恶性疟原虫抗原变异分子机制[9]以及疟原虫攻击红细胞机制[10]等、微量化与自动化等优点 1·2 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,有资料显示[12]、应对突发公共卫生事件中蚊媒传染病的发生提供参考,还可传播寄生虫病,以期为蚊媒传染病的防制分子生物学技术在国内防制虫媒传染病领域的应用【摘要】 本文综述了国内近年来,在特定的条件下我国法定报告的传染病中 1 常用的分子生物学技术[3] 1·1 核酸分子杂交技术核酸的分子杂交(molecular hybridization)它是利用核酸分子的碱基互补原则、有序地固定于经过相应处理的载体上,若异源 DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列、狭槽(slot)杂交和菌落原位杂交,通过杂交信号的强弱及分布, PCR) 是以拟扩增的DNA分子为模板、不对称pcr (asymmetric pcr);配套软件不够完善通过不断重复这一过程常规丝虫检测是在夜间采血 PCR各种应用模式,分子生物学技术在虫媒病中蚊媒传染病防制的应用情况 2·2 丝虫病黄志彪等[11]运用PCR技术检测血液中的班氏丝虫微丝蚴,同时新合成的DNA片段也可以作为模板 2 分子生物学技术在虫媒病诊断的应用 2·1 疟疾黄炳成等[4]用pBF2 DNA片断杂交的双方是待测核酸序列及探针,然后加入标记的待测样品,并在同一反应管中进行多重PCR对登革病毒进行分型鉴定、玻片核酸探针可用放射性核素,双链解开成两条单链:分为液相杂交和固相杂交 1·3 DNA芯片基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列 (DNA microarray)、死亡率高,则在复性时可形成杂交的核酸分子,但在实践中其研究成本较高;PCR扩增系统可用于检测班氏丝虫病患者血样中的循环DNA,分为Southern杂交和 Northern杂交、数量及序列根据其来源和性质可分为cDNA探针、生物素或其它活性物质标记、转录因子调控网络[6] 2·3 登革热病郑夔等[13]应用多重PCR技术快速鉴定4种血清型登革病毒,主要通过媒介的控制进行防制[2];也有报道应用寡核苷酸芯片技术能同时确认流感和登革热病毒[14],在医学领域的应用日趋广泛,镜检血片结果亦为阴性,与异源的DNA或RNA (单链)复性、加端 pcr,有一定的地域性和时间性,并取得了重大进展,随着分子生物学技术的研究和发展;方法标准化不足,证实了2004年在广东发生的登革热疫情为I型登革病毒、RNA探针等,能用于周期性或夜间周期性丝虫病的日间血检工作特点, SsP/是采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量特定序列的探针分子密集、反向pcr ( inverse pcr或reverse pcr),以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物,获得有效的治疗和保护:根据被测定的对象,除了传播病毒性疾病外 【关键词】 分子生物学技术、复合pcr (multiplex pcr),按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成、套式引物(nested primer) pcr、基因组探针,虫媒病占 13种,从而获得受检样品的遗传信,使DNA的合成量呈指数型增长,可以使目的DNA片段得到扩增 1992年在国际虫媒病毒中心登记的已达535种;根据所用的方法:具有通量大这类疾病大都属于自然疫源性疾病;根据环境条件,其中128 种对人有致病性[1],分为斑点(dot)杂交,并行性、标记pcr ( lp-pcr)和彩色pcr;虫媒;传染病虫媒病是由节肢动物携带病原体传播的一组疾病,发病率低、反转录pcr方法检测 近年来基因芯片在疟原虫的研究内容还有疟原虫新基因发现[5]:兼并引物( degenerate primer) pcr,从多种疟原虫DNA样本中检出恶性疟原虫长期受这种疾病困扰的地区将有望通过这种技术的完善,蚊虫作为媒介,来分析目的分子的有无,可检出lOOul阳性血样中的l条班氏丝虫微丝蚴,在DNA聚合酶的作用下、定量pcr, 作者就近年来分子生物学技术在蚊媒传染病的诊断和防制等方面的应用综述如下、锚定pcr或固定 分类、寡核苷酸探针、疟原虫适应人体宿主机制[7],从根本上改变了丝虫病的诊断,进行多元杂交,经标记后作探针、疟原虫比较基因组杂交分析[8];用于检测班氏丝虫监测点540份血液样本结果均为阴性、监测和工作方式
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21世纪生命科学的研究进展和发展趋势 20世纪后半叶生命科学各领域所取得的巨大进展，特别是分子生物学的突破性成就，使生命科学在自然科学中的位置起了革命性的变化。很多科学家认为，在未来的自然科学中，生命科学将要成为带头学科，甚至预言21世纪是生物学世纪，虽然目前对这些论断还有不同看法，但勿庸置疑，在21世纪生命科学将继续蓬勃发展，生命科学对自然科学所起的巨大推动作用，决不亚于19世纪与20世纪上半叶的物理学。假如过去生命科学曾得益于引入物理学、化学和数学等学科的概念、方法与技术而得到长足的发展，那么，未来生命科学将以特有的方式向自然科学的其他学科进行积极的反馈与回报。当21世纪来临的时候，一些有远见的科学家、思想家与政治家将日益严重的诸多人类社会问题，如人口、地球环境、食物、资源与健康等重大问题的解决，莫不寄希望于生命科学与生物技术的进步。 2· 08·生命科学将成为21世纪自然科学的带头学科 20世纪50年代DNA双螺旋结构模型的发现，随后遗传信息传递“中心法则”的确立与DNA重组技术的建立使生命科学的面貌起了根本性的变化。分子生物学与遗传学的结合将用10一15年测定出人类基因组30亿个碱基对（遗传密码）的全序列，人体细胞约有10万个基因。人类基因组的“工作草图”迄今20％的测序已达99%的准确率和完成率，今后将要继续发现与阐明大量新的重要基因，诸如控制记忆与行为的基因，控制细胞衰老与程序性死亡的基因，新的癌基因与抑癌基因，以及与大量疾病有关的基因。将利用这些成果去为人类健康服务。 70年代后，分子生物学的发展，以基因工程为代表的生物工程的出现，生物技术通过对DNA链的精确切割与有目的地重组，使有目的地改良生物的性状与品质成为可能。迄今生物工程所取得的成就已在生产上显示出诱人的前景，尽管还存在有不少争议的问题，但很有可能成为21世纪的新兴产业。 发育生物学将要快速地兴起，它将要回答无数科学家100多年来孜孜以求而未解决的重大课题，一个受精卵通过细胞分裂与分化如何发育成为结构与功能无比复杂的个体，阐明在个体发育中时空上有条不紊的程序控制机理，从而为人类彻底控制动植物生长、发育创造条件。 RNA分子既有遗传信息功能又有酶功能的发现，为数十年踏步不前的难题“生命如何起源”的解决提供了新的契机。在21世纪，人们还要试图在实验室人工合成生命体。人们己有可能利用生物技术将保存在特殊环境中的古生物或冻干的尸体的DNA扩增，揭示其遗传密码，建立已绝灭生物的基因库，研究生物的进化与分类问题。 神经科学的崛起，预示着生命科学又一个高峰的来临。脑是含有1011细胞的无比复杂的高级结构体系，21世纪初从分子到行为水平的各个层次对脑功能的研究都将有重大突破，在阐明学习。记忆。思维。行为与感情机理等方面也将有重大进展。脑机能在理论上的进展将会促进新一代智能计算机的研制，这可能成为未来生命科学对自然科学与技术科学回报的最好例子。 生态学可能是最直接为人类生存环境服务并对国民经济持续与协调发展起重要作用的科学。生态学的理论与实践为中国三峡水库建设提供的决策依据就是一个例证。保护生物的多样性是当前生命科学最紧迫的任务之一。据可靠的数据说明每天约有100多种生物在地球上绝灭，很多生物在没有被人类认识以前就已消亡，这对人类无疑是一种灾难。生态学与生物多样性保护与利用的研究成果将指导人类遵循自然规律积极保护自己生存环境，否则人类的物质文明与精神文明都要受到灾难性影响。 顺应生命科学迅速发展的形势，发达国家政府及一些国际组织先后提出了《国际地圈及生物圈计划》、《人类基因组作图与测序计划》、《人类前沿科学计划》、《脑的十年》及《生物多样性利用与保护研究》等投资巨大的生命科学研究计划。其中仅《人类基因组作图与测序计划》，一项预算就高达30亿美元。 由于生命科学的发展，人才的需求量激增，近年除越来越多的物理学家，化学家与技术科学家被吸引到生物学研究领域外，以美国为例，近年统计48万博士学位获得者中从事生命科学的占51％。优秀青年科学家流向生命科学前沿，这是21世纪生命科学欣欣向荣的动力与源泉。 2． 08． 2 21世纪初生命科学的重大分支学科和发展趋势 80年代有远见的生物学家把分子生物学（包括分子遗传学）、细胞生物学、神经生物学与生态学列为当前生物科学的四大基础学科，无疑是正确地反映了现代生命科学的总趋势。遗传学（主要是分子遗传学）不仅当前是生物科学的带头学科，在今后多年还将保持其在生命科学中的核心作用。 有些科学家早就预测到，由于分子生物学、细胞生物学与遗传学的结合，必然促进发育生物学的蓬勃发展，从而提出发育生物学将成为21世纪生命科学的“新主人”，这种预测已逐渐变为现实。 分子生物学（包括分子遗传学）在生命科学中的主流地位，以及它在推动整个生命科学发展中所起的巨大作用是无可争辩的。细胞是生命活动基本的结构与功能单位，细胞生物学作为生物科学的基础学科地位必须给予重视。 很多生物科学家认为神经科学或脑科学的崛起将代表着生命科学发展的下一个高峰，然后将促进认知科学与行为科学的兴起。 生态学可能是最直接为人类生存环境服务，井对国民经济持续与协调发展起重要作用的学科。 A分子生物学 分子生物学是在分子水平上研究生命现象本质与规律的学科。核酸与蛋白质（有人认为还有糖）是生命的最基本物质，因此核酸与蛋白质结构与功能的研究今后仍然是分子生物学研究的主要内容。蛋白质是生命活动的主要承担者，几乎一切生命活动都要依靠蛋白质（包括酶）来进行。蛋白质分子结构与功能的研究除了要阐明由氨基酸形成的并有一定顺序的肽链结构外，今后将特别重视肽链拆叠成的特定的三维空间结构，因为蛋白质生物功能与它的空间构型关系极为密切，核酸是遗传信息的携带者与传递者，遗传信息由DNA～RNA一蛋白质的传递过程，称为遗传信息传递的“中心法则”，是分子生物学（分子遗传学）研究的核心。其基本问题己比较清楚，当前研究的重点是： ①约经10一15年，人类基因组30亿个碱基对全序列（遗传密码）可以测出，这是具有里程碑意义的工作； ②真核生物基因表达过程在各层次上调节的研究仍然是今后相当长一段时间的任务。 分子生物学的概念、方法与技术和各学科的渗透，正在形成很多新的学科，诸如分子遗传学、细胞分子生物学、神经分子生物学、分子分类学、分子药理学与分子病理学等等。因此分子生物学在生命科学中的主导作用还将要持续下去。 B遗传学 遗传学比分子生物学更具有自己独立的学科体系。但现代遗传学与分子生物学是不可分割、相互交叉的两个学科，且很难截然分开。 有些著名的遗传学家把遗传学概括称为基因学，因为现代遗传学主要是研究生物体遗传信息传递与表达的学科。基因携带的信息是由基因的结构所决定，信息的表达是由基因的功能实现的，因此遗传学研究的是基因的结构与功能。从遗传学的角度看，所有生命现象的机制，追根究底都会与基因的结构与功能相关。因此遗传学在今后较长时间仍然是生命科学的核心学科和推动力。 有人估计人体细胞内约有10万个基因，迄今弄清楚的不到5％，所以与重要生命活动有关与疾病有关的新基因的发现与阐明将是今后几十年的重要任务。 C细胞生物学 著名生物学家威尔逊（Wilson）早在20世纪20年代就提出一句名言“一切生物学关键问题必须在细胞中找寻”，至今还有着很深的内涵。魏斯曼与摩尔根都曾先后试图在细胞研究的基础上建立遗传、发育与进化统一的理论，虽然当时没有找到具体解决的途径，但关于细胞的知识在生物科学中的重要性是显而易见的。细胞是一切生命活动结构与功能的基本单位，细胞生物学是研究细胞生命活动基本规律的科学，细胞的结构。细胞代谢、细胞遗传、细胞的增殖与分化，细胞信息的传递与细胞的通讯等是细胞生物学主要研究内容。虽然今后细胞生物学研究的内容是全方位的，但概括起来可能是两个基本点： 一是基因与基因产物如何控制细胞的重要生命活动，如生长、增殖、分化与衰老等，在此要涉及到一个全新的问题，细胞内外信号如何传递；二是基因产物一一蛋白质分子与其他生物分子如何构建与装配成细胞的结构，并行使细胞的有序的生命活动。 今后20多年，以下一些问题可望取得重要进展与突破： ①遗传信息的储存、复制与表达的主要执行者——染色体的结构与功能可能在不同的结构层次上得到阐明。 ②细胞骨架（包括核骨架与染色体骨架）的研究将得到全方位的进展。 ③细胞生物学与分子生物学、遗传学的结合，将在细胞分化机理研究方面有重要突破，为发育生物学快速发展奠定基础。 ④细胞衰老与细胞程序化死亡的机理将在更深层次上阐明。 ⑤以细胞分子生物学为骨干学科与其他学科结合，人工装配生命体的理想可能逐步 实现。 D．发育生物学 从一个受精卵通过细胞分裂与分化如何发育成为一个结构与功能复杂的个体，是至今未能解决的生命科学的重大课题，也是发育生物学的主课题。由于近几十年分子生物学、遗传学与细胞生物学所取得一一系歹（突破性成果与知识的积累，已为解决这一重大课题创造了条件，这也就是今后发育生物学应运而飞速发展的原因。 发育生物学当今要解决的基本问题是细胞的基因如何按一定的时空关系选择性地表达专一性的蛋白质，从而控制细胞的分化与个体发育。阐明基因在多层次水平上控制胚胎的发育就不仅是涉及到个别基因的问题，而是一系列调节基因在时空上的联系与配合，从而支配发育的程序。虽然这是难度极大的课题，但近年已初见端倪并有所突破。估计今后发育生物学将沿着这条道路深入下去，并可望取得丰硕的成果。 E．神经科学（或脑科学） 神经科学是研究人与动物神经系统（主要是脑）的结构与功能，在分子水平、神经网络水平、整体水平乃至行为水平阐明神经系统特别是脑的活动规律的学科群。脑的结构与功能是无比复杂的高级体系，含有10 11细胞。它是感觉、运动、学习、记忆、感情、行为与思维的活动基础。大脑细胞，口何指导人与动物的行为是未来生物学中最富潜力与最吸引人的领域；神经科学的崛起，预示着生命科学又有一个高峰的来临。神经科学或脑科学必然在下世纪促进认知科学与行为科学的兴起。因此各国政府投入巨资支持这一课题，包括美国总统签署的“命名1990年1月1日为脑的10年”不是没有道理的。 在今后几十年内可以预示到的神经科学突破性的进展可能包括： ①在分子到行为的各层次上阐明学习、记忆与认知等活动的基础； ②很快会发现与阐明一系列与记忆、行为有关的基因与基因产物； ③神经细胞的分化与神经系统的发育研究会有重大进展； ④脑机能在理论上的进展与突破（如模式识别、联想记忆、思维逻辑机理的阐明）会 促进新一代智能计算机与智能机器人的研制； ⑤一系列神经性疾病与精神病的病因可望在神经生物学研究中得到解释。 F．主态学（包括物种多样性保护研究） 生态学是研究有机体与周围环境——包括非生物环境与生物环境相互关系的科学。 由于生态学理论与应用是与世界环境保护。资源合理开发与保护，以至人类本身在地球上继续生存紧密相关的，尤其是地球环境日益恶化的情况下，生态学的重要性就变得十分突出。未来生态学的主要任务是协调人类活动与环境的关系。所以生态学经典学科的概念与研究内容必然要适应人类生存环境的保护与社会经济持续发展的要求而不断改变。 今后生态学研究的重点可能表现在以下方面： ①生态群落的多样性、稳定性与演变规律与人类活动的关系； ②全球气候变化对生态系统结构与功能的影响； ③生物多样性的保护和永续利用也是保护人类自身生存环境尤其是拯救濒临绝灭的 生物种类更加具有紧迫性； ④城市生态学与经济生态学将迅速发展； ⑤生态工程与生态技术将在国民经济建设中发挥作用。 G．空间生命科学 空间环境向生命科学提出了新的挑战，也为生命科学的发展提供了机遇。 21世纪人类的空间活动将要离开地球附近，探索月球及其他太阳系的大体。这就要求人在地球外各种环境中能长期地生活和工作，首先是在，长期空间飞行器中航行，月球站以及火星或火卫站等，空间医学必须有重大突破，解决长期在地外空间所遇到的宇航员骨质疏松，肌肉萎缩和兔疫功能变化等生理学难题，同时，与开拓大疆相关联的是受控生态系统，创造一个不需要外界补给，而使人们能在其中长期生活的环境。这些问题有希望在21世纪20一30年代解决，其中空间生理学问题有可能利用中医和中药的方法取得某些重大突破。 地球外层空间为研究重力生物学提供了理想的条件，重力条件对各种层次结构生物的影响仍然是21世纪重力生物学的主题，今后的研究重点将集中于细胞，绿色植物，一些微生物和小动物。特别是重力环境对哺乳动物细胞形态、结构、变异和基因表达的影响将是一个热点。重力生物学的学术意义在于揭示重力效应在生物进化过程中的作用，是自然科学的基本问题；另一方面，重力生物学的成果将是空间制药及空间生态系统等应用领域的基础，重力生物学的学术和应用都是下个世纪的重要课题，可望在21世纪20-30年代取得突破性的进展。 地外生物探索是生命起源的重大课题，其中地球以外的智能生物探索是一个长期的 课题。地球上的人类正在向外层空间发射电波和接收讯号。外星人与地球人之间可能存在的学术和技术差距不仅是一种危险，也是自然科学的重大前沿问题，将被持续地研究下去。 2． 08． 5 21世纪初生命科学最有可能突破的领域 ①人类基因组的全序列（遗传密码）将在10一15年测定完毕，为全部遗传信息的破译奠定基础。 ②与生命活动有关的重要基因与重要疾病有关的基因将被陆续发现，其中特别引人注目的是控制记忆与行为的基因、控制衰老与细胞程序性死亡的基因、控制细胞增殖的系列基因、胚胎发育多层次网络调节基因。新的癌基因与抑癌基因的发现与其生物学功能的释明将大大提高对生命本质的了解。 ③人与动物的高级生命活动：感知、思维、记忆、行为与感情的发生与活动机制在脑科学研究突破的基础上，有更深的认识。 ④癌症的治疗将有全面的突破，爱滋病的防治得到控制。 ⑤在阐明地球上原始生命起源的基础上，人类还可能在实验室合成生命体，这种生命体应具有原始细胞的基本特征。
生物综述(细胞篇）作者：未知 当然这仅是人为地划分，这些方面都不是各自孤立的，而是相互有关连的，一定要把细胞作为一个整体看待，一定要把生命过程和细胞组分的结构和功能联系起来。 既然细胞生物学的主要任务是把发育和遗传联系起来，细胞分化这个问题的重要性就不言而喻。因为就整个有机体而言，遗传特点不仅显示在长成的个体，而是在整个生命过程不断地显示出来。在细胞水平，细胞的分化也就是显示遗传特征的过程。 一个经常被引用的例子是红细胞中血红素的转换。人类胚胎早期的红细胞中首先出现胚期血红素，后来逐渐被胎儿期血红素所代替，胎儿三个月之后，后者又被成体型血红素所代替。关于这些血红素已经有很多研究例如它们各自由那些肚链组成，这些肚链在个体发育中交互出现的情况，它们各自的氨基酸组成和排列顺序，各个肽链的基因位点，以至基因的结构都已比较清楚，工作可以说是相当深入了。 但是，追根到底有些问题依然没有得到明确的解答，甚至没有解答——这也适用于关于其他细胞的终末分化的研究。 实现了终末分化的细胞，已经失去了转变为其他细胞类型的潜能，只能向一个方面分化。例如红细胞，虽然发生血红素的转换，但不能转变为其他类型的正常细胞，与胚胎细胞相比，它们的情况要简单些，因为胚胎细胞在尚未获得决定的时候是具有广泛潜能的。拿中胚层细胞来说，它们既可以分化为肌细胞，也可以分化为前肾细胞、血细胞、间质细胞等。 细胞生物学的研究往往乐于使用培养的细胞，它的优点是可以提供足够量的细胞做生化分析，并且只有一种细胞，材料比较单一，分析结果方便。但是对于某些方面的研究则有不足之处，因为细胞在任何一个有机体里都是处于一个社会之中，和别的细胞不同程度地混杂在一起，在其生命活动中不可能不受到相邻的其他细胞的影响，甚至是相邻的同类细胞的影响，其处境要比培养的细胞复杂得多。因此为了研究在一个细胞群中细胞与细胞间的相互关系，细胞社会学被提了出来。 细胞社会学的内容相当广泛，包括不同细胞或相同细胞的相互识别，细胞的聚集与粘连、细胞间的交通和信息交流，细胞与细胞外间质的相互影响，甚至还可包括细胞群中组织分化模式的形成。有些方面已经积累了一些资料，从细胞社会学的角度有目的地深入下去一定会提供更系统的，有用的信息。由于细胞社会学是以细胞群体为对象，而且有些问题也是发育生物学需要了解的，发展下去很可能它会成为细胞生物学与发育生物学之间的桥梁。 展望细胞生物学的研究，除了关于各细胞组分的结构与功能，以及对各种生命现象的研究还要继续深入外。研究是什么原因使得基因能够有序地选择性地表达，可能会成为今后重点研究的问题。此外细胞社会学也会越来越受到重视。 不知这里面有没有你能用到的信息
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不知道你问的是投稿格式还是毕业论文用的，如果是投稿的，各个杂志的要求在细节上不一样，但结构大同小异。基本上包括：1。标题（Title）2。作者（Author(s)）3。通讯作者的联系方式(Contact information)4。摘要(abstract)5。背景介绍（Background or introduction）6。实验材料与方法（Materials and Methods）7。结果（result）8。讨论（discussion）9。致谢(acknowledgment)10。参考文献 （references）毕业论文参考这样的格式也绝对没有问题，不过不用把其他作者写进去。
Title（题目）简明扼要的说出重点Author（作者）按贡献大小排序，并注明工作单位或研究室Abstract（摘要）简要介绍实验的流程、方法、得出的结论Keywords（关键词）为了便于别人搜索而设置，尽量不与题目中的词重复Introduction（前言/简介）描述前人在这方面努力的成果，以及自己实验的目的和动机 以下2个顺序可以换Materials and Methods（材料和方法）描述实验材料和实验的流程及方法，尽可能详细，所用的物质、含量、时间、对照等都要描述清楚，在这个部分不要写实验结果Results（结果）图文并茂描述实验结果，顺序与实验步骤一一对应，所有的图表都要有相应的描述，可以简要分析实验结果，不一定要有误差分析 Discussion（讨论）对实验结果进行总体总结，评估优劣，指出问题，以及可能的改进方案，发散思维，产生新的问题，表示“有待进一步的研究”Acknowledgments（致谢）对那些帮助你实验或提供材料和设备的个人或组织进行感谢References（参考文献及资料）罗列你在实验过程中（从实验设计到结果分析）所参考的前人文章的作者、文章名字、发表杂志、发表日期、以及在杂志上的具体页数 如果有需要，还可以加上“支持信息”或者“附表” 大概是这样，有问题再问
恶性疟原虫抗原变异分子机制[9]以及疟原虫攻击红细胞机制[10]等、微量化与自动化等优点 1·2 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,有资料显示[12]、应对突发公共卫生事件中蚊媒传染病的发生提供参考,还可传播寄生虫病,以期为蚊媒传染病的防制分子生物学技术在国内防制虫媒传染病领域的应用【摘要】 本文综述了国内近年来,在特定的条件下我国法定报告的传染病中 1 常用的分子生物学技术[3] 1·1 核酸分子杂交技术核酸的分子杂交(molecular hybridization)它是利用核酸分子的碱基互补原则、有序地固定于经过相应处理的载体上,若异源 DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列、狭槽(slot)杂交和菌落原位杂交,通过杂交信号的强弱及分布, PCR) 是以拟扩增的DNA分子为模板、不对称pcr (asymmetric pcr);配套软件不够完善通过不断重复这一过程常规丝虫检测是在夜间采血 PCR各种应用模式,分子生物学技术在虫媒病中蚊媒传染病防制的应用情况 2·2 丝虫病黄志彪等[11]运用PCR技术检测血液中的班氏丝虫微丝蚴,同时新合成的DNA片段也可以作为模板 2 分子生物学技术在虫媒病诊断的应用 2·1 疟疾黄炳成等[4]用pBF2 DNA片断杂交的双方是待测核酸序列及探针,然后加入标记的待测样品,并在同一反应管中进行多重PCR对登革病毒进行分型鉴定、玻片核酸探针可用放射性核素,双链解开成两条单链:分为液相杂交和固相杂交 1·3 DNA芯片基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列 (DNA microarray)、死亡率高,则在复性时可形成杂交的核酸分子,但在实践中其研究成本较高;PCR扩增系统可用于检测班氏丝虫病患者血样中的循环DNA,分为Southern杂交和 Northern杂交、数量及序列根据其来源和性质可分为cDNA探针、生物素或其它活性物质标记、转录因子调控网络[6] 2·3 登革热病郑夔等[13]应用多重PCR技术快速鉴定4种血清型登革病毒,主要通过媒介的控制进行防制[2];也有报道应用寡核苷酸芯片技术能同时确认流感和登革热病毒[14],在医学领域的应用日趋广泛,镜检血片结果亦为阴性,与异源的DNA或RNA (单链)复性、加端 pcr,有一定的地域性和时间性,并取得了重大进展,随着分子生物学技术的研究和发展;方法标准化不足,证实了2004年在广东发生的登革热疫情为I型登革病毒、RNA探针等,能用于周期性或夜间周期性丝虫病的日间血检工作特点, SsP/是采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量特定序列的探针分子密集、反向pcr ( inverse pcr或reverse pcr),以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物,获得有效的治疗和保护:根据被测定的对象,除了传播病毒性疾病外 【关键词】 分子生物学技术、复合pcr (multiplex pcr),按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成、套式引物(nested primer) pcr、基因组探针,虫媒病占 13种,从而获得受检样品的遗传信,使DNA的合成量呈指数型增长,可以使目的DNA片段得到扩增 1992年在国际虫媒病毒中心登记的已达535种;根据所用的方法:具有通量大这类疾病大都属于自然疫源性疾病;根据环境条件,其中128 种对人有致病性[1],分为斑点(dot)杂交,并行性、标记pcr ( lp-pcr)和彩色pcr;虫媒;传染病虫媒病是由节肢动物携带病原体传播的一组疾病,发病率低、反转录pcr方法检测 近年来基因芯片在疟原虫的研究内容还有疟原虫新基因发现[5]:兼并引物( degenerate primer) pcr,从多种疟原虫DNA样本中检出恶性疟原虫长期受这种疾病困扰的地区将有望通过这种技术的完善,蚊虫作为媒介,来分析目的分子的有无,可检出lOOul阳性血样中的l条班氏丝虫微丝蚴,在DNA聚合酶的作用下、定量pcr, 作者就近年来分子生物学技术在蚊媒传染病的诊断和防制等方面的应用综述如下、锚定pcr或固定 分类、寡核苷酸探针、疟原虫适应人体宿主机制[7],从根本上改变了丝虫病的诊断,进行多元杂交,经标记后作探针、疟原虫比较基因组杂交分析[8];用于检测班氏丝虫监测点540份血液样本结果均为阴性、监测和工作方式
【综述】几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用翁康生 病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一, 它们极大地威胁着人类健康。目前还存在人类尚未认知或新出现的病毒, 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现,鉴别未知的或新出现的病毒, 是有效的预防和控制的先决条件之一。因此, 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。近20 多年来, 常采用传统的微生物学技术方法和现代分子生物学技术方法相结合的途径, 发现和鉴别未知病毒。通过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建立的PCR、杂交等方法, 作特异核酸序列的检测、用分子生物学技术获得未知病毒核酸序列, 查询基因数据库, 检出并确定未知病毒基因组序列, 最终发现鉴别出未知病毒。对于无法用细胞分离培养的未知病毒, 有的采用免疫学与分子生物学技术相结合, 筛选获取病毒特异抗原编码基因的克隆, 进而发现鉴别出该病毒。更多的则是采用相应的分子生物学技术, 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列,进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养分离, 最终对其基因组序列的测定分析, 是鉴别和判断的决定性依据之一, 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。从少量样品中, 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中, 分离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸片段, 供进一步克隆、测序、生物信息学分析, 是用分子生物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕, 也是最终测定分析, 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分, 可采用的技术方法也有所不同, 现将有关技术与其应用作一简介, 以供参考。1 代表性差异分析法代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法, 并不断得到演化, 发展和应用。病毒感染宿主细胞后, 与未感染的同类细胞相比, 二者核酸物质间的差异主要在于是否存在病毒核酸。消减去二者核酸间相同序列的背景部分, 扩增、比较、选取余下可能存在差异的部分, 进一步分析以发现未知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同, 可选用相应的代表性差异分析法, 见表1 。111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation differenceanalysis , DNA RDA)此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用病毒核酸类型DNA RDA c DNA RDA非rRNA 序列6 核苷酸引导c DNA RDAds DNA 线状√ds DNA 环状√ss RNA polyA( + ) √ss RNA polyA( - ) 3 √ds RNA polyA( - ) √ 3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。而建立的。方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ,T- DNA) 和对照DNA(Driver DNA ,D - DNA) 设为二组,分别用同一种限制性内切酶酶切处理,并接上5′端去磷酸化的人工接头,补齐接头后,加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物上的人工接头后,切出的T - DNA 连上第二种人工接头,变性后与过量的变性D - DNA 杂交。通过杂交,消减去T- DNA 中与D - DNA 中同源的核酸序列,而只存在于T - DNA 中的靶序列DNA(Target DNA) 则自我退火复性,其两端连有第二种人工接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ,只有靶序列DNA呈指数扩增,因而得到进一步富集。进过如此重复的几个轮回后,以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ,将T- DNA 中呈现的差异部分作分离,克隆,序列分析。Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ,在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA作T- DNA。以此作为实验模型,用DNA 代表性差异分析法成功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术,Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现一段类似人类疱疹病毒的基因, 并由此发现一种新的病毒HPV8。以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation differenceanalysis , cDNA RDA)Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点,提出了cDNA 代表性差异分析法。它的基本原理与DNA RDA 相同,主要不同在于,采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶,它的识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高,平均酶切片段长度约256 bp ,保证了cDNA 序列群中绝大多数序列,至少被切出一个片段可扩增,供差异分析,分离鉴定。cDNA RDA 技术相对经济,可高效灵敏地用于非常少的起始材料而获得结果〔15〕。具有polyA( + ) - RNA 病毒,其核酸可类似于mRNA 分离纯化,因此可应用此技术。利用cDNA RDA技术,发现鉴定了TiV、MenV ,等〔16 ,17〕RNA 病毒。113 非rRNA 序列6 聚核苷酸引导反转录的cDNA RDA中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13 ·317 ·© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing H All rights ( - ) - RNA 病毒,其核酸物质不似于mRNA ,需和宿主细胞总RNA 同时分离,并用随机引物作反转录。因为宿主细胞总RNA 中rRNA 约占80 % ,由于竞争反应、靶序列信号被湮灭等原因,从这样的总RNA 抽提物中,用随机6 聚核苷酸引物引导反转录的cDNA RDA 技术,发现鉴别polyA( - ) - RNA 病毒核酸序列是困难的。Endoh 等〔18〕罗列了6 聚核苷酸所有可能的排列组合,共计4 096 个序列模式,以大鼠18S、518S、28S 等rRNA、微卫星重复序列、SARS - CoV、BI - 3 病毒等的序列数据为模型,筛选出在rRNA 序列中出现频率极低或不出现的6 聚核苷酸序列模式共96 种。将这些序列分别合成并混合后,称之为非rRNA 序列6 聚核苷酸引物。生物信息学分析96 种序列模式在哺乳动物病毒科具代表性的1 791 个病毒基因组序列中出现的频率,数据表明,非rRNA 序列6 核苷酸引物可引导绝大多数病毒的cDNA 合成。分别用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物和随机6 核苷酸引物作cDNA 反转录效率、cDNA RDA 试验,结果表明,二类引物对人工合成的RNA (二类引物在其序列中出现的频率相似) 反转录效率几乎相等,而前者对细胞总RNA反转录效率远低于随机引物。用二类引物作cDNA RDA ,检测人工合成的RNA ,前者灵敏度是用随机引物的30 倍。在模拟实验中用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物引导反转录,串联cDNARDA 技术,检测鉴别出感染细胞的BI - 3 和SRAS - Cov 核酸序列片段。此方法能从1μg 总RNA 中检测出3 ng 的外来RNA ,其检测灵敏度不及普通的PCR 检测方法,但对于检测鉴别在宿主细胞中复制,但不知其基因序列的poly A( - ) - RNA 病毒而言,也是一个可选择的方法。114 抑制消减杂交cDNA RDA 技术结合消减杂交和PCR 抑制作用〔19〕的技术原理,Diatchenks 等〔20〕等发展出了抑制消减杂交技术( suppressionsubtractive hybridization ,SSH) 。与前两种RDA 技术不同点在于,SSH 技术将内切酶酶切处理的T - cDNA 分为两份,分别接上不同序列的去磷酸化的接头1 和2 ,分别于过量的D - cDNA作第一轮杂交。杂交过程中两组中的单链T - cDNA 浓度趋同,T- cDNA 中的非靶序列单链cDNA 与D - cDNA 中相应序列形成杂交双链而被消减, T - cDNA 中差异表达的单链cDNA被显著富集。合并一轮杂交物,加入过量变性D - cDNA ,作第二轮杂交。合并的二组份一轮杂交物中剩下的趋同化、经消减杂交后的单链T - cDNA 能互补杂交, 可以形成: 原组内T- cDNA 单链间的杂交、T - cDNA 与D - cDNA 单链间的杂交、二组间T- cDNA 单链间的杂交。补齐杂交反应后双链cD2NA 末端,用分别与接头1 和2 的外侧部分序列互补的寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。二组份间T- cDNA 互补单链杂交物,因两端分别具有接头1 和2 ,可被指数扩增;T - cDNA 与D -cDNA 杂交物和剩余单链T- cDNA ,因一端具接头序列,被线性扩增;而同组间T- cDNA 杂交物两端具反转重复长序列,因抑制性PCR 效应,在PCR 反应循环中分子内退火形成稳定的“锅柄结构”〔19〕而不被扩增。因此,SSH 技术通过二轮消减杂交和抑制性PCR 特异扩增,使假阳性大大降低,提高了检出低丰度靶mRNA 的灵敏度。Hu 等〔21〕应用SSH 技术,结合反转录酶的模板切换(tem2plate - switching) 功能, 以HCV RNA 阳性血清体外感染的人MOLT- 4 急性淋巴母细胞白血病T 细胞系为模型,通过反转录合成全长cDNA、抑制性消减杂交、消减的cDNA 文库构建、反相斑点杂交筛选,在被筛的96 个克隆里,T- cDNA 探针杂交呈特异阳性的16 克隆中,序列分析后得到4 个插入HCV 序列的克隆。2 非特异多重引导滚环式扩增法乳头瘤病毒、痘病毒等,其基因物质为环状DNA 分子。在事前未知基因序列的情况下,发现和鉴别这类病毒核酸序列还可选择非特异多重引导滚环式扩增法(multiply primed rolling -circle amplification ,RCA) ,扩增、分离、获取其基因片段供进一步分析。自然状况下,环状DNA 经常以滚环方式进行复制。Dean等〔22〕应用随机6 聚核苷酸作引物,加入φ29 DNA 聚合酶,以质粒DNA 和噬菌体DNA 为模型,建立了多重引物引导的滚环式扩增法。φ29 DNA 聚合酶可长距离( > 70 000 nt) 地结合于DNA模板,进行链置换DNA 合成。而随机6 聚核苷酸引物可多位点的与单链环状DNA 互补复性。在φ29 DNA 聚合酶作用下,以随机引物引导,合成与模板互补的DNA 链。当合成链延伸到与模板结合的随机引物5′端时,在φ29 DNA 聚合酶的链置换活性作用下,下游被延伸的随机引物链被“甩”出模板。而上游的延伸链继续在环状模板上复制合成。同时,被从单链环状模板上“甩”出的互补链,又成为新的模板,随机引物与之结合,在φ29 DNA 聚合酶作用下,继续以枝杈的形式进行链延伸和链置换,最后以双链DNA 串联体形式释放。用此法可使1 ng 纯pCU18 环状DNA 模板延展式地扩增至107倍。Rector 等〔23〕以此原理建立了不依赖已知的特定基因序列(非序列依赖性) 的多重引导滚环式扩增环状DNA 病毒基因组方法,并应用其扩增获取了HPV 16 的基因组DNA。在接近实样的试验样品中,由于稀释倍数和环状DNA 分子较大等原因,将HPV 16 基因组DNA 扩增了214 ×104 倍。3 病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增病毒核酸可包裹于病毒外壳内,病毒的蛋白外壳或脂膜对病毒核酸具有保护作用。而病毒颗粒具有不同于细菌或其他真核细胞的理化特性。利用这样的特点Allender 等〔24〕和Stang等〔25〕各自建立了病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增方法(sequence - independent amplification) 。两种方法的共同点在于,依据病毒颗粒小、具一定密度,用0122μm 滤器过滤、或再串上超速密度梯度离心,从样品中分离出病毒颗粒,DNA 酶酶解游离的DNA ,裂解病毒颗粒,抽提获取较纯的病毒颗粒相关核酸。Allender 等〔24〕借鉴RDA 原理,对病毒颗粒相关核酸用限制性内切酶酶切后,作非序列依赖性单引物PCR 扩增( sequence -independent single primer amplification ,SISPA) :将抽提获取的DNA或RNA 分别补齐,合成第二链DNA ,或反转录,合成双链cDNA。限制性内切酶酶切后,酶切片段两端连接一种接头,并以与接头同序列的单一寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。扩增产物进一步克隆与序列分析。用此法检验HBV 阳性血清和GBV - B 阳性血清样品,结果在相当于106/ ml 个基因组拷贝浓度的50μl样品中,可重复试验检出相应的病毒基因片段。Stang 等〔25〕则在得到双链DNA 或双链cDNA 后加入k - 随机引物,此种引物5′端含有20 个固定序列的核苷酸,3′端则有·318 · 中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing H All rights 核苷酸随机简并序列。与变性模板退火时,6 核苷酸随机简并序列随机地与模板相应序列互补退火,在T4 DNA聚合酶作用下作链延伸。然后在延伸产物中加入k - 随机引物中固定序列部分的20 寡核苷酸作引物,进行PCR 扩增。扩增产物电泳分析、克隆、测序。用此方法检验由实时- PCR 定量,包括病毒颗粒相关核酸及游离核酸在内的病毒基因组拷贝数为109/ ml 的Cox - 3 和MAV - 1 培养物。前者的12 克隆中,9 个克隆插入有肠道病毒的四个不同区域的同源基因片段;而6 个MAV - 1 中分离的克隆内,5 个含有99 % 同源MAV - 1 基因片段。基于病毒颗粒分离纯化、DNase 处理、病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增,获取、鉴定未知病毒的基因片段,尽管灵敏度不够高,但其实验时间较短,步骤相对简单,对于病毒拷贝数高,时间紧急的样品鉴别,是较适宜的一套方法。病毒的种类、结构、特性多种多样,感染病毒后需要检验的样品又各不相同,因此用于发现鉴别未知病毒的核酸序列的技术,也不是固定不变和完全通用的。以上的技术方法各有优缺点和适用范围。而针对扩增获取未知病毒基因组序列片断,这一发现鉴定未知病毒的分子生物学技术的要点或瓶颈,必然还会有新的改进、创新技术出现,将会更快、更灵敏、更简便、更准确的发现鉴别未知病毒。参 考 文 献〔1〕 Drosten C , Gunther S , Preiser W, et al1 Identification of novel corona2virus in patients with severe acute respiratory syndrome1 N Engl J Med ,2003 , 348 : 1967 - 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我喜欢生物学科 世间有许许多多的生物体，世界因生命而精彩。生物形态各异，很有趣，比如，翩翩起舞的蝴蝶，讨厌的苍蝇，可爱而会唱歌的小鸟，还有6500万年前灭绝的恐龙，它们的种种生命迹象都吸引了我的视线，让我对生物有了好奇心。 以前，我对“生物”的理解只是单纯的“动物”，上中学学习了生物后，我知道生物的范围很广，不止动物，植物、微生物都在其之内。地球上的植物大约有30多万种，动物约有150多万种。从生物书上，我知道了桫椤、蕨、苏铁等不常见的植物，还解决了小时候一些弄不懂的问题。有一次，我在比较干的泥土里挖蚯蚓，却怎么也挖不着，现在才知道蚯蚓生活在阴暗潮湿的地方，干地里当然挖不着了。为什么仙人掌的叶子会退化成刺呢？因为它需要适应环境，为了减少水分的丧失，储存更多的水分，仙人掌的茎部也变得肥厚而多汁。生物这门学科帮助我 了解了疑难的问题，这是我喜欢生物的原因之一。 走进第二单元，我认识了显微镜。在我心目中，显微镜是那样地奇妙，一直都想用它观察东西，小学时从来也没碰过它。记得第一次进生物实验室，看见桌上的显微镜，有一种难以抑制的喜悦。于是我迫不及待地凑到目镜前看了看，可看到的只是一片黑暗。上课时，老师说，用显微镜观察东西并不是想象得那么简单，要经过对光、选择物镜、制作临时玻片标本、调整清晰度等几个环节。我仔细地听着，努力熟记其结构的每一个名称。在老师的帮助下，我终于通过显微镜看到了细胞。当时就有一种巨大的成就感，仿佛自己也成了一个科学家，会用显微镜观察微生物了！还有一个奇怪的现象，在显微镜下呈的是倒像。现在，使用显微镜已成了家常便饭，几乎每节课都要做实验。用显微镜观察肉眼看不到的东西能使我快乐，这也激发我学习生物的兴趣。 此外，我还对生物体有了新的认识。除病毒外，生物都是由细胞构成的。在显微镜下看到的细胞是一个个排列在一起的。植物细胞由细胞壁、细胞膜、液泡、细胞核、线粒体、细胞质、叶绿体构成，动物细胞由细胞膜、细胞质细胞核、线粒体构成，它们的作用也各不相同。细胞核由染色体构成，染色体由DNA构成……别小看一个小生命，它的结构复杂得很呢！以前，我不知道水果中的水分是从哪儿来的，原来是来自液泡中的细液泡。我总是生病，学习了生物后我知道是病毒在我身体里捣鬼！连病毒都是生物体，真是不可思议啊！我对生物越来越有好奇心了。 生物学把我带进了一个奇妙的世界，解决了疑难的问题使我豁达，使用显微镜让我感到快乐，微生物使我有了好奇心，因此，我对生物这门学科产生了浓厚的兴趣。 （这篇文章是我写的，初一水平）
文献综述是在毕业论文（设计）开题前针对某一研究领域或专题搜集大量文献资料的基础上，就国内外在该领域或专题的主要研究成果、最新进展、研究动态、前沿问题等进行综合分析而写成的、能比较全面的反映相关领域或专题历史背景、前人工作、争论焦点、研究现状和发展前景等内容的综述性文章。“综”是要求对文献资料进行综合分析、归纳整理，使材料更精练明确、更有逻辑层次；“述”就是要求对综合整理后的文献进行比较专门的、全面的、深入的、系统的评述。综述另起一页撰写，题目用小二号黑体加粗居中（综述题目尽量不与毕业论文题目雷同）。综述在目录中以“综述”二字表示并标注页码，综述内部小标题不再体现于目录中。综述正文格式参考毕业论文（设计）正文格式。综述一般应包含以下四部分：概述、主题、总结和参考文献。概述部分：主要是说明写作的目的，介绍有关的概念、综述的范围，扼要说明有关主题的现状或争论焦点，使读者对全文要叙述的问题有一个初步的轮廓。正文部分：是综述的主体，其写法多样，没有固定的格式。可按年代顺序综述，也可按不同的问题进行综述，还可按不同的观点进行比较综述，不管用那一种格式综述，都要将所搜集到的文献资料归纳、整理、进行分析比较，阐明有关主题的历史背景、现状和发展方向，以及对这些问题的评述，主题部分应特别注意代表性强、具有科学性和创造性的文献引用和评述。总结部分：与一般论文的小结有些类似，将全文主题进行扼要总结，提出自己的见解并对进一步的发展方向做出预测。参考文献：是进行毕业论文（设计）和研究的基础，撰写文献综述的依据，列出这些参考文献不仅表示对被引用文献作者的尊重及引用文献的依据，而且也为评审者提供查找线索。参考文献的编排应条目清楚，格式规范，查找方便，内容准确无误。参考文献的格式参考上述毕业论文（设计）参考文献格式。综述参考文献要求8篇以上。