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生命科学哲学（Philosophy Of Biological Science）是本世纪六七十年代兴起的一股科学哲学思潮，虽然它的兴起主要是以本世纪50年代以后生命科学的蓬勃发展为基础，但从事生命科学哲学研究的哲学家们并不局限于把他们的哲学看作是一门部门哲学，而是更进一步，把他们的哲学看作是科学哲学的新范式：一种与传统的根植于物理科学之上的科学哲学相对的新的科学哲学。因此，当代人们提到生命科学哲学就有两层含义。狭义地讲，生命科学哲学是关于生物学的哲学，主要研究生命的本质、生物学的理论结构、概念框架、一般方法等问题。换句话说，生命科学哲学就是关于生命的本体论、认识论和方法论的哲学学科。在此意义上，“生命科学哲学”即是“生物学哲学”，它是科学哲学的一个子学科。广义地讲，生命科学哲学是科学哲学的新思潮。传统的科学哲学究其根本，都是以物理科学（包括物理学和化学等学科）为根据的，所以新哲学家们把这种哲学称之为物理科学哲学（Philosophy Of Physical Science）。新哲学则主要是以生命科学为基础而又兼顾物理科学。所以为了突出新哲学与传统哲学的不同，一些哲学家把这种新哲学称之为生命科学哲学。 1 生命科学哲学兴起的背景自然科学是哲学的基础，任何一种哲学的产生都与当时的科学背景密切相关。近代科学是从1543年开始的，虽然这一年出版的两本伟大著作中的一本——维萨里的《人体的构造》是生物学的一个分支，可是其后的一百多年，生物学并没有突飞猛进的发展，而运动学和力学却首先得以快速发展。1687年，牛顿的《自然哲学的数学原理》出版，使经典力学这座宏伟大厦最终落成。此后，物理科学的其它学科也都先后发展起来并逐步成熟。与此相对，生物学在牛顿时代尚处于孕育时期，用恩格斯的话说就是“还处于搜集材料的阶段”，牛顿的物理革命在当时并没有引起生物学的革命性变革。生物学思想的重大革新是在19世纪和20世纪才开始产生的。因此，当科学哲学在17世纪和18世纪开始发展起来的时候，或者说，当培根、笛卡尔、莱布尼兹和康德论述科学和科学方法时，完全是以物理科学为基础的。在这种情况下，物理科学的思想和方法自然成了评判一切科学的标准，大多数哲学家理所当然地把物理科学看作是科学的标准范式，认为一旦理解了物理科学，就能理解其它任何科学。尽管早在19世纪中叶，达尔文就曾说过生物学的成就将会使哲学出现新繁盛，可是19世纪的科学哲学仍然完全根植于物理科学之中，不论是第一代实证主义（孔德）还是第二代实证主义（马赫），他们关于科学的本质，科学的理论结构和概念框架、科学方法等等的论述，完全是以经典物理学为依据的。进入20世纪，实证主义发展到了它的第三代——逻辑实证主义。正如提出这种理论的核心人物所说，逻辑实证主义主要依据的自然科学理论是数理逻辑和20世纪初诞生的相对论和量子力学。面对这种情况， 著名的生物学家和哲学家恩斯特·迈尔（ErnstMayr）不无遗憾地说：“自从伽利略、笛卡尔、牛顿以来直到20世纪中叶，科学哲学一直由逻辑学、数学和物理学所左右达数百年之久”( 〔2〕．piv)。然而，本世纪中叶以后，由于传统科学哲学的自身危机以及分子生物学革命和综合进化论的革新，使哲学家们开始转向对生物学的哲学概括，以便从生物学中找出科学的新范式，于是，有关生物学的哲学思考成为西方科学哲学讨论的一个最热点的领域之一。在这种讨论中，生物学哲学作为一门学科逐步成熟。我们先从传统科学哲学的危机谈起，传统科学哲学有三个主要的教条：一是分析命题和综合命题的区分，认为自然科学的命题是综合命题；第二是还原论，“即认为每一个有意义的陈述都等值于某种以指称直接经验的名词为基础的逻辑构造”；第三是演绎的解释理论，认为科学解释就是推理，一个需要解释的对象，只要它能从一些规律性陈述和一些前提条件中推导出来，它就得到了解释。其中第二点是逻辑实证主义的中心命题，这个命题换个说法就是认为，在科学中，观察（或经验）和理论是可以完全分开的，科学的本质就以经验为基础建立科学理论，科学理论的正确与否就是看它能否得到证实。奎因在《经验论的两个教条》中已对这种经验与理论的二分法以及第二个教条进行了批评。不过，决定性的批判则来自波普尔。波普尔认为，从逻辑的角度看，完全证实是不可能的，然而反过来，证伪却是可能的。由此，波普尔提出了证伪主义的科学纲领：科学的标志不在于它的可证实性，而在于它的可证伪性。由于波普尔的工作，科学哲学开始发生一个重大的转变：从研究科学理论的静态结构转向研究科学理论的历时结构。于是库恩的范式论、拉卡托斯的研究纲领方法论、费耶阿本德的无政府主义方法论等科学哲学理论相继出现，使传统的科学哲学出现严重的危机。我们再从生物学本身的发展看。自从1953年沃森（JDWatson）和克里克（FHCCrick）认定DNA的双螺旋结构以来，生物学便跨进了飞速发展的新时代。短短十多年的时间，遗传密码就得以破译，基因的作用机理也弄清楚，遗传工程亦开始实施。同时，由于新知识的渗透和综合，生物学的一些古老的学科，如进化论、胚胎学、分类学等也面貌一新。一时间，世界范围内出现了一股研究生物学的热潮，生物学成为继相对论和量子力学革命以来发展最快，成就最多的学科。生物学的这些革命性发展自然引起越来越多的哲学家对它的关注。他们或者利用生物学的成就重新评价以往科学哲学的适当性，或者从生物学中总结出独特的认识论、方法论和本体论问题。传统科学哲学的危机以及生物学的持续发展因此使生命科学哲学成为当代科学哲学研究中的最激动人心的领域。各种论文和论著大量涌现。1985年，在一些哲学家和生物学家的努力下，一本专门讨论生命科学哲学的杂志——《生物学与哲学》也在西方创刊。作为一股新的科学哲学思潮的生命科学哲学就是在70年代兴起的，在80年代和90年代，这门学科逐步成熟并不断发展。 2 自主论和分支论：当代生命科学哲学的两大派别近来西方出版的几乎所有生物学哲学的著作都以生物学在科学体系中占有什么位置，或者说生物学与物理科学相比有什么不同这个问题作为开篇。按照罗森伯格的说法，生物学和物理科学的关系问题是“生物学哲学的中心问题”。在此，我们可以换个说法，把这一问题看作是生物学哲学的基本问题，因为，第一，这一问题是任何一个生物学哲学家必须首先提出并要作出回答的问题。“生物学与其它自然科学是否不同和怎样不同是生物学哲学… …所面对的最突出、最明显、经常被提出、争议最多的问题”(〔3〕 P13)。第二，对这一问题的不同回答方式及结果，决定着生物学哲学讨论的几乎所有其它问题的回答方式及结果。生物学家和哲学家提出的有关生物学的逻辑的、认识论、本体论和方法论的较具体问题几乎都是围绕这一问题展开的，比如还原论与突现论的争论，关于社会生物学科学性争论，心身关系的争论等等都是如此。第三，对于生物学家和生物学哲学家来说，对这一问题的不同回答反映了他们对生物学应当前进的方向的不同看法。生物学的研究应当采取什么样的方法？未来生物学的重点在什么地方？对生物学和物理学关系问题的不同回答，直接关系到对这些问题的看法。关于生物学的地位或者说生物学与物理科学关系的争论一直在两对立的派别之间进行，这两个派别，一个可称之为分支论，一个可称之为自主论。分支论认为，生物学在原理和方法上与物理科学并没有什么不同，而且未来的研究到了一定的时候会将整个生物学还原为物理科学。与之相对，自主论则认为生物学理所当然地是一门自主的科学，因为它研究的对象、它的概念结构和方法论与物理科学根本不同。联系到前面提到的生命科学哲学兴起的背景，我们就可以看出，分支论和自主论实际上是对传统科学哲学危机和生物学迅速发展的两种不同的反映。从科学哲学的转折来看，本世纪五十年代后，由于波普尔的批判，科学哲学从逻辑实证主义走向与之相对的历史主义。然而，并不是所有的哲学家都在这种转折中追随波普尔、库恩等人放弃了实证主义，相反，有许多哲学家仍然坚持实证主义的基本原则，只是在细节上对实证主义作了不同程度的修改。 这些哲学家有人把他们称作后实证主义者（Postpositivist）。后实证主义的基本观点是：（1 ）科学是通过建立越来越普遍的经实验验证并具有解释能力的经验概括发展的，这些经验概括进一步被组织到更普遍的理论中去以更加扩展和加深这些概括的解释的统一性和预言的精确性；（2 ）科学解释就是要把被解释的对象归并到普遍的规律或定律之下，因此，任何科学都需要规律或定律或至少是可改进的概括；（3 ）科学需要规律或定律还因为实践的预言和控制也是依据规律或定律做出的。没有规律或定律，不仅解释是不可能的，预言和控制就更不可能。（4）不同的学科有不同的发现、规律和理论，但所有这些发现、 规律和理论将最终组成一个连贯的理论阶梯，在这个理论阶梯中，可从最基本的物理学的理论和规律出发推演出所有其它学科的理论和规律，即所有的学科最终可统一于物理学。当然后实证主义的观点并不仅是我们所列的这些，但对我们的问题这已足够。很显然，后实证主义的这些观点只不过是对实证主义的进一步修正而已，它们的基础仍然是物理科学。在生物学的惊人发展面前，这样的关于科学本性的结论适合生物学吗？很显然，从生物学目前的状况看，它还不能立刻地，明显地满足后实证主义的描述。生物学目前还不象物理科学那样有许多简单、精确、相互联结并具有解释和预言能力的定律或规律；它的许多发现和描述语言与物理学和化学的发现和语言很少联系；它研究的模型系统的普遍性也是有限的。所有这些特征使它成为验证后实证主义科学哲学的很好的场所。这些不同是表面的、暂时的，还是本质的、永恒的呢？于是，在哲学家中间，生物学与物理学是否不同和怎样不同的问题，就变为生物学是否和怎样与后实证主义的哲学图景相符合的问题。回答相符合的哲学家，就竭力从生物学中寻找材料证明后实证主义哲学图景的普遍性，并竭力证明生物学与物理学的上述差别是暂时性的。回答不相符合的哲学家则相反，他们从生物学寻找材料反对后实证主义的哲学思想，并竭力表明，生物学与物理学差别是永远不会消失的。以上是分支论和自主论争论的哲学根源——后实证主义和反实证主义（antipositivism）。分支论和自主论的争论还有其科学自身发展的依据。本世纪中叶以后，生物学中最激动人心的事件就是分子生物学的革命。由于这一革命，生物学的许多现象都可根据DNA 分子的结构得到解释。分子生物学的成功使许多生物学家以及哲学家坚信，生物学的所有现象最终都可以根据它们组成部分的物理化学规律完全得到说明，物理学和化学的方法完全适合生物学研究。DNA 双螺旋结构发现者之一克里克就断言：“生物学当代运动的最终目标事实上就是根据物理学和有机化学解释生物学。对于这一点有很多理由。因为化学和物理学的相关部分……量子力学与我们关于化学的经验知识一起，表明能为我们提供建立生物学的确定性基础，这与牛顿力学……为比如机械工程提供基础是同样的方式。”(〔4〕P10)物理学和化学之所以能为生物学提供一个“确定性基础，”在这些人看来，是因为生物体最终是由物理材料——运动中的分子和原子组成的。这些分子和原子在生物体中被聚集在不同的组织水平上，一些水平甚至能避开其它水平自主地活动，但是最终都是物理学和化学的产物。因而克里克说：“最终人们希望生物学的整体可根据比它低的水平进而正好从原子水平得到解释”。(〔4〕P12)既然生物有机体可以从其组成部分的物理特性和化学特性得到解释，所以这些生物学家和哲学家继续断言，整个生物学最终将变为物理学和化学的一个分支。这些生物学家和哲学家就是我们所说的分支论者，概括起来，他们认为：“生物学最好能成为物理科学的一个分支，一个能够通过运用物理科学方法，现在特别是物理学和有机化学的方法发展的独立分支”。(〔3〕P16)他们把分子生物学作为用物理学和化学研究生物学的最成功的范例，因此，对他们来说，生物学的其余部分都应象分子生物学一样，主动地与物理化学靠近。目前，生物学和物理科学之间仍然存在着很大差别，有许多生命现象还不能用物理学和化学解释，但他们认为，随着生物学和物理学的发展，最终都可以用物理学和化学来解释。然而，除了分子生物学之外，群体遗传学、综合进化论、生态学、行为学、分类学等生物学学科在本世纪也得到了革命性发展，“都显示空前繁荣，茁壮成长”。这些学科都有其本身的词汇，方法论和概念结构，与其它学科特别是物理科学很少联系或只有最少的接触。因此，面对分支论的挑战，从事这些学科研究的生物学家以及从这些学科搜集材料的哲学家就认为，尽管物理学和化学方法在生物学研究中曾取得过振奋人心的成绩，但是物理学和化学的方法并不能完全适合生物学的主题内容。他们认为“生物学真正重要的目标以及获得这些目标的适当方法，与其它科学的目标和方法是如此不同，以致于生物学的理论和实践必须与物理学和理论实践保持持续的隔离。”(〔3〕p16) 这些生物学家和哲学家就是自主论者。根据他们的观点，生物学追寻的是回答物理学不能回答的问题，因而生物学必须运用物理学提供不了的方法和手段，当然，生物学也可自由地借用物理学的理论和方法，但它不能仅仅简单地靠借用发展，它必须形成自己的方法。生物学运用物理学方法在某些方面能够取得成绩，但生物学若运用自己独立的方法则会取得更大更明显的成就。分支论与后实证主义的观点是一致的，但在自主论者看来，后实证主义从物理学中得出的科学图景对生物学来说是完全错误的。生物学当然是一门自主的学科，后实证主义那种建立在物理科学基础之上的科学统一观念会使生物学走向迷途，并阻碍生物学的快速发展。除了分子生物学以及宏观生物学自身研究特点、研究方法使一些人支持分支论、一些人支持自主论外，未来生物学研究的重点在哪一个方面，也是人们支持分支论或自主论的重要原因，或者说是动机。著名生物学家和哲学家恩斯特·迈尔曾说：“许多物理学家坚信全部生物学的见解都能归结为物理学的定律，这种情况使许多生物学家为了自卫而主张生物学的自主性，很自然，不只是物理学家，而且信奉本质论的哲学家也极力反对这种生物学的解放运动，但是这种解放运动在最近几十年不断增强了力量。物理科学的原则，理论和定律是不是能说明生物科学中的每件事呢？生物学至少部分的是不是自主的科学呢？对于这些问题的冷静讨论，由于物理科学和生物科学明显的对抗情绪，甚至是互相敌对的情绪，就成为非常困难的事情。许多人曾经想把各门科学分类排列，把数学（或者特别把几何学）规定为科学的皇后。在为争取各项荣誉如诺贝尔奖金、政府及大学的预算、职位以及在非科学家中的普遍声望的竞争中，这种对立变得非常表面化了”。(〔1〕pp37—38) 从迈尔的话里我们可以看出，生物学家支持或反对生物学自主性的一个重要原因是为自己从事的职业的重要性作辩护。 3 争论问题的展开围绕“生物学和物理学是否不同和怎样不同这个基本问题，自主论和分支论展开了一系列的争论。从争论问题的普遍性程度看，主要有以下几个不同层次的问题：首先，最普遍的一个问题是生物学和物理学研究的目标或战略是否相同的问题。自主论认为，在生物学和物理学的基本研究战略中存在如下一个明显的差别：物理科学的解释框架是机械论的，而生物学的解释框架则是有目的的、目的论的或功能的。这里所说的机械论广义地说是指这样一种观点：一个系统的行为是通过它的组成部分的牛顿性质——位置和动量（或它们的其它替代量）决定的，一个机械（力学）系统的行为是该系统组成部分的位置和动量数值的数学函数。物理科学对其需要解释的现象都是通过扩展这些力学概念及建立这种数学函数解释的。生物学的解释框架则与此不同，主要是目的论的。这里所说的目的论是指通过寻求系统的目标、功能、需要来解释系统的行为。生物学在解释生物现象时不是通过寻求构成生命系统的力学行为来完成，而是通过发现整个系统以及它的组成部分服务的目标、功能或需要来解释。这就是说，生物学解释主要依靠的是对生物系统服务目标的正确辩别，而在物理科学中，没有目标、目的、功能、需要等概念的位置和空间。因此，生物学和物理科学研究的总体目标就不相同：一个通过把现象分解成它的组成部分的力学行为来解释，另一个则通过在一个给定的现象中辩别出一个功能网络来解释。在这种情况下，两个领域的基本研究战略就必然不同。分支论者也承认物理科学与生物科学在解释方式上存在这种差别，但与自主论者相反，他们认为这种差别是表面的，是可以排除的。争论的第二层次的问题是关于生物学和物理科学中理论的本性、数目和关系问题。物理科学的研究对象可区分出不同的层次，对不同层次对象的研究可形成不同的理论，发展出不同的学科分支。这些不同的学科分支和理论可能是独立研究、独立建立的，然而，在物理科学中已达到这样一种水平，不同层次的理论可以逻辑地、数学地整合在一起。力学、光学、热学、电磁学、量子力学、相对论以及化学键理论、化学动力学理论、平衡常数理论等，都如此紧紧地连结在一起，以致于我们可以把这些理论从更基本的到派生的加以分类，然后用基本的解释派生的，并且可以根据一个领域的理论新进展预测另一个领域理论发展的情况。相比之下，生物科学中的各种理论间的联系就没有这么紧密。进化论、遗传学、生态学、古生物学、胚胎学、发育学、生理学等等学科都有其自身的理论，但这些理论之间的联系，并不象物理科学那样可以形成演绎关系，可以数学地整合在一起。举例来说，进化论对生物学的地位，就象牛顿力学对物理学的地位一样重要，然而，它们的理论结构却大不一样。牛顿力学本身的定律可用数学公式表示，其定律之间可形成严密的推理关系，其理论体系可用公理化方法建立，而进化论的理论内容只能定性描述而不能数学化，尽管有人试图对进化论也作公理化处理。通过牛顿力学可以推演出物理科学其它领域的一系列理论，而通过自然选择理论却推不出比如分类学、古生物学、形态学、胚胎学、生态学、遗传学中的有关理论，尽管有人说自然选择理论统一了这些学科。面对生物科学与物理科学理论本性、数目和关系的这些差别，自主论认为，这反映了生物科学自身的独特特点，说明生物学是一门自主的科学，而分支论则认为这种差别是暂性的，这表明生物学在目前还不是一门特别完善的科学，随着生物学的发展，这种差别将最终消失。争论的第三层次的问题是关于生物学中是否存在规律以及规律的形式问题。一般说来，物理科学的理论是由一系列规律或定律经整合或演绎构成的。因此，传统科学哲学都把规律或定律看作是科学理论的象征，认为任何一门科学都应有自己独特的规律或定律。生命科学理论范式的形成，使一些人对此发生了怀疑。生物科学的理论是由规律或定律构成的吗？在当前的争论中，一些自主论者提出了否定意见，认为在生命科学中并不存在规律，他们认为规律或定律的观念是传统科学哲学的偏见，新哲学应摒弃这种偏见。生物学若没有规律，生物学如何存在和发展呢？这些人认为在生物科学的理论结构中概念起着中心地位，生物学的发展表现在概念含义的扩展和新概念的提出。不过，也有一些自主论者象分支论者一样承认生物学中存在规律，但他们同时又认为，这种规律是独特的，与物理科学的规律相比，不仅在内容上而且在形式上都是不同的。这些自主论者认为，物理科学的规律反映的是推挽式的（push—pull）因果机制一个在先的原因产生一个或多个结果，而生物学的规律描述的却是生物目标、目的或功能与为了得到它们的生物系统之间的关系。目标和它解释的行为之间的关系不是物理意义上的因果关系，因为在物理科学中，在后的目标不能解释产生它的事件，但在生物学中，先在事件是由目标解释的。因此，物理科学中的规律是因果性的，而生物科学中的规律则是功能性的或目的论的。反对这一点的分支论者长期以来一直试图分析自主论者所说的规律的意义，以便它们也能在非目的论的概括下被表达。分支论者认为，生命现象不过是物理现象的一个复杂的种类，所以对生物学现象的描述与对物理现象的描述就没有什么种类上或本质上的区别。对他们来说，目的论描述或者是物理规律的方便省略，或者是通向另外的用物理规律对生命现象作更精确的描述的中转站。争论的第四个层次的问题是关于一些只在生物学中出现而不在物理科学中出现的概念和语词的含义的争论。比如关于生物学和物理学研究战略差别的重大争论 目的论和因果关系的争论必然要涉及到一些概念，象“适合”、“适应”、“竞争”、“掠夺”、“拟态”等。在分子生物学中，人们毫无顾忌地使用象“识别”、“密码”、“错误”等概念。这些概念都是目的论的概念，在物理学中是不存在的。它们能被转译成没有目的论的概念吗？它们在生物学中的存在是否说明生物学有严重错误的内容？这些都是值得深入思考的问题。总之，围绕生物学哲学的基本问题，哲学家们在从整体研究纲领、目标直到个体概念四个不同层面的具体问题展开自己的讨论，这些问题即互相区别又互相联系，使生物学哲学从总体上既表现出内容上的多样性，又表现出统一性。
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恶性疟原虫抗原变异分子机制[9]以及疟原虫攻击红细胞机制[10]等、微量化与自动化等优点 1·2 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,有资料显示[12]、应对突发公共卫生事件中蚊媒传染病的发生提供参考,还可传播寄生虫病,以期为蚊媒传染病的防制分子生物学技术在国内防制虫媒传染病领域的应用【摘要】 本文综述了国内近年来,在特定的条件下我国法定报告的传染病中 1 常用的分子生物学技术[3] 1·1 核酸分子杂交技术核酸的分子杂交(molecular hybridization)它是利用核酸分子的碱基互补原则、有序地固定于经过相应处理的载体上,若异源 DNA或RNA之间的某些区域有互补的碱基序列、狭槽(slot)杂交和菌落原位杂交,通过杂交信号的强弱及分布, PCR) 是以拟扩增的DNA分子为模板、不对称pcr (asymmetric pcr);配套软件不够完善通过不断重复这一过程常规丝虫检测是在夜间采血 PCR各种应用模式,分子生物学技术在虫媒病中蚊媒传染病防制的应用情况 2·2 丝虫病黄志彪等[11]运用PCR技术检测血液中的班氏丝虫微丝蚴,同时新合成的DNA片段也可以作为模板 2 分子生物学技术在虫媒病诊断的应用 2·1 疟疾黄炳成等[4]用pBF2 DNA片断杂交的双方是待测核酸序列及探针,然后加入标记的待测样品,并在同一反应管中进行多重PCR对登革病毒进行分型鉴定、玻片核酸探针可用放射性核素,双链解开成两条单链:分为液相杂交和固相杂交 1·3 DNA芯片基因芯片又称DNA芯片(DNA chip)或DNA微阵列 (DNA microarray)、死亡率高,则在复性时可形成杂交的核酸分子,但在实践中其研究成本较高;PCR扩增系统可用于检测班氏丝虫病患者血样中的循环DNA,分为Southern杂交和 Northern杂交、数量及序列根据其来源和性质可分为cDNA探针、生物素或其它活性物质标记、转录因子调控网络[6] 2·3 登革热病郑夔等[13]应用多重PCR技术快速鉴定4种血清型登革病毒,主要通过媒介的控制进行防制[2];也有报道应用寡核苷酸芯片技术能同时确认流感和登革热病毒[14],在医学领域的应用日趋广泛,镜检血片结果亦为阴性,与异源的DNA或RNA (单链)复性、加端 pcr,有一定的地域性和时间性,并取得了重大进展,随着分子生物学技术的研究和发展;方法标准化不足,证实了2004年在广东发生的登革热疫情为I型登革病毒、RNA探针等,能用于周期性或夜间周期性丝虫病的日间血检工作特点, SsP/是采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量特定序列的探针分子密集、反向pcr ( inverse pcr或reverse pcr),以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物,获得有效的治疗和保护:根据被测定的对象,除了传播病毒性疾病外 【关键词】 分子生物学技术、复合pcr (multiplex pcr),按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成、套式引物(nested primer) pcr、基因组探针,虫媒病占 13种,从而获得受检样品的遗传信,使DNA的合成量呈指数型增长,可以使目的DNA片段得到扩增 1992年在国际虫媒病毒中心登记的已达535种;根据所用的方法:具有通量大这类疾病大都属于自然疫源性疾病;根据环境条件,其中128 种对人有致病性[1],分为斑点(dot)杂交,并行性、标记pcr ( lp-pcr)和彩色pcr;虫媒;传染病虫媒病是由节肢动物携带病原体传播的一组疾病,发病率低、反转录pcr方法检测 近年来基因芯片在疟原虫的研究内容还有疟原虫新基因发现[5]:兼并引物( degenerate primer) pcr,从多种疟原虫DNA样本中检出恶性疟原虫长期受这种疾病困扰的地区将有望通过这种技术的完善,蚊虫作为媒介,来分析目的分子的有无,可检出lOOul阳性血样中的l条班氏丝虫微丝蚴,在DNA聚合酶的作用下、定量pcr, 作者就近年来分子生物学技术在蚊媒传染病的诊断和防制等方面的应用综述如下、锚定pcr或固定 分类、寡核苷酸探针、疟原虫适应人体宿主机制[7],从根本上改变了丝虫病的诊断,进行多元杂交,经标记后作探针、疟原虫比较基因组杂交分析[8];用于检测班氏丝虫监测点540份血液样本结果均为阴性、监测和工作方式
【综述】几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用翁康生 病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一, 它们极大地威胁着人类健康。目前还存在人类尚未认知或新出现的病毒, 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现,鉴别未知的或新出现的病毒, 是有效的预防和控制的先决条件之一。因此, 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。近20 多年来, 常采用传统的微生物学技术方法和现代分子生物学技术方法相结合的途径, 发现和鉴别未知病毒。通过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建立的PCR、杂交等方法, 作特异核酸序列的检测、用分子生物学技术获得未知病毒核酸序列, 查询基因数据库, 检出并确定未知病毒基因组序列, 最终发现鉴别出未知病毒。对于无法用细胞分离培养的未知病毒, 有的采用免疫学与分子生物学技术相结合, 筛选获取病毒特异抗原编码基因的克隆, 进而发现鉴别出该病毒。更多的则是采用相应的分子生物学技术, 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列,进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养分离, 最终对其基因组序列的测定分析, 是鉴别和判断的决定性依据之一, 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。从少量样品中, 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中, 分离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸片段, 供进一步克隆、测序、生物信息学分析, 是用分子生物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕, 也是最终测定分析, 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分, 可采用的技术方法也有所不同, 现将有关技术与其应用作一简介, 以供参考。1 代表性差异分析法代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法, 并不断得到演化, 发展和应用。病毒感染宿主细胞后, 与未感染的同类细胞相比, 二者核酸物质间的差异主要在于是否存在病毒核酸。消减去二者核酸间相同序列的背景部分, 扩增、比较、选取余下可能存在差异的部分, 进一步分析以发现未知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同, 可选用相应的代表性差异分析法, 见表1 。111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation differenceanalysis , DNA RDA)此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用病毒核酸类型DNA RDA c DNA RDA非rRNA 序列6 核苷酸引导c DNA RDAds DNA 线状√ds DNA 环状√ss RNA polyA( + ) √ss RNA polyA( - ) 3 √ds RNA polyA( - ) √ 3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。而建立的。方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ,T- DNA) 和对照DNA(Driver DNA ,D - DNA) 设为二组,分别用同一种限制性内切酶酶切处理,并接上5′端去磷酸化的人工接头,补齐接头后,加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物上的人工接头后,切出的T - DNA 连上第二种人工接头,变性后与过量的变性D - DNA 杂交。通过杂交,消减去T- DNA 中与D - DNA 中同源的核酸序列,而只存在于T - DNA 中的靶序列DNA(Target DNA) 则自我退火复性,其两端连有第二种人工接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ,只有靶序列DNA呈指数扩增,因而得到进一步富集。进过如此重复的几个轮回后,以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ,将T- DNA 中呈现的差异部分作分离,克隆,序列分析。Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ,在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA作T- DNA。以此作为实验模型,用DNA 代表性差异分析法成功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术,Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现一段类似人类疱疹病毒的基因, 并由此发现一种新的病毒HPV8。以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation differenceanalysis , cDNA RDA)Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点,提出了cDNA 代表性差异分析法。它的基本原理与DNA RDA 相同,主要不同在于,采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶,它的识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高,平均酶切片段长度约256 bp ,保证了cDNA 序列群中绝大多数序列,至少被切出一个片段可扩增,供差异分析,分离鉴定。cDNA RDA 技术相对经济,可高效灵敏地用于非常少的起始材料而获得结果〔15〕。具有polyA( + ) - RNA 病毒,其核酸可类似于mRNA 分离纯化,因此可应用此技术。利用cDNA RDA技术,发现鉴定了TiV、MenV ,等〔16 ,17〕RNA 病毒。113 非rRNA 序列6 聚核苷酸引导反转录的cDNA RDA中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13 ·317 ·© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing H All rights ( - ) - RNA 病毒,其核酸物质不似于mRNA ,需和宿主细胞总RNA 同时分离,并用随机引物作反转录。因为宿主细胞总RNA 中rRNA 约占80 % ,由于竞争反应、靶序列信号被湮灭等原因,从这样的总RNA 抽提物中,用随机6 聚核苷酸引物引导反转录的cDNA RDA 技术,发现鉴别polyA( - ) - RNA 病毒核酸序列是困难的。Endoh 等〔18〕罗列了6 聚核苷酸所有可能的排列组合,共计4 096 个序列模式,以大鼠18S、518S、28S 等rRNA、微卫星重复序列、SARS - CoV、BI - 3 病毒等的序列数据为模型,筛选出在rRNA 序列中出现频率极低或不出现的6 聚核苷酸序列模式共96 种。将这些序列分别合成并混合后,称之为非rRNA 序列6 聚核苷酸引物。生物信息学分析96 种序列模式在哺乳动物病毒科具代表性的1 791 个病毒基因组序列中出现的频率,数据表明,非rRNA 序列6 核苷酸引物可引导绝大多数病毒的cDNA 合成。分别用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物和随机6 核苷酸引物作cDNA 反转录效率、cDNA RDA 试验,结果表明,二类引物对人工合成的RNA (二类引物在其序列中出现的频率相似) 反转录效率几乎相等,而前者对细胞总RNA反转录效率远低于随机引物。用二类引物作cDNA RDA ,检测人工合成的RNA ,前者灵敏度是用随机引物的30 倍。在模拟实验中用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物引导反转录,串联cDNARDA 技术,检测鉴别出感染细胞的BI - 3 和SRAS - Cov 核酸序列片段。此方法能从1μg 总RNA 中检测出3 ng 的外来RNA ,其检测灵敏度不及普通的PCR 检测方法,但对于检测鉴别在宿主细胞中复制,但不知其基因序列的poly A( - ) - RNA 病毒而言,也是一个可选择的方法。114 抑制消减杂交cDNA RDA 技术结合消减杂交和PCR 抑制作用〔19〕的技术原理,Diatchenks 等〔20〕等发展出了抑制消减杂交技术( suppressionsubtractive hybridization ,SSH) 。与前两种RDA 技术不同点在于,SSH 技术将内切酶酶切处理的T - cDNA 分为两份,分别接上不同序列的去磷酸化的接头1 和2 ,分别于过量的D - cDNA作第一轮杂交。杂交过程中两组中的单链T - cDNA 浓度趋同,T- cDNA 中的非靶序列单链cDNA 与D - cDNA 中相应序列形成杂交双链而被消减, T - cDNA 中差异表达的单链cDNA被显著富集。合并一轮杂交物,加入过量变性D - cDNA ,作第二轮杂交。合并的二组份一轮杂交物中剩下的趋同化、经消减杂交后的单链T - cDNA 能互补杂交, 可以形成: 原组内T- cDNA 单链间的杂交、T - cDNA 与D - cDNA 单链间的杂交、二组间T- cDNA 单链间的杂交。补齐杂交反应后双链cD2NA 末端,用分别与接头1 和2 的外侧部分序列互补的寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。二组份间T- cDNA 互补单链杂交物,因两端分别具有接头1 和2 ,可被指数扩增;T - cDNA 与D -cDNA 杂交物和剩余单链T- cDNA ,因一端具接头序列,被线性扩增;而同组间T- cDNA 杂交物两端具反转重复长序列,因抑制性PCR 效应,在PCR 反应循环中分子内退火形成稳定的“锅柄结构”〔19〕而不被扩增。因此,SSH 技术通过二轮消减杂交和抑制性PCR 特异扩增,使假阳性大大降低,提高了检出低丰度靶mRNA 的灵敏度。Hu 等〔21〕应用SSH 技术,结合反转录酶的模板切换(tem2plate - switching) 功能, 以HCV RNA 阳性血清体外感染的人MOLT- 4 急性淋巴母细胞白血病T 细胞系为模型,通过反转录合成全长cDNA、抑制性消减杂交、消减的cDNA 文库构建、反相斑点杂交筛选,在被筛的96 个克隆里,T- cDNA 探针杂交呈特异阳性的16 克隆中,序列分析后得到4 个插入HCV 序列的克隆。2 非特异多重引导滚环式扩增法乳头瘤病毒、痘病毒等,其基因物质为环状DNA 分子。在事前未知基因序列的情况下,发现和鉴别这类病毒核酸序列还可选择非特异多重引导滚环式扩增法(multiply primed rolling -circle amplification ,RCA) ,扩增、分离、获取其基因片段供进一步分析。自然状况下,环状DNA 经常以滚环方式进行复制。Dean等〔22〕应用随机6 聚核苷酸作引物,加入φ29 DNA 聚合酶,以质粒DNA 和噬菌体DNA 为模型,建立了多重引物引导的滚环式扩增法。φ29 DNA 聚合酶可长距离( > 70 000 nt) 地结合于DNA模板,进行链置换DNA 合成。而随机6 聚核苷酸引物可多位点的与单链环状DNA 互补复性。在φ29 DNA 聚合酶作用下,以随机引物引导,合成与模板互补的DNA 链。当合成链延伸到与模板结合的随机引物5′端时,在φ29 DNA 聚合酶的链置换活性作用下,下游被延伸的随机引物链被“甩”出模板。而上游的延伸链继续在环状模板上复制合成。同时,被从单链环状模板上“甩”出的互补链,又成为新的模板,随机引物与之结合,在φ29 DNA 聚合酶作用下,继续以枝杈的形式进行链延伸和链置换,最后以双链DNA 串联体形式释放。用此法可使1 ng 纯pCU18 环状DNA 模板延展式地扩增至107倍。Rector 等〔23〕以此原理建立了不依赖已知的特定基因序列(非序列依赖性) 的多重引导滚环式扩增环状DNA 病毒基因组方法,并应用其扩增获取了HPV 16 的基因组DNA。在接近实样的试验样品中,由于稀释倍数和环状DNA 分子较大等原因,将HPV 16 基因组DNA 扩增了214 ×104 倍。3 病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增病毒核酸可包裹于病毒外壳内,病毒的蛋白外壳或脂膜对病毒核酸具有保护作用。而病毒颗粒具有不同于细菌或其他真核细胞的理化特性。利用这样的特点Allender 等〔24〕和Stang等〔25〕各自建立了病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增方法(sequence - independent amplification) 。两种方法的共同点在于,依据病毒颗粒小、具一定密度,用0122μm 滤器过滤、或再串上超速密度梯度离心,从样品中分离出病毒颗粒,DNA 酶酶解游离的DNA ,裂解病毒颗粒,抽提获取较纯的病毒颗粒相关核酸。Allender 等〔24〕借鉴RDA 原理,对病毒颗粒相关核酸用限制性内切酶酶切后,作非序列依赖性单引物PCR 扩增( sequence -independent single primer amplification ,SISPA) :将抽提获取的DNA或RNA 分别补齐,合成第二链DNA ,或反转录,合成双链cDNA。限制性内切酶酶切后,酶切片段两端连接一种接头,并以与接头同序列的单一寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。扩增产物进一步克隆与序列分析。用此法检验HBV 阳性血清和GBV - B 阳性血清样品,结果在相当于106/ ml 个基因组拷贝浓度的50μl样品中,可重复试验检出相应的病毒基因片段。Stang 等〔25〕则在得到双链DNA 或双链cDNA 后加入k - 随机引物,此种引物5′端含有20 个固定序列的核苷酸,3′端则有·318 · 中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing H All rights 核苷酸随机简并序列。与变性模板退火时,6 核苷酸随机简并序列随机地与模板相应序列互补退火,在T4 DNA聚合酶作用下作链延伸。然后在延伸产物中加入k - 随机引物中固定序列部分的20 寡核苷酸作引物,进行PCR 扩增。扩增产物电泳分析、克隆、测序。用此方法检验由实时- PCR 定量,包括病毒颗粒相关核酸及游离核酸在内的病毒基因组拷贝数为109/ ml 的Cox - 3 和MAV - 1 培养物。前者的12 克隆中,9 个克隆插入有肠道病毒的四个不同区域的同源基因片段;而6 个MAV - 1 中分离的克隆内,5 个含有99 % 同源MAV - 1 基因片段。基于病毒颗粒分离纯化、DNase 处理、病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增,获取、鉴定未知病毒的基因片段,尽管灵敏度不够高,但其实验时间较短,步骤相对简单,对于病毒拷贝数高,时间紧急的样品鉴别,是较适宜的一套方法。病毒的种类、结构、特性多种多样,感染病毒后需要检验的样品又各不相同,因此用于发现鉴别未知病毒的核酸序列的技术,也不是固定不变和完全通用的。以上的技术方法各有优缺点和适用范围。而针对扩增获取未知病毒基因组序列片断,这一发现鉴定未知病毒的分子生物学技术的要点或瓶颈,必然还会有新的改进、创新技术出现,将会更快、更灵敏、更简便、更准确的发现鉴别未知病毒。参 考 文 献〔1〕 Drosten C , Gunther S , Preiser W, et al1 Identification of novel corona2virus in patients with severe acute respiratory syndrome1 N Engl J Med ,2003 , 348 : 1967 - 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大
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CD44分子生物学特性及肿瘤关系的研究进展1 粘附分子CD44的研究进展 CD44是分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，在淋巴细胞，成纤维细胞表面均能检测到它的表达[1，2]。CD44蛋白属于未分类的粘附分子，其正常功能是作为受体识别透明质酸（HA）和胶原蛋白Ⅰ、Ⅳ等，主要参与细胞-细胞，细胞-基质之间的特异性粘连过程。 1 CD44基因的定位与结构 人类CD44基因位于11号染色体短臂上，有20个高度保守的外显子，完整基因组在染色体DNA上大约跨越50kb。CD44基因的外显子按表达方式分为两种类型：一种是组成型外显子，另一种是V区变异型外显子。组成型外显子有10个，其中转录片段存在于所有CD44转录子中。仅含组成型外显子的CD44转录子，称为标准型CD44（CD44S），它编码361个氨基酸（Aa）。V区外显子也有10个，在基因组上位于第5和第6个组成型外显子之间，在染色体DNA中专25kb。含有V区外显子的CD44转录子统称为CD44拼接变异体（CD44V）。V区外显子的拼接方式非常特殊，它们既能以连续方式拼接，也能以跳跃方式拼接，参与拼接的V区外显子多少不一，从而使转录片段长短不一。目前通过PCR技术在许多细胞系中已发现10多种CD44V。早期发现血细胞的CD44分子（CD44H）为标准型。最先获得克隆的拼接变异体是含有CD44V8-10的CD44V，它主要存在于上皮细胞又称为上皮细胞型CD44V（CD44E）。目前对CD44的研究较多，如V3、V5、V6。 2 CD44分子的结构特征 从已知的cDNA序列推测，CD44S由341个Aa组成，N-末端起台于21位Aa，前面20个Aa为信号肽，紧接着是胞质外区域的248个Aa，第249个Aa至269位的21个是疏水性的，为跨膜区，其后是胞质内C-末端尾部有72个Aa。另外还有一种CD44S的短尾形式，其胞质内C-末端尾部仅3个Aa。这种Aa序列具有Ⅰ类膜蛋白的特征。Lokeshwar等[3]用实验观察CD44S分子的合成过程，发现CD44分子首先被合成43KD的蛋白前体，接着在内质网内进行N-糖基化，形成58KD的N-糖基化前体，其后在高尔基复合体内进行O-糖基化和其它翻译后修饰，形成最终的85-95KD分子。 1 CD44S胞质外结构域特征：CD44S分子信号肽的N-末端的130Aa内编码了5个Asn-x-Ser/Thr序列和6个半胱氨酸残基，前者是5个N-糖苷键连接位点，其中3个被利用。6个半胱酸形成3个二硫键，形成球形结构域，这一球形结构域的重要特征是与动物连接蛋白有较高的同源性。有两个区域与透明质酸结合，分别是21-45Aa，135-195Aa。 CD44S的胞外近膜区存在一个56Aa的结构域（161Arg-216Asp），含有19个ser和Thr残基，常以2～4个成簇，这些是已知的O-糖基化位点特征，表明CD44有7个潜在的O-糖基化位点，其中4～5个位点被利用。此外这一区域含有4个Ser-Gly二肽，是潜在的硫酸软骨素连接位点。并且已得到证实，CD44分子加上硫酸软骨素后，与其结合细胞外基质的能力有关，包括Ⅰ型胶原、层粘边蛋白、纤粘连蛋白。 CD44分子细胞膜外区域有多个潜在的N-糖苷键连接位点，可连换多个碳水化合物，不仅与分子成熟过程中的翻译后修饰有关，也与细胞的功能状态有关。糖基化赋予CD44分子异质性，而其异质性与不同的O-糖基化程度有关，这种现象是CD44分子所特有的。这种新的糖基化调节方式在CD44S结合不同的细胞外基质成分的能力方面超着重要作用。深入研究这一分子的糖基化调节机制及生物功能方面的联系是十分有意义的。 2 CD44S胞质内结构特征：CD44S分子第249-269跨膜区的Aa序列中存在一个半胱氨酸残基，代表着一个潜在的脂酰化位点，这一位点可与软脂酸连接导致CD44分子脂酰化。在CD44S的胞质内区域尾部存在一结构域可与锚蛋白（ankyntn)结合。胞质内尾部序列有5个保守的丝氨酸残基，可作为蛋白激酶C（PKC）的底物被磷化[4]。上述脂酰化过程均可增强CD44S分子与锚蛋白的结合能力。比较CD44S和其他G蛋白的序列发现存在4个 同源性高的区域，实验证实CD44还是一种GTP结合蛋白，可结合GDP底物并且有GTP酶活性，显著增强CD44与锚蛋白的相互作用[5]。在CD44合成过程的各种中间产物，发现均有锚蛋白结合位点和结合活性，提示糖基化对锚蛋白结合位点的形成无关，并且结合锚蛋白对于CD44分子的输送和信号传导功能起重要作用。 3 CD44V的特征：目前发现10个V外显子编码的氨基酸中有约30%的丝、苏氯酸残基，具有广泛潜在O-糖基化位点，如：V6具有潜在的O-糖基化位点。V3外显子序列分析中发现Ser-Gly-Ser-Gly片段，它可结合硫酸肝素，结合硫酸肝素后的CD44V能与碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）结合肝素的表皮生长（HBEGF）因子结合，此结果提示这种CD44参与了传递细胞因子的过程。 3 CD44蛋白的主要功能 CD44基因编码合成的CD44蛋白具有一系列功能，包括：①作为导向性受体，调节淋巴细胞在血液和淋巴液间的运行，即淋巴细胞归巢或再循环[6]。②在淋巴细胞自溶、离体淋巴细胞的活化中发挥作用。③促进成纤维细胞和淋巴细胞与胞外基质成分如透明质酸、硫酸软骨素、纤维素、糖原等的粘附。④参与信号传递蛋白可影响蛋白在细胞间的位置，刺激其分泌特异的生长因子具不同的传导作用。⑤结合并中和透明质酸，该作用类似于清除间质组织。⑥调节药物的吸收及细胞对药物的敏感性。 究竟是何种CD44蛋白参与了何种调节，至今不清楚，选择性剪切过程中的多样性CD44蛋白与细胞结合的多样性也表明其中有重要的协间或调节功能[7]。有研究认为，跨膜的CD44糖蛋白，其膜外成分的变异与细胞粘附及导向作用有关[8]。，而胞内分子的尾部则与活化T淋巴细胞的潜在作用有关，而且胞内分子长度可调节蛋白激酶A/C位置，影响细胞的信号传递[9]。 2 CD44分子在肿瘤细胞中的表达 1989年Stamenkevie等使用不同的单抗分离和克隆了一个编码CD44标准型的cDNA，该基因不仅由淋巴样细胞表达，也可由不同的癌细胞系包括实体瘤典型标本中表达。在裸鼠研究某些人的转移癌时发现，CD44基因表达在转移中起作用。在大鼠胰腺癌细胞中非转移性细胞株只表达标准CD44（CD44S），而转移性细胞株表达CD44V，而且将CD44V变异体cDNA转染到非转移性的细胞株可引起转移[10]。Hofmann[11]用 notherm印迹法研究了20多个体外培养的人癌细胞系，也发现许多肿瘤组织能表达CD44V，但在不同细胞中V区外显子的转录拼接模式不尽相同。第一份临床肿瘤标本（结肠癌）的检测结果是1992年由英国年津大学病理实验室的研究人员首先报道的，以后人们应用免疫组化及RNA-cDNA-PCR印迹杂交在肺癌、结肠癌、食道癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、宫颈癌、肾癌和非何杰金淋巴瘤等中发现有CD44V表达。认为CD44V5、CD44V6的表达与肿瘤进展程度、转移及预后密切相关[12]。对于各种癌的实验研究已经进入肿瘤的发生、生长、转移增殖潜能及预后复发各环节与CD44分子表达的相关性，并提出实验数据和假说加以论证。 1 CD44分子与肿瘤的发生、生长、发展 癌的发生发展与癌基因（c-erb2、c-myc， ras）和抑癌基因（P53，nm23）等异常表达有关。有研究表明CD44异常表达可早于ras、P53等基因的异常，所以CD44的变异可能与ras部基因激活有关，是癌形成的一个因素[13]。Muider[14]对结肠癌肿瘤P53突变和CD44蛋白的研究，在结肠肿瘤各期中观察到有统计显著性的P53、CD44V6表达增强的趋势，P53和CD44V6表达间有显著相关性。P53被认为监视基因突变的“分子警察”，失活的P53可引起失控的肿瘤生长，因此P53突变引起失去最后控制时，V6‘表型获得明显的生长优势’。郭亚军等[15]用抗CD44的单抗以阻断其与透明质酸的结合，从而抑制CD44阳性的肿瘤细胞在体内的生长。他推测肿瘤细胞的生长可能是CD44阳性的细胞能与细胞外基质（ECM）中的透明质酸结合，从而获得附着性，并更易从ECM中获得生长因子。FasanoM等[16]报道成人非肿瘤患者肺泡Ⅰ型上皮不表达CD44V6。Ⅱ型上皮细胞和基 底细胞有CD44V6低量表达，Ⅱ型细胞与基底细胞属于干细胞，估计CD44V6对于肺生长有重要意义。所以认为CD44V6对于幼稚细胞生长和对于肿瘤细胞生长的机理可能相似。Lu等[17]发现在宫颈腺癌，无论是原位癌还是浸润癌均有CD44S弥漫表达，且浸润癌比原位癌明显高表达CD44S，几乎所有的原位癌与浸润癌CD44V9均增加，仅有较少的浸润癌表达CD44V4与CD44V6，而原位癌几乎不表达。说明宫颈上皮的癌变与CD44S和几种CD44V表达的量变和质变有关。 2 分子表达与肿瘤的转移、侵润 Matsumura等[18]用PCR技术检测了转移性结肠癌、非转移性结肠癌、正常结肠粘膜的CD44基因表达活性，发现转移性结肠癌细胞CD44变异拼接外显子表达明显增强。Pales等[19]用单克隆抗体检测以CD44表达情况发现，在人类结肠癌标本中，CD44V在浸润和转移的肿瘤中呈阳性表达，并认为CD44V的表达可作为结肠肿瘤浸润的标志。Herrtich[20]研究发现在一些分化不良的息肉中检测以V6外显子在肿瘤浸润中有增强的高频率表达，推测表达CD44V6的肿瘤细胞能够有利于癌细胞浸润和转移的条件。 Granberg等[21]发现在支气管类癌瘤患者，表达CD44S可减低远距离转移，CD44V77-8阳性肿瘤降低远距离转移风险，CD44V9阳性可降低远距离转移及死亡，而CD44V4、CD44V5、CD44V10与临床结果无关，证明支气管类癌瘤具有潜在恶性，CD44S、V7-8、V9阳性可能引起较好的临床结果，可以考虑作为预后评估的指标。 关于CD44V与肿瘤转移相关性的假说如下：激活的淋巴细胞和转移的癌细胞具有许多共性，即都有很强的侵出行为，均有可逆的粘附接触过程进行细胞迁移，在引流淋巴结中两类细胞皆能大量积聚和快速增殖，最后它们都能释放到循环系统，并通过外渗作用进入周围组织，这些相似性很可能基于CD44V6在二者中的共同作用，提示CD44V6在淋巴细胞活化中的作用机理与CD44V6在肿瘤转移中作用机理是相同的。即CD44V6高表达的癌细胞可能获得淋巴细胞“伪装”，逃避人体免疫系统的识别和杀伤，更易进入淋巴结，形成转移[10]。 有结论认为CD44V6变异体可能通过促进癌细胞与血管内皮细胞和细胞外基质的粘附，促进肿瘤细胞向基质侵袭，从而影响肿瘤细胞的迁移和运动能力。也有结论认为CD44V6可能通过影响癌细胞的骨架构像和分布，从而影响癌细胞的运动能力，而影响癌转移。 3 CD44分子对治疗肿瘤的展望 因为CD44V6对于肿瘤的发生、发展都有一定的相关性，推测CD44V6与肿瘤的分型、分化、分期有一定关系，如果这种关系得以明确，我们就可以通过癌组织CD44V6的表达程度来判断癌的类型，所处时期来进行适当治疗。 有研究认为CD44V6的表达要先于抑癌基因的表达，如果能够检测出CD44异常表达，则对于癌的早期诊断有密切关系。已有研究表明，CD44V6可用于诊断。如1997年吴忠等报道，应用RT-PCR技术检测CD44V6在30例尿液标本脱落细胞检测到CD44V6的表达，而在膀胱炎患者和正常志愿者未检测到CD44V6的表达。 肿瘤的转移是癌症患者的主要死亡原因，Seiter等[10]用抗CD44变异型蛋白的抗体与CD44变异型产物相结合，显示鼠癌细胞的转移潜能被终止，这也为大肠癌的治疗提供了又一个可能途径。 手术切除的肿瘤标本中如有CD44V6蛋白阳性，常会伴术后肿瘤再发或远处转移。CD44V6可作为一种有效的癌预后的标志物，用以指导治疗方案的制定。 CD44基因及其选择性剪切在癌的预测、早期诊断、病情进展、转移潜能与预后的估计等方面具有很大的潜在价值。随着分子生物学不断的发展，癌基因研究的不断深入，相信该基因对癌的预测、诊断、治疗、预后的价值会得到更加全面的认识。
不足之处是操作复杂，成本较高。以上分子生物学方法对结核杆菌/html/yaoxue/20080316/html
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选一个具体的方向，写一篇综述好了，例如你可以写癌基因之类的，总之关于医学分子都可以的。至于参考文献可以去CNKI或维普查
论文文献综述怎么写
我呢,代做,没问题的。
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21世纪生命科学的研究进展和发展趋势 20世纪后半叶生命科学各领域所取得的巨大进展，特别是分子生物学的突破性成就，使生命科学在自然科学中的位置起了革命性的变化。很多科学家认为，在未来的自然科学中，生命科学将要成为带头学科，甚至预言21世纪是生物学世纪，虽然目前对这些论断还有不同看法，但勿庸置疑，在21世纪生命科学将继续蓬勃发展，生命科学对自然科学所起的巨大推动作用，决不亚于19世纪与20世纪上半叶的物理学。假如过去生命科学曾得益于引入物理学、化学和数学等学科的概念、方法与技术而得到长足的发展，那么，未来生命科学将以特有的方式向自然科学的其他学科进行积极的反馈与回报。当21世纪来临的时候，一些有远见的科学家、思想家与政治家将日益严重的诸多人类社会问题，如人口、地球环境、食物、资源与健康等重大问题的解决，莫不寄希望于生命科学与生物技术的进步。 2· 08·生命科学将成为21世纪自然科学的带头学科 20世纪50年代DNA双螺旋结构模型的发现，随后遗传信息传递“中心法则”的确立与DNA重组技术的建立使生命科学的面貌起了根本性的变化。分子生物学与遗传学的结合将用10一15年测定出人类基因组30亿个碱基对（遗传密码）的全序列，人体细胞约有10万个基因。人类基因组的“工作草图”迄今20％的测序已达99%的准确率和完成率，今后将要继续发现与阐明大量新的重要基因，诸如控制记忆与行为的基因，控制细胞衰老与程序性死亡的基因，新的癌基因与抑癌基因，以及与大量疾病有关的基因。将利用这些成果去为人类健康服务。 70年代后，分子生物学的发展，以基因工程为代表的生物工程的出现，生物技术通过对DNA链的精确切割与有目的地重组，使有目的地改良生物的性状与品质成为可能。迄今生物工程所取得的成就已在生产上显示出诱人的前景，尽管还存在有不少争议的问题，但很有可能成为21世纪的新兴产业。 发育生物学将要快速地兴起，它将要回答无数科学家100多年来孜孜以求而未解决的重大课题，一个受精卵通过细胞分裂与分化如何发育成为结构与功能无比复杂的个体，阐明在个体发育中时空上有条不紊的程序控制机理，从而为人类彻底控制动植物生长、发育创造条件。 RNA分子既有遗传信息功能又有酶功能的发现，为数十年踏步不前的难题“生命如何起源”的解决提供了新的契机。在21世纪，人们还要试图在实验室人工合成生命体。人们己有可能利用生物技术将保存在特殊环境中的古生物或冻干的尸体的DNA扩增，揭示其遗传密码，建立已绝灭生物的基因库，研究生物的进化与分类问题。 神经科学的崛起，预示着生命科学又一个高峰的来临。脑是含有1011细胞的无比复杂的高级结构体系，21世纪初从分子到行为水平的各个层次对脑功能的研究都将有重大突破，在阐明学习。记忆。思维。行为与感情机理等方面也将有重大进展。脑机能在理论上的进展将会促进新一代智能计算机的研制，这可能成为未来生命科学对自然科学与技术科学回报的最好例子。 生态学可能是最直接为人类生存环境服务并对国民经济持续与协调发展起重要作用的科学。生态学的理论与实践为中国三峡水库建设提供的决策依据就是一个例证。保护生物的多样性是当前生命科学最紧迫的任务之一。据可靠的数据说明每天约有100多种生物在地球上绝灭，很多生物在没有被人类认识以前就已消亡，这对人类无疑是一种灾难。生态学与生物多样性保护与利用的研究成果将指导人类遵循自然规律积极保护自己生存环境，否则人类的物质文明与精神文明都要受到灾难性影响。 顺应生命科学迅速发展的形势，发达国家政府及一些国际组织先后提出了《国际地圈及生物圈计划》、《人类基因组作图与测序计划》、《人类前沿科学计划》、《脑的十年》及《生物多样性利用与保护研究》等投资巨大的生命科学研究计划。其中仅《人类基因组作图与测序计划》，一项预算就高达30亿美元。 由于生命科学的发展，人才的需求量激增，近年除越来越多的物理学家，化学家与技术科学家被吸引到生物学研究领域外，以美国为例，近年统计48万博士学位获得者中从事生命科学的占51％。优秀青年科学家流向生命科学前沿，这是21世纪生命科学欣欣向荣的动力与源泉。 2． 08． 2 21世纪初生命科学的重大分支学科和发展趋势 80年代有远见的生物学家把分子生物学（包括分子遗传学）、细胞生物学、神经生物学与生态学列为当前生物科学的四大基础学科，无疑是正确地反映了现代生命科学的总趋势。遗传学（主要是分子遗传学）不仅当前是生物科学的带头学科，在今后多年还将保持其在生命科学中的核心作用。 有些科学家早就预测到，由于分子生物学、细胞生物学与遗传学的结合，必然促进发育生物学的蓬勃发展，从而提出发育生物学将成为21世纪生命科学的“新主人”，这种预测已逐渐变为现实。 分子生物学（包括分子遗传学）在生命科学中的主流地位，以及它在推动整个生命科学发展中所起的巨大作用是无可争辩的。细胞是生命活动基本的结构与功能单位，细胞生物学作为生物科学的基础学科地位必须给予重视。 很多生物科学家认为神经科学或脑科学的崛起将代表着生命科学发展的下一个高峰，然后将促进认知科学与行为科学的兴起。 生态学可能是最直接为人类生存环境服务，井对国民经济持续与协调发展起重要作用的学科。 A分子生物学 分子生物学是在分子水平上研究生命现象本质与规律的学科。核酸与蛋白质（有人认为还有糖）是生命的最基本物质，因此核酸与蛋白质结构与功能的研究今后仍然是分子生物学研究的主要内容。蛋白质是生命活动的主要承担者，几乎一切生命活动都要依靠蛋白质（包括酶）来进行。蛋白质分子结构与功能的研究除了要阐明由氨基酸形成的并有一定顺序的肽链结构外，今后将特别重视肽链拆叠成的特定的三维空间结构，因为蛋白质生物功能与它的空间构型关系极为密切，核酸是遗传信息的携带者与传递者，遗传信息由DNA～RNA一蛋白质的传递过程，称为遗传信息传递的“中心法则”，是分子生物学（分子遗传学）研究的核心。其基本问题己比较清楚，当前研究的重点是： ①约经10一15年，人类基因组30亿个碱基对全序列（遗传密码）可以测出，这是具有里程碑意义的工作； ②真核生物基因表达过程在各层次上调节的研究仍然是今后相当长一段时间的任务。 分子生物学的概念、方法与技术和各学科的渗透，正在形成很多新的学科，诸如分子遗传学、细胞分子生物学、神经分子生物学、分子分类学、分子药理学与分子病理学等等。因此分子生物学在生命科学中的主导作用还将要持续下去。 B遗传学 遗传学比分子生物学更具有自己独立的学科体系。但现代遗传学与分子生物学是不可分割、相互交叉的两个学科，且很难截然分开。 有些著名的遗传学家把遗传学概括称为基因学，因为现代遗传学主要是研究生物体遗传信息传递与表达的学科。基因携带的信息是由基因的结构所决定，信息的表达是由基因的功能实现的，因此遗传学研究的是基因的结构与功能。从遗传学的角度看，所有生命现象的机制，追根究底都会与基因的结构与功能相关。因此遗传学在今后较长时间仍然是生命科学的核心学科和推动力。 有人估计人体细胞内约有10万个基因，迄今弄清楚的不到5％，所以与重要生命活动有关与疾病有关的新基因的发现与阐明将是今后几十年的重要任务。 C细胞生物学 著名生物学家威尔逊（Wilson）早在20世纪20年代就提出一句名言“一切生物学关键问题必须在细胞中找寻”，至今还有着很深的内涵。魏斯曼与摩尔根都曾先后试图在细胞研究的基础上建立遗传、发育与进化统一的理论，虽然当时没有找到具体解决的途径，但关于细胞的知识在生物科学中的重要性是显而易见的。细胞是一切生命活动结构与功能的基本单位，细胞生物学是研究细胞生命活动基本规律的科学，细胞的结构。细胞代谢、细胞遗传、细胞的增殖与分化，细胞信息的传递与细胞的通讯等是细胞生物学主要研究内容。虽然今后细胞生物学研究的内容是全方位的，但概括起来可能是两个基本点： 一是基因与基因产物如何控制细胞的重要生命活动，如生长、增殖、分化与衰老等，在此要涉及到一个全新的问题，细胞内外信号如何传递；二是基因产物一一蛋白质分子与其他生物分子如何构建与装配成细胞的结构，并行使细胞的有序的生命活动。 今后20多年，以下一些问题可望取得重要进展与突破： ①遗传信息的储存、复制与表达的主要执行者——染色体的结构与功能可能在不同的结构层次上得到阐明。 ②细胞骨架（包括核骨架与染色体骨架）的研究将得到全方位的进展。 ③细胞生物学与分子生物学、遗传学的结合，将在细胞分化机理研究方面有重要突破，为发育生物学快速发展奠定基础。 ④细胞衰老与细胞程序化死亡的机理将在更深层次上阐明。 ⑤以细胞分子生物学为骨干学科与其他学科结合，人工装配生命体的理想可能逐步 实现。 D．发育生物学 从一个受精卵通过细胞分裂与分化如何发育成为一个结构与功能复杂的个体，是至今未能解决的生命科学的重大课题，也是发育生物学的主课题。由于近几十年分子生物学、遗传学与细胞生物学所取得一一系歹（突破性成果与知识的积累，已为解决这一重大课题创造了条件，这也就是今后发育生物学应运而飞速发展的原因。 发育生物学当今要解决的基本问题是细胞的基因如何按一定的时空关系选择性地表达专一性的蛋白质，从而控制细胞的分化与个体发育。阐明基因在多层次水平上控制胚胎的发育就不仅是涉及到个别基因的问题，而是一系列调节基因在时空上的联系与配合，从而支配发育的程序。虽然这是难度极大的课题，但近年已初见端倪并有所突破。估计今后发育生物学将沿着这条道路深入下去，并可望取得丰硕的成果。 E．神经科学（或脑科学） 神经科学是研究人与动物神经系统（主要是脑）的结构与功能，在分子水平、神经网络水平、整体水平乃至行为水平阐明神经系统特别是脑的活动规律的学科群。脑的结构与功能是无比复杂的高级体系，含有10 11细胞。它是感觉、运动、学习、记忆、感情、行为与思维的活动基础。大脑细胞，口何指导人与动物的行为是未来生物学中最富潜力与最吸引人的领域；神经科学的崛起，预示着生命科学又有一个高峰的来临。神经科学或脑科学必然在下世纪促进认知科学与行为科学的兴起。因此各国政府投入巨资支持这一课题，包括美国总统签署的“命名1990年1月1日为脑的10年”不是没有道理的。 在今后几十年内可以预示到的神经科学突破性的进展可能包括： ①在分子到行为的各层次上阐明学习、记忆与认知等活动的基础； ②很快会发现与阐明一系列与记忆、行为有关的基因与基因产物； ③神经细胞的分化与神经系统的发育研究会有重大进展； ④脑机能在理论上的进展与突破（如模式识别、联想记忆、思维逻辑机理的阐明）会 促进新一代智能计算机与智能机器人的研制； ⑤一系列神经性疾病与精神病的病因可望在神经生物学研究中得到解释。 F．主态学（包括物种多样性保护研究） 生态学是研究有机体与周围环境——包括非生物环境与生物环境相互关系的科学。 由于生态学理论与应用是与世界环境保护。资源合理开发与保护，以至人类本身在地球上继续生存紧密相关的，尤其是地球环境日益恶化的情况下，生态学的重要性就变得十分突出。未来生态学的主要任务是协调人类活动与环境的关系。所以生态学经典学科的概念与研究内容必然要适应人类生存环境的保护与社会经济持续发展的要求而不断改变。 今后生态学研究的重点可能表现在以下方面： ①生态群落的多样性、稳定性与演变规律与人类活动的关系； ②全球气候变化对生态系统结构与功能的影响； ③生物多样性的保护和永续利用也是保护人类自身生存环境尤其是拯救濒临绝灭的 生物种类更加具有紧迫性； ④城市生态学与经济生态学将迅速发展； ⑤生态工程与生态技术将在国民经济建设中发挥作用。 G．空间生命科学 空间环境向生命科学提出了新的挑战，也为生命科学的发展提供了机遇。 21世纪人类的空间活动将要离开地球附近，探索月球及其他太阳系的大体。这就要求人在地球外各种环境中能长期地生活和工作，首先是在，长期空间飞行器中航行，月球站以及火星或火卫站等，空间医学必须有重大突破，解决长期在地外空间所遇到的宇航员骨质疏松，肌肉萎缩和兔疫功能变化等生理学难题，同时，与开拓大疆相关联的是受控生态系统，创造一个不需要外界补给，而使人们能在其中长期生活的环境。这些问题有希望在21世纪20一30年代解决，其中空间生理学问题有可能利用中医和中药的方法取得某些重大突破。 地球外层空间为研究重力生物学提供了理想的条件，重力条件对各种层次结构生物的影响仍然是21世纪重力生物学的主题，今后的研究重点将集中于细胞，绿色植物，一些微生物和小动物。特别是重力环境对哺乳动物细胞形态、结构、变异和基因表达的影响将是一个热点。重力生物学的学术意义在于揭示重力效应在生物进化过程中的作用，是自然科学的基本问题；另一方面，重力生物学的成果将是空间制药及空间生态系统等应用领域的基础，重力生物学的学术和应用都是下个世纪的重要课题，可望在21世纪20-30年代取得突破性的进展。 地外生物探索是生命起源的重大课题，其中地球以外的智能生物探索是一个长期的 课题。地球上的人类正在向外层空间发射电波和接收讯号。外星人与地球人之间可能存在的学术和技术差距不仅是一种危险，也是自然科学的重大前沿问题，将被持续地研究下去。 2． 08． 5 21世纪初生命科学最有可能突破的领域 ①人类基因组的全序列（遗传密码）将在10一15年测定完毕，为全部遗传信息的破译奠定基础。 ②与生命活动有关的重要基因与重要疾病有关的基因将被陆续发现，其中特别引人注目的是控制记忆与行为的基因、控制衰老与细胞程序性死亡的基因、控制细胞增殖的系列基因、胚胎发育多层次网络调节基因。新的癌基因与抑癌基因的发现与其生物学功能的释明将大大提高对生命本质的了解。 ③人与动物的高级生命活动：感知、思维、记忆、行为与感情的发生与活动机制在脑科学研究突破的基础上，有更深的认识。 ④癌症的治疗将有全面的突破，爱滋病的防治得到控制。 ⑤在阐明地球上原始生命起源的基础上，人类还可能在实验室合成生命体，这种生命体应具有原始细胞的基本特征。
CD44分子生物学特性及肿瘤关系的研究进展1 粘附分子CD44的研究进展 CD44是分布极为广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，在淋巴细胞，成纤维细胞表面均能检测到它的表达[1，2]。CD44蛋白属于未分类的粘附分子，其正常功能是作为受体识别透明质酸（HA）和胶原蛋白Ⅰ、Ⅳ等，主要参与细胞-细胞，细胞-基质之间的特异性粘连过程。 1 CD44基因的定位与结构 人类CD44基因位于11号染色体短臂上，有20个高度保守的外显子，完整基因组在染色体DNA上大约跨越50kb。CD44基因的外显子按表达方式分为两种类型：一种是组成型外显子，另一种是V区变异型外显子。组成型外显子有10个，其中转录片段存在于所有CD44转录子中。仅含组成型外显子的CD44转录子，称为标准型CD44（CD44S），它编码361个氨基酸（Aa）。V区外显子也有10个，在基因组上位于第5和第6个组成型外显子之间，在染色体DNA中专25kb。含有V区外显子的CD44转录子统称为CD44拼接变异体（CD44V）。V区外显子的拼接方式非常特殊，它们既能以连续方式拼接，也能以跳跃方式拼接，参与拼接的V区外显子多少不一，从而使转录片段长短不一。目前通过PCR技术在许多细胞系中已发现10多种CD44V。早期发现血细胞的CD44分子（CD44H）为标准型。最先获得克隆的拼接变异体是含有CD44V8-10的CD44V，它主要存在于上皮细胞又称为上皮细胞型CD44V（CD44E）。目前对CD44的研究较多，如V3、V5、V6。 2 CD44分子的结构特征 从已知的cDNA序列推测，CD44S由341个Aa组成，N-末端起台于21位Aa，前面20个Aa为信号肽，紧接着是胞质外区域的248个Aa，第249个Aa至269位的21个是疏水性的，为跨膜区，其后是胞质内C-末端尾部有72个Aa。另外还有一种CD44S的短尾形式，其胞质内C-末端尾部仅3个Aa。这种Aa序列具有Ⅰ类膜蛋白的特征。Lokeshwar等[3]用实验观察CD44S分子的合成过程，发现CD44分子首先被合成43KD的蛋白前体，接着在内质网内进行N-糖基化，形成58KD的N-糖基化前体，其后在高尔基复合体内进行O-糖基化和其它翻译后修饰，形成最终的85-95KD分子。 1 CD44S胞质外结构域特征：CD44S分子信号肽的N-末端的130Aa内编码了5个Asn-x-Ser/Thr序列和6个半胱氨酸残基，前者是5个N-糖苷键连接位点，其中3个被利用。6个半胱酸形成3个二硫键，形成球形结构域，这一球形结构域的重要特征是与动物连接蛋白有较高的同源性。有两个区域与透明质酸结合，分别是21-45Aa，135-195Aa。 CD44S的胞外近膜区存在一个56Aa的结构域（161Arg-216Asp），含有19个ser和Thr残基，常以2～4个成簇，这些是已知的O-糖基化位点特征，表明CD44有7个潜在的O-糖基化位点，其中4～5个位点被利用。此外这一区域含有4个Ser-Gly二肽，是潜在的硫酸软骨素连接位点。并且已得到证实，CD44分子加上硫酸软骨素后，与其结合细胞外基质的能力有关，包括Ⅰ型胶原、层粘边蛋白、纤粘连蛋白。 CD44分子细胞膜外区域有多个潜在的N-糖苷键连接位点，可连换多个碳水化合物，不仅与分子成熟过程中的翻译后修饰有关，也与细胞的功能状态有关。糖基化赋予CD44分子异质性，而其异质性与不同的O-糖基化程度有关，这种现象是CD44分子所特有的。这种新的糖基化调节方式在CD44S结合不同的细胞外基质成分的能力方面超着重要作用。深入研究这一分子的糖基化调节机制及生物功能方面的联系是十分有意义的。 2 CD44S胞质内结构特征：CD44S分子第249-269跨膜区的Aa序列中存在一个半胱氨酸残基，代表着一个潜在的脂酰化位点，这一位点可与软脂酸连接导致CD44分子脂酰化。在CD44S的胞质内区域尾部存在一结构域可与锚蛋白（ankyntn)结合。胞质内尾部序列有5个保守的丝氨酸残基，可作为蛋白激酶C（PKC）的底物被磷化[4]。上述脂酰化过程均可增强CD44S分子与锚蛋白的结合能力。比较CD44S和其他G蛋白的序列发现存在4个 同源性高的区域，实验证实CD44还是一种GTP结合蛋白，可结合GDP底物并且有GTP酶活性，显著增强CD44与锚蛋白的相互作用[5]。在CD44合成过程的各种中间产物，发现均有锚蛋白结合位点和结合活性，提示糖基化对锚蛋白结合位点的形成无关，并且结合锚蛋白对于CD44分子的输送和信号传导功能起重要作用。 3 CD44V的特征：目前发现10个V外显子编码的氨基酸中有约30%的丝、苏氯酸残基，具有广泛潜在O-糖基化位点，如：V6具有潜在的O-糖基化位点。V3外显子序列分析中发现Ser-Gly-Ser-Gly片段，它可结合硫酸肝素，结合硫酸肝素后的CD44V能与碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）结合肝素的表皮生长（HBEGF）因子结合，此结果提示这种CD44参与了传递细胞因子的过程。 3 CD44蛋白的主要功能 CD44基因编码合成的CD44蛋白具有一系列功能，包括：①作为导向性受体，调节淋巴细胞在血液和淋巴液间的运行，即淋巴细胞归巢或再循环[6]。②在淋巴细胞自溶、离体淋巴细胞的活化中发挥作用。③促进成纤维细胞和淋巴细胞与胞外基质成分如透明质酸、硫酸软骨素、纤维素、糖原等的粘附。④参与信号传递蛋白可影响蛋白在细胞间的位置，刺激其分泌特异的生长因子具不同的传导作用。⑤结合并中和透明质酸，该作用类似于清除间质组织。⑥调节药物的吸收及细胞对药物的敏感性。 究竟是何种CD44蛋白参与了何种调节，至今不清楚，选择性剪切过程中的多样性CD44蛋白与细胞结合的多样性也表明其中有重要的协间或调节功能[7]。有研究认为，跨膜的CD44糖蛋白，其膜外成分的变异与细胞粘附及导向作用有关[8]。，而胞内分子的尾部则与活化T淋巴细胞的潜在作用有关，而且胞内分子长度可调节蛋白激酶A/C位置，影响细胞的信号传递[9]。 2 CD44分子在肿瘤细胞中的表达 1989年Stamenkevie等使用不同的单抗分离和克隆了一个编码CD44标准型的cDNA，该基因不仅由淋巴样细胞表达，也可由不同的癌细胞系包括实体瘤典型标本中表达。在裸鼠研究某些人的转移癌时发现，CD44基因表达在转移中起作用。在大鼠胰腺癌细胞中非转移性细胞株只表达标准CD44（CD44S），而转移性细胞株表达CD44V，而且将CD44V变异体cDNA转染到非转移性的细胞株可引起转移[10]。Hofmann[11]用 notherm印迹法研究了20多个体外培养的人癌细胞系，也发现许多肿瘤组织能表达CD44V，但在不同细胞中V区外显子的转录拼接模式不尽相同。第一份临床肿瘤标本（结肠癌）的检测结果是1992年由英国年津大学病理实验室的研究人员首先报道的，以后人们应用免疫组化及RNA-cDNA-PCR印迹杂交在肺癌、结肠癌、食道癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌、宫颈癌、肾癌和非何杰金淋巴瘤等中发现有CD44V表达。认为CD44V5、CD44V6的表达与肿瘤进展程度、转移及预后密切相关[12]。对于各种癌的实验研究已经进入肿瘤的发生、生长、转移增殖潜能及预后复发各环节与CD44分子表达的相关性，并提出实验数据和假说加以论证。 1 CD44分子与肿瘤的发生、生长、发展 癌的发生发展与癌基因（c-erb2、c-myc， ras）和抑癌基因（P53，nm23）等异常表达有关。有研究表明CD44异常表达可早于ras、P53等基因的异常，所以CD44的变异可能与ras部基因激活有关，是癌形成的一个因素[13]。Muider[14]对结肠癌肿瘤P53突变和CD44蛋白的研究，在结肠肿瘤各期中观察到有统计显著性的P53、CD44V6表达增强的趋势，P53和CD44V6表达间有显著相关性。P53被认为监视基因突变的“分子警察”，失活的P53可引起失控的肿瘤生长，因此P53突变引起失去最后控制时，V6‘表型获得明显的生长优势’。郭亚军等[15]用抗CD44的单抗以阻断其与透明质酸的结合，从而抑制CD44阳性的肿瘤细胞在体内的生长。他推测肿瘤细胞的生长可能是CD44阳性的细胞能与细胞外基质（ECM）中的透明质酸结合，从而获得附着性，并更易从ECM中获得生长因子。FasanoM等[16]报道成人非肿瘤患者肺泡Ⅰ型上皮不表达CD44V6。Ⅱ型上皮细胞和基 底细胞有CD44V6低量表达，Ⅱ型细胞与基底细胞属于干细胞，估计CD44V6对于肺生长有重要意义。所以认为CD44V6对于幼稚细胞生长和对于肿瘤细胞生长的机理可能相似。Lu等[17]发现在宫颈腺癌，无论是原位癌还是浸润癌均有CD44S弥漫表达，且浸润癌比原位癌明显高表达CD44S，几乎所有的原位癌与浸润癌CD44V9均增加，仅有较少的浸润癌表达CD44V4与CD44V6，而原位癌几乎不表达。说明宫颈上皮的癌变与CD44S和几种CD44V表达的量变和质变有关。 2 分子表达与肿瘤的转移、侵润 Matsumura等[18]用PCR技术检测了转移性结肠癌、非转移性结肠癌、正常结肠粘膜的CD44基因表达活性，发现转移性结肠癌细胞CD44变异拼接外显子表达明显增强。Pales等[19]用单克隆抗体检测以CD44表达情况发现，在人类结肠癌标本中，CD44V在浸润和转移的肿瘤中呈阳性表达，并认为CD44V的表达可作为结肠肿瘤浸润的标志。Herrtich[20]研究发现在一些分化不良的息肉中检测以V6外显子在肿瘤浸润中有增强的高频率表达，推测表达CD44V6的肿瘤细胞能够有利于癌细胞浸润和转移的条件。 Granberg等[21]发现在支气管类癌瘤患者，表达CD44S可减低远距离转移，CD44V77-8阳性肿瘤降低远距离转移风险，CD44V9阳性可降低远距离转移及死亡，而CD44V4、CD44V5、CD44V10与临床结果无关，证明支气管类癌瘤具有潜在恶性，CD44S、V7-8、V9阳性可能引起较好的临床结果，可以考虑作为预后评估的指标。 关于CD44V与肿瘤转移相关性的假说如下：激活的淋巴细胞和转移的癌细胞具有许多共性，即都有很强的侵出行为，均有可逆的粘附接触过程进行细胞迁移，在引流淋巴结中两类细胞皆能大量积聚和快速增殖，最后它们都能释放到循环系统，并通过外渗作用进入周围组织，这些相似性很可能基于CD44V6在二者中的共同作用，提示CD44V6在淋巴细胞活化中的作用机理与CD44V6在肿瘤转移中作用机理是相同的。即CD44V6高表达的癌细胞可能获得淋巴细胞“伪装”，逃避人体免疫系统的识别和杀伤，更易进入淋巴结，形成转移[10]。 有结论认为CD44V6变异体可能通过促进癌细胞与血管内皮细胞和细胞外基质的粘附，促进肿瘤细胞向基质侵袭，从而影响肿瘤细胞的迁移和运动能力。也有结论认为CD44V6可能通过影响癌细胞的骨架构像和分布，从而影响癌细胞的运动能力，而影响癌转移。 3 CD44分子对治疗肿瘤的展望 因为CD44V6对于肿瘤的发生、发展都有一定的相关性，推测CD44V6与肿瘤的分型、分化、分期有一定关系，如果这种关系得以明确，我们就可以通过癌组织CD44V6的表达程度来判断癌的类型，所处时期来进行适当治疗。 有研究认为CD44V6的表达要先于抑癌基因的表达，如果能够检测出CD44异常表达，则对于癌的早期诊断有密切关系。已有研究表明，CD44V6可用于诊断。如1997年吴忠等报道，应用RT-PCR技术检测CD44V6在30例尿液标本脱落细胞检测到CD44V6的表达，而在膀胱炎患者和正常志愿者未检测到CD44V6的表达。 肿瘤的转移是癌症患者的主要死亡原因，Seiter等[10]用抗CD44变异型蛋白的抗体与CD44变异型产物相结合，显示鼠癌细胞的转移潜能被终止，这也为大肠癌的治疗提供了又一个可能途径。 手术切除的肿瘤标本中如有CD44V6蛋白阳性，常会伴术后肿瘤再发或远处转移。CD44V6可作为一种有效的癌预后的标志物，用以指导治疗方案的制定。 CD44基因及其选择性剪切在癌的预测、早期诊断、病情进展、转移潜能与预后的估计等方面具有很大的潜在价值。随着分子生物学不断的发展，癌基因研究的不断深入，相信该基因对癌的预测、诊断、治疗、预后的价值会得到更加全面的认识。
大
你们学校没有CNKI吗？？那里面你要的文章用卡车装。