J]中国食用菌,1998,18 (3): [8]刘锡,白金剀,译 真菌学基础[M]北京:科学出版社出版, 3- [9]尉晓宇食用菌酶学应用研究[J]中国食用菌, 1990，9(5): 广东药学院 药用植物与生药学教研室 广东 广州 510240； 中国科学院成都生物研究所 四川成都 610041； 吉林农业大学中药材学院 吉林 长春 130118 本课题由吉林省科技厅资助(No20000327)。 研究方向：药用真菌多糖活性研究