药用真菌桑黄液体发酵工艺的研究摘 要 目的：研究不同培养基、不同培养条件对桑黄菌丝生长的影响。方法：通过液体发酵培养，并利用L9(34)正交试验筛选出了桑黄液体发酵的优化培养基。结果与结论：玉米粉为最佳碳源，麸皮为最佳氮源，优化培养基配方为：玉米粉5%、麸皮3%、磷酸二氢钾3%、硫酸镁15%、维生素B1 20μg/100 mL、维生素B2 30μg/100 mL；最适菌丝体生长的液体发酵条件为：培养温度为26 ℃，摇瓶转速130 r/min，pH值5，接种量15%~20%，种子液培养时间为5 d，装液量(500 mL三角瓶)为140 mL，发酵时间为7 d。 关键词 桑黄；药用真菌；液体发酵；菌丝产量 Study on liquid fermentation technology of medicative fungus phellinus igniarius YANG Quan,LI Yan�hui,YAN Han�jing,WANG Qi ( Section of Medical Plant and Pharmacognosy, Guangdong College of Pharmacy, Guangzhou Guangdong 510240; Chendu Institute of Biology, Chinese Academy of Sciences, Chendu,Sichuan 610041; Faculty of Traditional Chinese Medicinal Crops, Jilin Agricultural University, Changchun,Jilin 130118) Abstract AbstractTo study the effects on mycelia by various media and conditions, including shaking culture and L9(34)orthogonal The result showed that corn flourwas the optimalcarbon source andbran is the optimalnitrogen The optimalculture mediumwas: corn flour 5%，bran 3%,KH2PO4 3%,MgSO4 15%,VitB120 μg/100 mL,VitB230 μg/100 mLThe optimalfermented condition was: culture temperature 26 ℃，rotation speed130 r/min, pH 5, inoculationsize 15%～20%,incubation time for seed liquid 5 days, the amount of liquid 140 mL(500 mL canonicalflask), and fermentationtime 7 Key words Phellinus igniarius；medicinal fungus;liquid fermentation; mycelial yield 桑黄Phellinus igniarius(LxF)Quel [1]属于担子菌亚门，多孔菌科的药用真菌。子实体入药，味微苦，能利五脏，排毒，止血，活血；多用于和胃止泻，民间用于治疗淋病，崩漏带下，癖软，脾虚泄泻。热水提取物对小白鼠的肉瘤S-180的抑制率为87%。艾氏腹水癌的抑制率为80%[2]。传统上，桑黄的活性成分多糖是从子实体中提取，但是，受生理生态的特殊性和复杂性以及外部环境条件的制约，在自然界中形成的子实体稀少，人工栽培难度较大，资源匮乏[3]。所以，桑黄的开发和利用也受到限制。为了解决这个难题，本实验对其液体发酵的工艺进行了研究，筛选出适宜菌丝体生长的液体培养基和生长环境。人工培养菌丝体，提取其活性成分多糖，通过药理实验，结果表明菌丝体多糖和子实体多糖具有相同的药理活性。现仅将液体发酵工艺报道如下。 1 材料与方法 1 桑黄菌种 由采自长白山地区的子实体分离获得，经吉林农业大学菌物研究所鉴定。 2 原料 大米粉、土豆、小麦粉、玉米粉、麸皮、黄豆、米糠粉等烘干粉碎过60目筛。 3 药品 葡萄糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂、蛋白胨、酵母粉、硫酸氨、稀盐酸(ρ=1%)、稀氢氧化钠(ρ=1%)、维生素B1、维生素B2。 4 培养 1 液体摇瓶种子培养基配方 采用通用药用真菌培养基[4]。其组成(ω/%) ：蔗糖 3、蛋白胨0�3、酵母粉2、硫酸氨2、磷酸二氢钾1、硫酸镁05。 2 液体摇瓶种子培养 250 mL摇瓶装液体培养基50 mL，接活化后的斜面母种4块,每块0�5cm2。置旋转式摇床，转速120 r/min，25 ℃震荡培养5 d。即得液体摇瓶种子。 3 二级摇瓶发酵培养 500 mL摇瓶装液体培养基140 mL，接种量20%(液体摇瓶种子种龄5 d)，培养7 d，培养方法同液体摇瓶种子培养。 4 发酵培养基正交实验 采用玉米粉作碳源，麸皮作氮源，磷酸二氢钾、硫酸镁作为矿质元素，按L9(34)设计三水平四因素试验[5]。九个组合，两次重复，采用500 mL摇瓶随机置摇床培养，见表1。表1 L9(34)试验因素及水平(略) 5 测定 发酵液用布氏漏斗过滤后，菌丝体用清水冲洗干净，置60 ℃烘箱烘干至恒重，称量。pH值用pH计测定。菌球大小用测总长度法；菌球密度用平皿划线记数法。 2 结果与分析 1 培养基成分对菌丝产量的影响 1 液体培养基中碳源的确定 碳素是真菌最重要的营养，它不仅是碳水化合物和蛋白质的基本组成元素，同时，又是重要的能量来源[4]。选择10种常见的原料作碳源比较，见表2，试验浓度2%。碳源试验培养基其他组分：蛋白胨1%，磷酸二氢钾1%，硫酸镁05%，维生素B1 20μg/100 mL，维生素B2 30μg/100 mL。 氮源试验培养基其他组分：葡萄糖3%，磷酸二氢钾1%，硫酸镁05%，维生素B1 20μg/100 mL，维生素B2 30μg/100 mL。从表2可知桑黄对碳的利用相当广泛，对单糖、寡糖、多糖均可利用。而以大米粉的浸出汁做碳源最好，其次是小麦粉、玉米粉，但是，三者的桑黄菌丝体的产量相差不多。玉米粉来源容易，且成本低，所以本试验选用玉米粉做碳源。表2 不同碳源对菌丝产量的影响(略) 2 液体培养基中氮源的确定 氮素是真菌合成蛋白质、核酸的必要原料，对菌丝的生长发育至关重要。我们选择6种原料作氮源比较，试验浓度为2%，结果表明不同的氮源对菌丝体生长有明显的差异，麸皮作氮源显著好于其他原料。且麸皮成本低、来源广，所以本试验选麸皮做氮源，如表3。表3 不同氮源对菌丝产量的影响(略) 3 液体培养基中矿物质元素的确定 据资料报道[6]，液体培养基中缺乏P、S、K、Mg，菌丝体生长发育不良，菌丝体产量低。但这四种元素对菌丝体生长作用大小不存在显著差异。同等重要，因此本实验选取常用的磷酸二氢钾和硫酸镁作矿质元素添加。 4 维生素用量的确定 据资料报道[6]真菌是维生素B1、维生素B2的天然缺陷型，必须外界添加才能生长良好。维生素B1 、维生素B2对真菌的生长相当重要，他们以一种辅酶的形式存在，对菌丝的生长起促进的作用。而他们的需要量甚少，培养基的适宜浓度为10~40 μg/100 mL。根据本试验结果，在液体培养基中维生素B1的用量20μg/100 mL，维生素B2用量30μg/100 mL时，菌丝体的产量最高。 5 优化培养基配方的确定 综合上述实验结果，又考虑原料来源及成本价格，选用玉米粉作碳源，麸皮作氮源；选用磷酸二氢钾和硫酸镁作矿质元素，进行L9(34)正交试验,结果见表4。采用直观分析法分析正交试验结果，从9组试验的菌丝产量来看第六组试验的菌丝产量最高达到47 g/100 mL。较优的组合是A2B3C1D2。而经方差计算所得的较优组合是A2B3C3D2，于是将未做试验的A2B3C3D2的组合和已做过试验的A2B3C1D2的组合进行对比试验，2次重复，测定菌丝干重，试验的结果是A2B3C3D2组合的菌丝产量最高，达到58 g/100 mL。所以确定了桑黄的液体深层发酵的培养基配方为：玉米粉5%、麸皮3%、磷酸二氢钾3%、硫酸镁15%、维生素B1 20μg/100 mL、维生素B2 30μg/100 mL。表4 各组分正交试验结果(略) 2 液体发酵条件对菌丝产量的影响 1 液体种子培养时间对菌丝产量的影响 进行二级摇瓶发酵培养7 d后，测菌丝产量。从菌丝体的产量可以看出，培养5 d的液体种子最适宜接种，菌丝产量最高。同时，观察了培养5 d的液体种子，培养5 d时开始形成大量均匀的菌丝球，表面具放射状小刺，镜检菌丝，有大量的锁状联合，此时菌丝生长正处于增殖期，适宜接种。见图1。 2 培养温度对菌丝产量的影响 在影响菌丝生长发育的各种物理因素中，温度是最重要的一个因素[7]。本试验设计6个温度梯度进行发酵培养，从菌丝的产量可以看出，26 ℃的发酵培养菌丝产量最高。见图2。 3 培养基起始pH值对菌丝产量的影响 液体培养基作为菌丝体生活的外部环境，pH值的高低直接影响菌丝体的新陈代谢。据报道[8，9]，真菌喜欢在偏酸的环境下生长。本实验设计几个pH梯度进行液体培养，从菌丝的产量来看，pH5~5之间适宜菌丝的生长，而pH5的环境下菌体产量最高，见图3。 4 摇瓶装液量对菌丝产量的影响 500 mL三角瓶装液量120~160 mL时,菌丝产量较理想，而装液量140 mL最高，说明装液量过多影响了菌丝体的好氧需求，从而影响菌丝的产量。而装液量过少菌丝体所能吸收利用的营养不足而影响菌丝的产量。见图4。 5 摇瓶转速对菌丝产量的影响 在转速为130 r/min时，菌丝产量最高。转速慢，培养基内的溶解氧少，菌球过大，而菌球中间的菌丝处于饥饿状态，影响菌丝的生长。致使菌丝的生物量降低。转速过快摇瓶内的机械刺激过于强烈，也影响菌丝的生长。同时转速过高，还容易引起培养液的飞溅，弄湿棉塞，引起污染。见图5。 6 接种量对菌丝产量的影响 以菌丝体干重计，接种量以15%~20%为宜。接种量少，接入的小菌球就少，所形成的大菌球相对就少，随之，菌丝体的产量就少。接种量过多时，小菌球的数量过多，导致培养基内缺氧及培养基内营养成分迅速被消耗，菌丝体无法很好的生长，而影响菌丝体的产量。见图6。 7 发酵时间对菌丝产量的影响 桑黄菌丝体发酵时间7 d，菌丝体长势最好，产量最高。在初期生长比较缓慢，随着发酵进程的不断深入，菌丝体生长越来越旺盛，到第7天菌丝体产量达到最高峰，之后生长趋于稳定。到第9天菌丝出现自溶现象，生物量有所下降。见表5。表5 发酵时间对菌丝产量的影响 3 讨 论 1 摇瓶培养过程中的污染率的控制。一旦发现发酵液有杂菌污染，会造成物力、人力、时间的浪费。发酵液被杂菌污染时，培养液变得混浊，味酸臭，所以降低污染的几率也是试验成败的关键之一。培养基灭菌时要彻底，液体培养基灭菌时一定要严格掌握灭菌程序，时间过长或温度过高都会破坏培养基的营养成分。灭菌时间不足，压力、温度未达到要求，而导致灭菌不彻底都会污染。接种时超净工作台要先打开至少30 min，另外接种过程要严密，动作要稳、准、快，否则污染几率要大大增加。 2 在摇瓶培养过程中，振荡频率对菌丝体的生长也有很大的影响。振荡频率过慢菌球形成数量少，导致单个菌球长势过大，菌球中间出现中空状态，而且出现菌丝体自溶现象，另一方面培养基内的溶解氧减少影响菌丝生长，结果菌丝体产量降低。振荡频率过快，培养基容易飞溅到棉塞上引起污染，造成不必要的人力、物力等的浪费。 3 用正交实验方法筛选出了菌丝体生长发育的浓度和培养基的配方。适合桑黄菌丝体发酵培养的培养基配方为：玉米粉5%，麸皮3%，磷酸二氢钾3%、硫酸镁15%，维生素B1 20μg/100 mL 、维生素B2 30μg/100 mL；最适合菌丝体生长发育的理化因子为：摇瓶发酵的适宜温度为26 ℃，摇瓶转数为130 r/min，pH值为5，接种量15%~20%，摇瓶装液量为500 mL装140 mL，发酵时间为7 d，液体种子的培养时间为5 d。 4 本实验的结果表明利用液体发酵技术，不仅能在短期内能获得大量的桑黄的菌丝体，而且周期短，不受季节和环境的限制。为工业化生产菌丝体提供了依据。为进一步研究其发酵液的生物活性奠定了基础，且可以大幅度地降低桑黄作为新药开发的成本。所以采用液体发酵技术生产桑黄菌丝体将是一种重要的方法，具有广阔的前景。 参考文献 [1]卯晓岚中国经济真菌[M]北京：科学出版社, [2]卯晓岚,蒋长坪西藏大型经济真菌 [M]北京:科学技术出版社, [3]李国俊，吴国用，崔基成,等裂蹄目层孔菌菌丝培养及其应用研究[J]中国食用菌,1998，17(5): [4]徐锦堂中国药用真菌学[M]北京：北京协和医科大学, 235- [5]盛骤线性代数与数理统计[M]吉林：吉林科技出版社,293- [6]向世华食用真菌的营养生理[J]中国食用菌,1990,9(6): [7]乐银，邵伟，刘庆刚,等猴头菌液体发酵条件的研究[J]中国食用菌,1998,18 (3): [8]刘锡,白金剀,译 真菌学基础[M]北京:科学出版社出版, 3- [9]尉晓宇食用菌酶学应用研究[J]中国食用菌, 1990，9(5): 广东药学院 药用植物与生药学教研室 广东 广州 510240； 中国科学院成都生物研究所 四川成都 610041； 吉林农业大学中药材学院 吉林 长春 130118 本课题由吉林省科技厅资助(No20000327)。 研究方向：药用真菌多糖活性研究
我国的早期历史文献中，也记述了关于食用菌的栽培。2000多年前的《吕氏春秋》中，就载有“味之美者，越骆之菌”。南北朝时期贾思勰的《齐民要术》“素食篇”中详细介绍了木耳菹的做法。唐代苏恭等人著的《唐本草注》中记载了“煮浆粥安诸木上，以草覆之，即生蕈尔”的原始木耳栽培的方法。韩鄂编的《四时纂要》中，则比较详细地叙述了用烂构木及树叶埋在畦床上栽培构菌的方法：用烂构木及叶埋于地中，常浇以米泔水，经两三天即可长出构菌；或于畦中施烂粪，取六七尺的构木段，截断捶碎，均匀地撒于畦中，覆土。常浇水保持湿润。见有小菌长出，用耙背推碎。再长出小菌，再推碎。如此反复三次，即可长出大菌，可以采食了。《四时纂要》还对菌的种植、管理、采收、于藏以及菌的有无毒性，能否食用，作了具体叙述。段成式写的《酉阳杂俎》中，有关于竹荪的描述。并说它只有帝王才能享用。在记载大型真菌的许多古籍之中，比较重要的是：宋代《菌谱》描述了食用菌11种；明代《广菌谱》描述了食用菌19种；清代《吴蕈谱》描述了26种。
我哩个擦
在记载大型真菌的许多古籍之中，比较重要的是:宋代《菌谱》描述了食用菌11种;明代《广菌谱》描述了食用菌19种;清代《吴蕈谱》描述了26种｡《菌谱》是南宋学者陈仁玉撰｡是世界上现存最早的食用菌专著｡书中论述了浙江省台州所产合蕈､稠膏蕈､栗壳蕈､松蕈､竹蕈､麦蕈､玉蕈､黄蕈､紫蕈､四季蕈､鹅膏蕈11种菇的产区､性味､形状､品级､生长及采摘时间｡书后附有毒菌的解毒方法，即“以苦茗､白矾匀新水咽之”｡南宋时期，台州的菌号称上等美味｡比如当时朝廷中右丞相谢深甫家族，皆喜爱台州这种鲜美的特产｡由于当时朝廷上下对台菌的酷嗜，入山采摘的人络绎不绝｡陈仁玉认为对于这种珍贵的土特产，很有辨识的必要｡因此，他经过长期的观察､研究､品尝，“欲尽菌之性，而究其用，第其品”，后来写成了《菌谱》一书｡可以说，《菌谱》就是陈仁玉对家乡所产食用菌的调查记述｡《菌谱》中还对菌的生长条件，作了详细的记载，认为“芝菌皆气茁也”｡也就是说，需要有一个气候､温度､湿度均适宜的生长环境｡陈仁玉的《菌谱》，不仅是世界上现存最早的食用菌的专著，还开创了我国菌类植物学的先河｡在陈仁玉《菌谱》问世之后，我国历史上比较著名的菌类专谱还有明代潘之恒《广菌谱》，清代吴林《吴蕈谱》等｡明代潘之恒在宋代陈仁玉著的《菌谱》的基础上编写了《广菌谱》，收录各种蘑菇40余种，把云南､安徽､广西､湖南､山东､江西等省出产的19种食用菌作了介绍｡《广菌谱》，实际上是对《菌谱》的补充，它所记载的12个品种蘑菇均为《菌谱》所未载｡此外，它所载的品种不限于某一地域，而且内容更为详尽｡清代吴林《吴蕈谱》1卷，为《赐砚堂丛书新编》､《昭代丛书》和《农学丛书》所收录，是继南宋陈仁玉《菌谱》､明代潘之恒《广菌谱》之后的又一种我国古代大型真菌专著｡吴林在《吴覃谱》中概述了吴中当时所产大型真菌的种类及其特点，并根据菌类食用的优劣性，将26种食用真菌分为上､中､下三品，分别进行了研究，同时对非食用真菌也作了详细论述，其中包括毒菌｡书中除引用前人的部分资料外，作者亲自作了许多研究工作｡通过与《菌谱》和《广菌谱》比较发现，《吴蕈谱》记录的大型真菌数量最多，描写也最为细致，是三谱之中成就最高的｡
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细菌,真菌都是菌类!
随着生活水平的逐渐提高，人们的卫生防病意识也在不断加强。大多数人知道细菌可以导致疾病，并习惯用“有病菌”或“有细菌”来形容一个脏的环境或物品。那么，真菌又是怎么回事，是细菌的一种吗?的确，真菌也很微小，也能使人生病，但它和细菌有着本质的区别。 我们知道，植物和动物都是由细胞组成的，细胞内都有细胞核。而微生物中只有真菌具有真正的细胞核和完整的细胞器，故又称真核细胞型微生物；细菌仅有原始核结构，无核膜和核仁，细胞器很少，属于原核细胞型微生物；而病毒则没有细胞结构，属于原生微生物。 真菌在自然界中分布极广，有十万多种，其中能引起人或动物感染的仅占极少部分，约300种。很多真菌对人类是有益的，如面粉发酵，做酱油、醋、酒和霉豆腐等都要用真菌来发酵。工业上许多酶制剂、农业上的饲料发酵都离不开真菌。许多真菌还可食用，如蘑菇、银耳、香菇、木耳等。真菌还是医药事业中的宝贵资源，有的可以用于生产抗生素和维生素以及酶类；有的本身就可以入药用于医治疾病，如中药马勃、茯苓、冬虫夏草等。 真菌还可引起动、植物和人类的多种疾病，在人类主要有三种类型：①真菌感染；②变态反应性疾病；③中毒性疾病。
细菌与真菌与人类和自然界的一切生物是相互依存的，从人类健康的角度看，可以将细菌和真菌简单的分为病原微生物和有益菌，病源微生物是可以引起疾病的微生物，但也非绝对的，人体大量存在的正常菌群，当菌群失调时就会致病，有益菌就是对人体有益的细菌，比如肠道存在的细菌，可以产生维生素K，比如乳酸杆菌等都是人体必须的，真菌就比较好理解，一般致病的如黄曲霉菌，白色念珠菌等，有益菌如冬虫夏草，酵母菌，灵芝菌等。自然界有益菌远多于病原菌，但它在不同的环境条件下可以相互转化。 细菌是危害人体的一个小的不能再小的东西了，但它的危害极大呢，呵呵细菌与真菌与人类和自然界的一切生物是相互依存的，从人类健康的角度看，可以将细菌和真菌简单的分为病原微生物和有益菌，病源微生物是可以引起疾病的微生物，但也非绝对的，人体大量存在的正常菌群，当菌群失调时就会致病，有益菌就是对人体有益的细菌，比如肠道存在的细菌，可以产生维生素K，比如乳酸杆菌等都是人体必须的，真菌就比较好理解，一般致病的如黄曲霉菌，白色念珠菌等，有益菌如冬虫夏草，酵母菌，灵芝菌等。自然界有益菌远多于病原菌，但它在不同的环境条件下可以相互转化。 希望对你有帮助。
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我国的早期历史文献中，也记述了关于食用菌的栽培。2000多年前的《吕氏春秋》中，就载有“味之美者，越骆之菌”。南北朝时期贾思勰的《齐民要术》“素食篇”中详细介绍了木耳菹的做法。唐代苏恭等人著的《唐本草注》中记载了“煮浆粥安诸木上，以草覆之，即生蕈尔”的原始木耳栽培的方法。韩鄂编的《四时纂要》中，则比较详细地叙述了用烂构木及树叶埋在畦床上栽培构菌的方法：用烂构木及叶埋于地中，常浇以米泔水，经两三天即可长出构菌；或于畦中施烂粪，取六七尺的构木段，截断捶碎，均匀地撒于畦中，覆土。常浇水保持湿润。见有小菌长出，用耙背推碎。再长出小菌，再推碎。如此反复三次，即可长出大菌，可以采食了。《四时纂要》还对菌的种植、管理、采收、于藏以及菌的有无毒性，能否食用，作了具体叙述。段成式写的《酉阳杂俎》中，有关于竹荪的描述。并说它只有帝王才能享用。在记载大型真菌的许多古籍之中，比较重要的是：宋代《菌谱》描述了食用菌11种；明代《广菌谱》描述了食用菌19种；清代《吴蕈谱》描述了26种。
我国在认识和利用真菌方面有着悠久的历史。根据历史文献记载，早在两千多年以前，蘑菇、木耳等真菌已成为我国人民所喜爱的食品，茯苓、灵芝也早已成为广泛应用的重要药材。在距今1300多年前的唐朝，就有了关于栽培食用菌的记载；而根据日本江户时代的《温故斋王端编》记载，日本的香菇栽培技术就是从中国流传过去的。草菇栽培技术也是早些年经华侨先带到了当时的马来亚，后又在东南亚和北非一带广泛传播开来的。结果，草菇成了热带和亚热带地区备受人们钟爱的蔬菜品种，在国外获得了“中国菇”的美称。这些都是我国人民对食用菌栽培技术所做的巨大贡献。