甲状腺素对猪卵巢卵泡颗粒细胞类固醇激素合成及增殖的影响

繁殖性能是猪最重要经济性状之一,提高母猪的繁殖力可以降低生产成本,提高经济效益。甲状腺是动物机体内重要的内分泌器官之一,主要负责甲状腺激素的合成和分泌。甲状腺激素按化学结构主要分为2种,即三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine,T3)和四碘甲腺原氨酸(又称为甲状腺素,thyroxine,T4)。其中T4是甲状腺的主要分泌产物,而T3是具有生物活性的形式,且发挥作用的主要是T3[1]。因此,当血液中的T4和T3通过转运蛋白进入细胞后,大部分(约80%)的T4被胞内的脱碘酶(DIO1和DIO2)转化为T3,T3结合甲状腺激素核受体(TR),激活转录,调节基因的表达,维持细胞正常生长、分化和代谢[2-3]。甲状腺素作为机体重要的代谢激素可作用于多种靶器官,维持机体的功能正常[3]。因此甲状腺素分泌异常会诱发多种内分泌疾病,影响多种器官的正常结构与功能,比如生殖器官。近年来,随着甲状腺功能紊乱影响繁殖性能相关报道的增多[4-5],甲状腺疾病对生殖功能影响的研究也越来越受到重视[6]。大量研究表明,甲状腺功能紊乱能够影响雌性动物生殖激素的水平。例如,人类临床实验表明甲状腺功能亢进(简称甲亢)女患者血清中性激素结合球蛋白(SHBG)和E2的浓度要高于正常人[7],而甲状腺功能减退(简称甲减)女患者则相反[8]。此外,甲减女患者血清中的促卵泡素(FSH)和促黄体素(LH)浓度会降低,并出现排卵周期紊乱、卵巢退化等现象[9-10]。再者,甲减还与女性月经频发、月经过多、闭经等有关[11]。早期动物模型试验结果显示,甲减能够改变大鼠血清中诸多激素水平,比如FSH、LH、催乳素、雌二醇(E2)、孕醇(P4)等,干扰生殖轴,降低动物繁殖机能[12]。近期,笔者所在实验室在建立的甲减和甲亢大鼠模型上的研究结果也表明,甲状腺功能紊乱会引起初情期延期、发情周期不规则以及卵巢卵泡闭锁增加[13-14]。

卵巢作为重要的雌性生殖器官具有外分泌(产生卵子)和内分泌(类固醇激素合成和分泌)功能。胆固醇在类固醇激素急性调节蛋白(StAR)的作用下从细胞内的线粒体外膜转移到线粒体内膜,然后细胞内的胆固醇由胆固醇侧链裂解酶(P450scc)作用形成孕烯醇酮(P5),这是类固醇激素合成过程中的2个重要限速步骤。从P5合成性激素有2个途径,即Δ4[P5→P4→雄烯二酮(A4)]和Δ5[脱氢表雄酮(DHEA)→P5→A4],它们均经3β-HSD和细胞色素P450芳香化酶(CYP17)催化完成。随后A4转化为睾酮,睾酮在17β-HSD和CYP17催化作用下合成E2。雌激素通过自分泌方式刺激颗粒细胞增殖,促进颗粒细胞层的生长和卵泡腔的扩大。在某种意义上,这些过程决定了卵泡的命运,在卵泡发育和闭锁中发挥关键作用。因此认为任何干扰类固醇激素合成的因素都可能对颗粒细胞的发育和功能造成影响,最终破坏卵子发生,导致不孕不育。

基于甲状腺功能对人类临床和实验动物生殖的诸多效应以及母猪卵巢卵泡液中5′-脱碘酶的发现[15],暗示着甲状腺功能与母猪繁殖性能之间可能存在极大关联性。本试验通过添加FSH促进体外猪卵巢颗粒细胞发育,同时用不同浓度的甲状腺素处理,观察甲状腺素对颗粒细胞增殖和类固醇激素合成的影响,旨在探讨甲状腺素对猪卵巢卵泡颗粒细胞发育和功能的调节作用,为揭示甲状腺素对卵巢功能的调控作用提供试验依据。

1　材料与方法

1.1　试验材料及主要试剂

选用南京本地屠宰场母猪的健康卵巢作为试验材料。猪卵巢从南京市某本地屠宰场获取,装入含有青霉素和链霉素的37 ℃生理盐水保温瓶中,4 h内运送回实验室。细胞培养液DMEM/F-12、PBS以及双抗购自Life Technologies公司;胎牛血清购自Gibco公司(美国);L-甲状腺素(T4)购自Sigma公司;SABC试剂盒购自武汉博士德公司;细胞增殖试剂盒、免疫荧光试剂盒、HRP标记的羊抗兔IgG、HRP标记的驴抗羊IgG购自碧云天生物有限公司;ECL试剂盒购于Thermo Scientific 公司;雌二醇和孕酮放射免疫(RIA)检测试剂盒购自中国北方生物研究所。其他试剂均为国产分析纯。

该方式应用的条件为，在实际设计方案与通用造价在主变容量、配电装置行式等方面不一致时，可应用相似的基础方案，经由基础模块的更换对基础方案做出改进。结合基础方案造价与基础模块的整合形成与实际方案相似的工程概算，并对实际工程造价的可行性做出综合分析[3]。

1.2　试验方法

1.2.1　免疫组织化学染色　为验证TRɑ/β在猪卵巢的表达定位,我们采用ABC法进行免疫组织化学定位。卵巢样品室温固定12 h,经一系列浓度梯度的乙醇和二甲苯分别进行脱水和透化处理,石蜡包埋,切5 μm厚度的组织切片,置于经3-氨丙基三乙氧基硅烷(APES)处理之后的玻片上,然后37 ℃烘片机烘干24 h。制作好的石蜡切片再经系列浓度梯度的二甲苯和乙醇分别进行脱蜡和水化处理,流水冲洗后,浸在预热的柠檬酸钠中继续煮沸修复抗原,冷却后流水冲洗5 min。接着,用含甲醇和30% H2O2的PBS溶液裂解细胞并灭活内源性过氧化氢酶。洗净后,用5%(体积分数)的小牛血清白蛋白(BSA)封闭1 h,TRα/β 抗体(兔源,1∶200稀释)4 ℃孵育过夜。取出后PBS洗3次,每次5 min,加入生物素标记的抗兔 IgG 抗体(1∶200稀释)室温孵育2 h,再洗净与ABC试剂反应1 h,3,3-二氨基联苯胺(DAB)显色2 min,在显微镜下掌握染色深浅程度,流水冲洗5 min,苏木素复染、脱水透明、封片。PBS 取代一抗作为空白对照。YS100光学显微镜观察并拍照,分析,切片中棕褐色代表阳性表达。

1.2.2　细胞培养和处理　用37 ℃生理盐水清洗卵巢,10 mL注射器抽取卵巢表面不同直径卵泡的卵泡液,静置15 min,1 500 r·min-1离心2 min,PBS洗2次,使用血细胞计数板进行细胞计数。最后,将颗粒细胞悬浮于含10%(体积分数)胎牛血清、20 ng·mL-1 FSH、100 mg·L-1链霉素和100 IU·mL-1青霉素的基本培养基中,于5% CO2和37 ℃的培养箱中培养24 h,之后换为含不同浓度甲状腺素的无血清培养基再次培养24 h。收集培养液用来测定激素水平,收集细胞样品经免疫印迹测定激素合成酶的变化。其中甲状腺素固体溶解采用氢氧化钾-聚乙二醇溶剂[0.04 mol·L-1 KOH与0.4%(体积分数)聚乙二醇溶液]溶解法[16],并稀释至试验所需浓度(10-8、10-7和10-6 mol·L-1),分别称取0.056 g KOH和5 mg T4于25 mL培养基中,并添加100 μL聚乙二醇,其中氢氧化钾-聚乙二醇溶剂体积不超过培养基总量的5%。

甲状腺素主要通过血液运输到卵巢内,甲状腺素(T4)主要以T3形式发挥作用,为衡量T4在卵巢卵泡内的转化能力,我们检测了不同浓度T4处理后细胞培养液中的T3水平,结果显示T4处理组细胞培养液中出现T3,其中低、中剂量的T4转化效率几乎一致,并且T3水平随着T4剂量的增加呈现剂量依赖性递增。先前有研究者发现母猪卵巢卵泡液中存在脱碘酶[15],我们推测颗粒细胞内可能存在脱碘酶的表达,且体外培养的颗粒细胞具有将T4转化成T3的能力。T3作为甲状腺素发挥生物功能的主要活性形式,通过影响类固醇激素水平进而调节颗粒细胞的内分泌功能。激素测定结果显示:一方面,T4显著降低E2水平,且随T4浓度升高,E2呈现先下降后上升的趋势,这些结果表明甲状腺素负调控E2的合成和分泌,但也不能排除T4抑制颗粒细胞外膜芳香化酶表达的可能。此结果与Chan等[23]研究结果相似:颗粒细胞经FSH和T4作用,E2的水平呈现剂量依赖性降低。另一方面,孕酮水平随甲状腺素浓度升高表现出逐渐下降的趋势,而Maruo等[24]研究发现在FSH和T4的作用下孕酮水平显著增加,这与本试验结果不同。我们推测这种差异性可能是颗粒细胞所处状态不同导致的。此外,孕酮水平的降低很可能与 3β-HSD 活性降低相关。先前有研究报道,颗粒细胞发育和成熟过程中P450芳香化酶(CYP19)水平下降会引起雌激素水平下降[25]。芳香化酶是雄激素转化为雌激素的限速酶,在多种调控因素下编码芳香化酶,从而调控雌激素的合成作用。蛋白免疫印迹结果显示:低浓度的甲状腺素处理不影响3β-HSD基因的表达,但随甲状腺素浓度增加3β-HSD基因的表达显著下降,而且检测到该处理引起CYP19蛋白表达随甲状腺素浓度升高出现先降低后增加的趋势,这与对应的激素水平变化趋势一致。由此可以证实甲状腺素能够通过影响激素合成酶的表达,改变类固醇激素的合成与分泌,从而调控卵巢卵泡发育。

1.2.4　Western blot分析　收集细胞样品,用含10 mmol·L-1 PMSF的RIPA细胞裂解液于冰上静置30 min。4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min,吸出上清液,用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,99 ℃变性。变性过的蛋白样品经SDS-PAGE电泳2 h后,采用湿转法将蛋白转移至PVDF膜上,之后50 g·L-1BSA室温封闭1 h。加入TRα/β抗体于4 ℃摇床反应过夜。孵育完后,常温下用TBST洗涤3次,每次 10 min,之后加入HRP标记的IgG(1∶3 000)二抗于37 ℃摇床孵育2 h。最后,TBST洗膜3次后将膜浸入ECL超敏发光液中,于LAS 4000荧光成像仪下拍照,用NIH Image J software进行条带灰度分析。

参考文献References:

1.2.5　细胞活力检测　依据MTT试剂盒说明书检测细胞增殖,96孔板每孔加入100 μL约2 000个猪颗粒细胞,在含FSH、添加或不添加甲状腺素的无血清培养基中于5% CO2、37 ℃培养箱培养24 h,每孔加入10 μL MTT溶液在细胞培养箱内孵育4 h,随后每孔加入100 μL Formanzan溶解液在细胞培养箱内再继续孵育4 h,直至在普通光学显微镜下观察发现Formazan全部溶解。测定光密度值D570。

1.2.6　PCNA抗原免疫荧光染色　用12孔板接种原代猪卵巢颗粒细胞并进行处理,制作细胞爬片。经4%(体积分数)甲醛固定1 h,再用0.2%(体积分数)Triton X-100透化细胞1 h。PBS洗3次,每次10 min,BSA室温封闭2 h,6 h一抗(兔抗PCNA抗体,1∶200稀释)4 ℃孵育过夜。PBS洗3次后加荧光标记的兔二抗(AF488)避光封闭2 h。DAPI染色10 min,PBS清洗3次后封片,于Zeiss激光共聚焦荧光显微镜观察。

风影一直离群索居，几乎不与村民们来往，独来独往的他看上去总是一副心事重重的样子。红琴的面孔倒是逐渐丰润起来，那种知足常乐的样子，乍一看根本看不出她过去有什么伤痛的经历与未来有什么美好的梦想。有时候，他会朝山坡上那个迷蒙的地方看，有时候风和日丽，有时候云雾缭绕，他一看就是大半天。红琴见了就开玩笑，和尚，你的灵魂是不是还丢在那间破庙里，如果你还想出家去当和尚，那就尽管去，这回你要是想受戒，就尽管让那老和尚拿香火烫，我绝不拦你。风影有些恼火，但也没有发作，只在心底里骂了一声鬼女子，便悄无声息地走开了。

1.3　数据分析

用Excel 2007进行原始数据的整理,用GraphPad Prism 5和SPSS 18.0软件对数据处理并进行单因素方差分析(One-way ANOVA)和显著性差异比较,试验数据均表示为平均值±标准差

作为一种高效率和高质量的控制技术，PLC控制技术已经应用在矿山开采每一个阶段，可取代替传统控制技术，通过储存器对矿山开采和生产设备数据进行采集、计算以及控制，并将相关数据实时上传到管理人员的计算机之中，便于进行管理。目前PLC控制技术在实际矿山开采和生产中有两种应用模式，一种是模块式结构模式，另外一种则是固定式结构模式。这两种模式的区别主要在于功能的自定义范围。模块式结构模式能够自定义设置PLC控制技术中的功能，让矿山生产企业根据自身的需要调整PLC控制技术，而另外一种固定式结构模式，则不能够对功能进行调整，但是它操作更加便利，更容易上手，被更多中小型矿山生产企业采用。

2　结果与分析

2.1　TRɑ/β在猪卵巢内表达的定位

免疫组织化学结果显示,TRɑ/β在卵巢原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡和三级卵泡(图1)的健康颗粒细胞以及卵母细胞的胞质中均有表达;但在凋亡颗粒细胞TRɑ/β着色较弱。

  

图1　TRɑ/β蛋白在猪卵巢的免疫定位Fig.1　Immunolocalization of TRɑ/β proteins in pig ovariesa～d.不同发育阶段卵泡;e.闭锁的三级卵泡;f～g.凋亡的颗粒细胞;h.阴性对照。a-d.Follicles of different developmental stages;e.Atresia three grade follicle;f-g.Apoptotic granulosa cells;h.Negative control.

  

图2　经不同浓度甲状腺素(T4)处理后颗粒细胞培养液中T4、三碘甲腺原氨酸(T3)、 雌二醇(E2)和孕酮(P4)水平的变化Fig.2　The change of thyroxine(T4),triiodothyronine(T3),estradiol(E2)and progesterone(P4)levels in granulosa cell culture medium treated with different concentrations of T4不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。Different small letters indicate significant difference at 0.05 level. The same as follows.

2.2　培养液中T4、T3、E2及P4激素水平变化

培养液中T4、T3水平及T3/T4检测结果如图2所示:10-7 mol·L-1甲状腺素处理组的T3、T4浓度明显高于10-8 mol·L-1甲状腺素组,且10-6 mol·L-1甲状腺素组浓度显著高于另外2组(P<0.05)。与对照组相比,不同浓度T4处理组孕酮(P4)水平随T4浓度升高呈逐渐下降的趋势,且与对照组相比均显著下降(P<0.05);雌激素(E2)水平与对照组相比显著下降(P<0.05)。考虑到可能受细胞本身生理状态的影响,单独来看E2和P4并不能作为检测细胞状态的可靠指标。因此,我们进一步比较P4/E2值以确定卵泡发育状态。P4/E2随甲状腺素浓度升高呈现下降趋势,尽管10-8和10-7 mol·L-1甲状腺素组和对照组相比没有显著差异(P>0.05),但在高浓度甲状腺素处理组下,P4/E2值较低,表明细胞状态相对更好。

伊秉绶：阴胜国[29]从清初隶书家审美观念的对比中探讨伊秉绶的审美思想，认为伊秉绥的书学思想有3个要点：①取法雄强宽博、静穆方正风格的汉碑；②用笔的中实简省与结体的方正更易；③追求静穆而不失古拙的气息。总之，伊秉绥在审美观念的指引下，凭借自足的勇气和气魄，锐意进取，将隶书革新到底，成功的塑造了崇尚古朴和趋拙避巧的艺术形象，对后来碑派书法的发展产生了深远的影响。

2.3　不同浓度甲状腺素处理对猪卵巢颗粒细胞类固醇激素合成的影响

经甲状腺素(T4)处理后,随甲状腺素浓度升高,3β-HSD表达显著降低(P<0.05)(图3),CYP19表达量也显著降低(P<0.05),并呈现先下降后上升趋势,这与之前检测到的激素水平变化一致。

  

图3　不同浓度T4处理后猪卵巢颗粒细胞中类固醇合成酶的表达Fig.3　Expression patterns of steroid synthases in porcine granulosa cells treated with different concentrations of T4A. 3β-HSD、CYP19和α-Tubulin的蛋白带表达电泳图;B. 3β-HSD的相对表达量;C. CYP19的相对表达量。A. The protein bands of 3β-HSD,CYP19 and α-Tubulin;B. Relative expression level of 3β-HSD;C. Relative expression level of CYP19 .

  

图4　T4对卵巢颗粒细胞增殖活性的影响Fig.4　Effects of T4 on the cell viabilityof porcine granulosa cells

2.4　甲状腺素对猪原代颗粒细胞增殖活性的影响

[19]　　　Zhang C,Wang X,Wang Z,et al. Effect of different culture systems and 3,5,3′-triiodothyronine/follicle-stimulating hormone on preantral follicle development in mice[J]. PLoS ONE,2013,8(4):e61947.

2.5　甲状腺素对猪卵巢颗粒细胞PCNA表达的影响

增殖细胞核抗原(PCNA)存在于正常增殖细胞中,并在细胞增殖的启动上起重要作用,是反映细胞增殖状态的良好指标。PCNA在颗粒细胞的细胞核中广泛表达(图5),且不同浓度甲状腺素处理对PCNA在颗粒细胞的表达没有显著影响(P>0.05),这与MTT试验结果一致。

  

图5　T4对猪卵巢颗粒细胞增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响Fig.5　Effects of T4 on proliferating cell nuclear antigen(PCNA)expression in porcine granulosa cells

3　讨论

甲状腺素的研究一直是热点,虽然有许多科学家探索甲状腺素在动物繁殖性能中的重要作用,但绝大多数研究集中在实验动物上[17-19]。猪在我国畜牧业中占据重要地位,因此,研究甲状腺机能状态与母猪繁殖机能之间的关系具有一定意义。本试验采用FSH诱导猪卵巢颗粒细胞体外发育模型,用不同浓度的甲状腺素处理,旨在探究甲状腺素对颗粒细胞增殖和类固醇激素分泌的影响。甲状腺素通过与甲状腺素核受体结合发挥作用,已有报道称甲状腺素受体在人[20]、鼠[21]和猪[22]的颗粒细胞中都有表达。由于甲状腺素受体是甲状腺素靶向器官发挥功能的基础,我们采用免疫组化法对发育正常的成年猪卵泡期卵巢进行了甲状腺素受体α/β(TRα/β)定位,结果显示猪卵巢颗粒细胞中确实存在TRα/β受体,与Wakim等[22]的研究结果一致,表明甲状腺素可能通过甲状腺素受体作用于卵泡颗粒细胞,参与猪卵巢发育。

1.2.3　激素测定　猪卵巢颗粒细胞以适当浓度培养于6孔细胞培养板中,分为4组,一组正常培养作为对照,另外3组分别添加10-8、10-7和10-6 mol·L-1的甲状腺素(T4)。细胞培养24 h,收集细胞培养液,送至南京军区总院进行T4、T3水平以及雌二醇(E2)、孕酮(P4)激素水平的测定。测定方法采用酶联免疫法,具体操作步骤严格按照放射免疫分析试剂盒(北京北方生物技术研究所)产品说明书进行。T4(1601-0812)、T3(20160820)、E2(B05PZB)和P4(B08JFB)的灵敏度分别为5 ng·mL-1、0.2 ng·mL-1、小于5 pg·mL-1、小于0.2 ng·mL-1,批内变异系数均小于10%,批间变异系数均小于15%。

[15]　　　Slebodzinski A B. Ovarian iodide uptake and triiodothyronine generation in follicular fluid the enigma of the thyroid ovary interaction[J]. Domestic Animal Endocrinology,2005,29(1):97-103.

[11]　　　Krassas G E. Thyroid disease and female reproduction[J]. Fertil Steril,2000,74(6):1063-1070.

指标体系构建后，通过层次分析法获得一个指标权重，熵值法获得一个指标权重，然后通过组合赋权法获得最终的指标权重。

[1]　Cheng S Y,Leonard J L,Davis P J. Molecular aspects of thyroid hormone actions[J]. Endocr Rev,2010,31(2):139-170.

高等动物细胞核直径一般为5～10 μm，高等植物细胞核直径一般为5～20 μm。教师利用超轻黏土、废弃胶头滴管胶帽和细铁丝等材料，分别模拟核模、核孔复合体和核酸，制作放大约4万倍的细胞核模型（即直径约20 cm），如图1所示。

皮海洲（独立财经撰稿人）：股市要对上市公司保壳游戏说“不”，关键在于要对相关制度加以完善。比如，对上市公司保壳的考核，如果净利润或扣非利润出现连续三年亏损的，这样的上市公司都应该纳入到暂停上市之列。由于扣非利润主要来自于公司的主要营业收入部分，更能反映公司的实际经营状况，因此，在考核上市公司是否需要退市(包括暂停上市)时，将扣非利润纳入到考核中来，是更有实际意义的。

[2]　　　Pascual A. Thyroid hormone receptors,cell growth and differentiation[J]. Biochimica et Biophysica Acta,2013,1830(7):3908-3916.

[3]　　　Yen P M. Physiological and molecular basis of thyroid hormone action[J]. Physiol Rev,2001,81(3):1097-1142.

[4]　　　Sengupta P. Environmental and occupational exposure of metals and their role in male reproductive functions[J]. Drug and Chemical Toxicology,2013,36(3):353-368.

[5]　　　Krassas G E,Poppe K,Glinoer D. Thyroid function and human reproductive health[J]. Endocrine Reviews,2010,31(5):702-755.

[6]　　　Vissenberg R,Manders V D,Mastenbroek S,et al. Pathophysiological aspects of thyroid hormone disorders/thyroid peroxidase autoantibodies and reproduction[J]. Hum Reprod Update,2015,21(3):378-387.

[7]　　　Tulchinsky D,Chopra I J. Competitive ligand-binding assay for measurement of sex hormone-binding globulin(SHBG)[J]. J Clin Endocrinol Metab,1973,37(6):873-881.

[8]　　　Longcope C,Abend S,Braverman L E,et al. Androstenedione and estrone dynamics in hypothyroid women[J]. J Clin Endocrinol Metab,1990,70(4):903-907.

[9]　　　Mattheij J A,Swarts J J,Lokerse P,et al. Effect of hypothyroidism on the pituitary-gonadal axis in the adult female rat[J]. Journal of Endocrinology,1995,146(1):87-94.

[10]　　　Tohei A,Imai A,Watanabe G,et al. Influence of thiouracil-induced hypothyroidism on adrenal and gonadal functions in adult female rats[J]. J Vet Med Sci,1998,60(4):439-446.

综上所述,本试验结果显示:甲状腺素可能通过抑制类固醇激素合成相关酶(如3β-HSD、CYP19)干扰猪卵巢颗粒细胞孕酮和雌激素的合成和分泌效应,但对细胞增殖状态没有显著影响。本试验结果为甲状腺素调控卵巢功能机制研究提供重要参考。

[12]　　　Cecconi S,Rucci N,Scaldaferri M L,et al. Thyroid hormone effects on mouse oocyte maturation and granulosa cell aromatase activity[J]. Endocrinology,1999,140(4):1783-1788.

只收不发，信冷淡。只发不收，信搔扰。传不出去，信功能障碍。看微信大笑者，基本已达到信高潮。一会儿用微信一会儿又删除的，信功能痉挛。用微信交友的，信交。用微信谈工作的，信工作者。每天微信频发的，信生活过度。

[13]　　　Fedail J S,Zheng K,Wei Q,et al. Roles of thyroid hormones in follicular development in the ovary of neonatal and immature rats[J]. Endocrine,2014,46(3):594-604.

[14]　　　Zheng K,Sulieman F J,Li J,et al. Nitric oxide and thyroid hormone receptor alpha 1 contribute to ovarian follicular development in immature hyper- and hypo-thyroid rats[J]. Reproductive Biology,2015,15(1):27-33.

卵巢功能得以维持和发挥,其中颗粒细胞的增殖和成熟是关键一环[26]。颗粒细胞是卵巢中雌激素、孕酮等类固醇激素合成和分泌的主要体细胞之一,它的发育状态与卵泡的生长发育等生理过程有着密切关系。MTT细胞活力检测结果显示,不同浓度甲状腺素处理对颗粒细胞活力没有显著影响。荧光强度统计结果显示,不同浓度甲状腺素处理对颗粒细胞增殖没有显著影响,这与前人的研究结果一致[27]。由此推测甲状腺素可能在卵泡发育过程中发挥维持效应,从而提高细胞的整体代谢能力,使其存活更久。颗粒细胞凋亡是引起卵泡闭锁的主要原因[28],因此,研究甲状腺素对颗粒细胞功能及增殖的影响具有重要意义。

你出去这一个月，瘦得皮包骨头，猴似的，头发长了也没理，灰头土脸，纯屌丝一个。还这屌梦，那屌梦的，先回来捣鼓学业吧，书中自有黄金屋哩。

[16]　　　Lin H Y,Sun M,Tang H Y,et al. L-thyroxine vs. 3,5,3′-triiodo-L-thyronine and cell proliferation:activation of mitogen-activated protein kinase and phosphatidylinositol 3-kinase[J]. Am J Physiol Cell Physiol,2009,296(5):C980-C991.

[17]　　　Hatsuta M,Abe K,Tamura K,et al. Effects of hypothyroidism on the estrous cycle and reproductive hormones in mature female rat[J]. Eur J Pharmacol,2004,486(3):343-348.

[18]　　　Kobayashi N,Orisaka M,Cao M,et al. Growth differentiation factor-9 mediates follicle-stimulating hormone-thyroid hormone interaction in the regulation of rat preantral follicular development[J]. Endocrinology,2009,150(12):5566-5574.

为研究甲状腺素对猪卵巢颗粒细胞增殖活性的影响,通过MTT细胞增殖试剂盒检测细胞增殖情况。结果(图4)显示:与对照组相比,不同浓度甲状腺素处理对细胞增殖活性无明显影响(P>0.05)。

设计基于多维疲劳量表(MFI-20)的问卷，并分发给在船船员，取得了有效问卷370份，将其数据用于分析海员疲劳。将MFI-20和NASA-TLX(NASA任务负载)运用于海员疲劳研究中，数据分析结果表明：船员的MFI-20五维平均疲劳度均大于常用阈值，任务平均值负担和主观感觉也较普通人的数值大。为深入探究海员疲劳，进行探索性因子分析(Exploratory Factor Analysis, EFA)。基于EFA，通过使用AMOS软件程序建立结构方程模型(Structural Equation Modeling, SEM)，确定了MFI/TLX与其影响因素之间的6个意义因果关系路径。

[20]　　　Wakim A N,Polizotto S L,Buffo M J,et al. Thyroid hormones in human follicular fluid and thyroid hormone receptors in human granulosa cells[J]. Fertil Steril,1993,59(6):1187-1190.

[21]　　　Gerdes J,Schwab U,Lemke H,et al. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human nuclear antigen associated with cell proliferation[J]. Int J Cancer,1983,31(1):13-20.

目前，提高制动器压盘锥窝耐磨性能的主要方法为表面感应淬火，主要存在以下问题：感应器仿形性差、淬火工艺难控制。由于制动器压盘锥窝形状小而不规则，给感应器的制作带来很大困难，目前的感应器多为“一字形”，窝头一侧涂覆上导磁粉，这种感应器仿形性差，加热效率低，从而导致表面硬度不足、淬硬层分布不均匀，若加热时间过长则容易过烧甚至烧熔。

[22]　　　Wakim N G,Ramani N,Rao C V. Triiodothyronine receptors in porcine granulosa cells[J]. Am J Obstet Gynecol,1987,156(1):237-240.

[23]　　　Chan W K,Tan C H. Inhibition of follicle-stimulating hormone induction of aromatase activity in porcine granulosa cells by thyroxine and triiodothyronine[J]. Endocrinolog,1986,119(2):2353-2359.

[24]　　　Maruo T,Hayashi M,Matsuo H,et al. The role of thyroid hormone as a biological amplifier of the actions of follicle-stimulating hormone in the functional differentiation of cultured porcine granulosa cells[J]. Endocrinology,1987,121(4):1233-1241.

[25]　　　Kato M,Shimada K,Saito N,et al. Expression of P450 17-hydroxylase and P450 aromatase genes in isolated granulosa,theca interna and externa layers of chicken ovarian follicles during follicular growth[J]. Biol Reprod,1995,52(2):405-410.

富集二氧化碳调节植物生长机理的研究进展……………………………… 袁 文，任嘉琪，邵姗姗，赵 轩，高利强，祁 智（42）

[26]　　　Guthrie H D,Cooper B S,Welch G R,et al. Atresia in follicle grown after ovulation in the pig:measurement of increased apoptosis in granulosa cells and reduced follicular fluid estradiol-17beta[J]. Biol Reprod,1995,52(4):920-927.

[27]　　　Asahara S,Sato A,Ali A A. Thyroid hormone synergizes with follicle stimulating hormone to inhibit apoptosis in porcine granulosa cells selectively from small follicles[J]. Kobe J Med Sci,2003,49(5):107-116.

选取2017年我院收治的人格障碍患者80例作为研究对象。（1）纳入标准：住院患者；经过二级及以上医院诊断，确诊为人格障碍；需要服用一种或者多种治疗药物，其服用时间达到了1年及以上。（2）排除标准：存在认知、精神以及意识障碍，无法正常对个人意愿进行表达；无法生活自理，或者无法自行服用药物；病历资料不全，无法判断。其中，女48例，男32例，平均年龄（35.68±4.21）岁，障碍类型：偏执型25例，冲动型17例，反社会型15例，表演型10例，分裂型7例，强迫型6例。根据接受不同的护理方法将其均分为对照组和观察组，对比组间一般资料，差异无统计学意义（P＞0.05）。

[28]　　　李烈川,申明,宁彩波,等. 过氧化氢诱导猪卵巢颗粒细胞自噬及其对凋亡的影响[J]. 南京农业大学学报,2016,39(5):814-818. DOI:10.7685/jnau.201601001.

Li L C,Shen M,Ning C B,et al. Induction of granulosa cell autophagy and effects in apoptosis by hydrogen peroxide in porcine ovaries[J]. Journal of Nanjing Agricultural University,2016,39(5):814-818(in Chinese with English abstract).