H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白的分子特征分析

流感病毒属于正黏病毒科，其遗传物质为分节段单负链RNA构成的基因组，流感病毒分甲乙丙三型，根据病毒膜蛋白血凝素(hemagglutinin， HA)和神经氨酸酶(neuraminidase，NA)抗原性的不同，甲型流感病毒HA可以分为16个亚型，NA分为9个亚型。H5N1甲型流感病毒为高致病的禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV)[1]。自1997年，中国和世界各地不断有人感染H5N1甲型流感病毒的散发病例及致死病例报道，引起了国际社会的高度关注[2-4]。

外膜蛋白H5血凝素是AIV感染吸附宿主细胞和诱导保护性免疫反应的重要蛋白[5],本研究拟采用国际上通用的生物信息学软件对分离于2002—2013年间不同宿主H5N1甲型流感病毒的H5血凝素蛋白进行生物信息学分析，为进一步研究HPAIV的致病机制及治疗策略提供生物信息学数据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 H5N1甲型流感病毒H5血凝素基因序列

从Gene Bank中获取15株分离于不同年份不同地点的H5N1甲型流感病毒 H5血凝素基因序列，将15株H5血凝素序列基因号分别编号为:H5-A(AY676033)、H5-B(EU635874)、H5-C(GU182158)、H5-D(GU477548)、H5-E(GU477549)、H5-F(HM172453)、H5-G(HQ677023)、H5-H(JN646713)、H5-I(JN646714)、H5-J(JQ638673)、H5-K(JQ966928)、H5-L(KF638579)、H5-M(KP288324)、H5-N(KP735814)、H5-O(KP762501)。

1.1.2 核酸与蛋白分析所用软件

2.4.4 受体结合位点

2.4.1 A1和A2裂解序列分析

1.2 方法

1.2.1 H5N1甲型流感病毒H5血凝素基因和蛋白质序列的获取

从 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)GeneBank 中获取于2002—2013年从中国不同地点及不同禽类宿主中分离的H5N1甲型流感病毒H5血凝素基因序列，用软件Bioedit 将核苷酸序列翻译成氨基酸序列。

1.2.2 H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白基因序列的同源性比较

我在Lightroom的基本面板中打开配置文件浏览器，浏览不同配置文件选择给画面色彩带来的影响。虽然Adobe默认的色彩配置文件效果非常理想，但对于富士相机的RAW文件来说，我还是更喜欢Camera Matching下面的Velvia配置文件，更接近于过去维尔维亚反转片的味道。使用快捷键R选择裁切工具，接着使用快捷键A锁定裁切比例，从下往上拖动创建裁切框，使得下方山脚恰好位于画面的三等分点。

不同甲型流感病毒毒株的H5血凝素蛋白的基因核苷酸和氨基酸序列的同源性比较采用Clustal X和Bioedit软件进行，并计算不同的H5血凝素蛋白氨基酸序列和其基因核苷酸序列的同源率。

1.2.3 H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白的信号肽分析

信号肽预测结果显示，H5血凝素蛋白前70个氨基酸中含有潜在信号肽(图1)，潜在的切割位点位于S16和D17二个氨基酸之间，表明H5血凝素前体蛋白中aa1-aa16区域可能为信号肽，引导血凝素蛋白从宿主细胞分泌并被切割。

通过改进的转移概率、信息素浓度更新方法和启发函数等关键影响指标，得到修正后的蚁群算法模型，并按上述步骤进行后节的算法实验。

1.2.4 H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白氨基酸序列的比对

以Fasta格式将导入Clustal X软件中的H5N1甲型流感病毒毒株的H5血凝素蛋白氨基酸序列进行多重比对，以分析重要功能域中的关键位点变异情况。

平推平行移动式卡线器的拉环可打开夹嘴，导线从侧面放入，拉紧拉环后上、下夹嘴可夹持导线。简化的平行移动式卡线器机构如图2所示。由图2可以看出，卡线器实质为一个四连杆机构。拉环受到横向拉力F0，该拉力通过四连杆机构传递并转化为夹嘴对导线施加的正压力FN。四连杆机构起到放大力的作用。

H5血凝素蛋白重要功能域A1亚单位存在4个高变区，分别是aa115-aa140，变异率达52.0%,aa151-aa170区变异率达57.9%,aa183-aa200区变异率为64.7%，aa263-aa280区变异率为47.4%。

作为有着丰富经验的一名女赛车手，劳拉·克莱哈默（Laura Kraihamer）为本次选题带来了女性特有的直觉和赛车手的敏感。

不同H5血凝素蛋白的二级结构的预测及差异分析比较采用在线软件Antheprot。

2 结果

2.1 H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白的氨基酸和核苷酸序列基本信息

H5血凝素蛋白A1和A2裂解序列位于aa323-aa333之间的RERRRKKR↓GLF，裂解位点位于R330和K331之间。15株不同甲型流感病毒的H5血凝素蛋白A1和A2裂解位点序列中，有两株出现R325G突变，有5株的出现K328R突变,有7株K329位点发生缺失。

 

表1 不同来源的H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白的基本信息

  

编号基因型序号分离血清型宿主分离时间分离地点多肽长度/个ORF长度/bpH5-AH5-AY676033H5N1duck2002年HongKong5681707H5-BH5-EU635874H5N1chicken2005年Yunnan5671704H5-CH5-GU182158H5N1chicken2008年Hunan5671704H5-DH5-GU477548H5N1brown-headedgull2009年Qinghai5671704H5-EH5-GU477549H5N1brown-headedgull2010年Qinghai5671704H5-FH5-HM172453H5N1chicken2005年Liaoning5681707H5-GH5-HQ677023H5N1chicken2008年Huadong5681707H5-HH5-JN646713H5N1duck2011年Zhejiang5681707H5-IH5-JN646714H5N1duck2011年Zhejiang5681707H5-JH5-JQ638673H5N1chicken2010年Jiangsu5681707H5-KH5-JQ966928H5N1condor2003年Guangdong5681707H5-LH5-KF638579H5N1chicken2012年Ningxia5671704H5-MH5-KP288324H5N1duck2013年Nanchang5681707H5-NH5-KP735814H5N1chicken2011年Dongtai5671704H5-OH5-KP762501H5N1chicken2013年Jiangsu5671704

2.2 H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白的信号肽预测分析

H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白一级结构序列中可能存在的信号肽剪切位点及潜在的信号肽序列采用在线软件SignalP4.1分析预测。

  

图1 H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白信号肽预测分析图

2.3 不同的H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白基因和氨基酸序列同源性比较

不同来源的H5血凝蛋白氨基酸和基因核苷酸序列的同源性比较见表2，结果显示：2002—2013年间流行的不同H5N1甲型流感病毒H5血凝蛋白氨基酸同源性为86.7%～99.2%，核苷酸同源性为85.6%～99.5%，存在一定程度的异质性。

2.4 不同H5N1甲型流感病毒H5血凝蛋白氨基酸序列比对分析

不同的H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白氨基酸序列比对结果见图2。

 

表2 H5N1甲型流感病毒H5血凝蛋白核苷酸和氨基酸同源性比较 氨基酸同源性

  

编号H5-AH5-BH5-CH5-DH5-EH5-FH5-GH5-HH5-IH5-JH5-KH5-LH5-MH5-NH5-0H5-A0.9630.9520.9430.9360.9660.9110.9340.9380.9340.9920.8890.9270.9290.929H5-B0.9670.9610.9550.9480.9540.9080.9450.9400.9470.9630.8890.9330.9430.941H5-C0.9560.9640.9770.9710.9410.8940.9550.9570.9680.9520.8760.9430.9220.962H5-D0.9490.9600.9790.9890.9360.8900.9500.9520.9870.9430.8730.9380.9220.982H5-E0.9460.9570.9750.9940.9290.8870.9430.9450.9910.9360.8690.9310.9150.985H5-F0.9670.9600.9440.9390.9360.9030.9200.9220.9270.9640.8820.9170.9240.924H5-G0.9300.9230.9100.9050.9050.9190.8960.8960.8850.9080.9590.8870.8900.885H5-H0.9390.9470.9620.9570.9540.9280.9020.9870.9410.9310.8800.9770.9150.945H5-I0.9390.9450.9630.9570.9540.9270.9020.9850.9430.9340.8800.9750.9110.943H5-J0.9420.9490.9700.9840.9840.9320.8980.9510.9520.9340.8670.9290.9170.984H5-K0.9950.9680.8560.9490.9460.9670.9290.9370.9370.9420.8850.9240.9290.929H5-L0.9110.9050.8950.8890.8890.9010.9580.8880.8890.8840.9100.8710.8780.867H5-M0.9310.9370.9530.9470.9440.9230.8950.9790.9750.9410.9300.8820.9080.936H5-N0.9460.9430.9300.9260.9230.9360.9030.9220.9190.9260.9450.8930.9150.915H5-O0.9280.9360.9510.9670.9660.9190.8890.9370.9360.9690.9280.8750.9320.914

核苷酸同源性

 

  

图2 H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白的氨基酸序列比对

 

 

 

  

图2(续)

还有这样的现象，家长描述生长痛在孩子增加身体活动、锻炼以后会更加明显。因此有观点认为这跟疲劳和大量运动后代谢产物在肌肉系统中的堆积有关，推论生长痛与过度活动密切相关。但针对儿童的这项研究尚无结论，更没有生长痛与过度运动相关的确切证据。也就是说，生长痛与运动有没有关系呢？没准儿。

全面落实“国家对重点水污染物排放实施总量控制制度”，以“入河污染物总量”为关键绩效指标（KPI），鼓励地方综合施策、系统治理“面源”与“点源”污染，为各级“河长”履行职责创造公平竞争环境，避免“敷衍、表面、假装整改”现象发生。大力推进信息化建设，打造广泛参与、信息共享、协同管理、监督有力的公共平台，保障一江清水长远流淌，促进流域社会经济绿色可持续发展。

不同H5N1甲型流感病毒毒株的H5血凝素蛋白基本信息见表1，其中，8株H5血凝素蛋白开放读码框架(open reading frame,ORF)长度为1707 bp,编码568个氨基酸组成的血凝素多肽， 7株H5血凝素蛋白编码基因开放读码框架长度为1704 bp，编码567个氨基酸组成的血凝素多肽。

2.4.2 A1亚单位的变异分析

1.1.2 仪器设备 6CST-40型滚筒杀青机、6CH-1型烘干机和6CR-30型名优茶揉捻机，均产自浙江衢州高山茶机厂；TAINA 350远红外测温计(-20～500℃)，上海精密仪器厂生产；700 mm篾质簸箕、手工套筛(自制)；干湿度计和茶叶专用审评茶具等。

1.2.5 H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白的二级结构预测分析

2.4.3 二硫键形成位点分析

在H5血凝素蛋白Al亚单位氨基酸序列中，第4、42、55、67、90、135、278、467、474、478位的10个半胱氨酸位点均未见变异，其他位点也没有发现新的半胱氨酸产生，有助于分子内部形成稳定的二硫键,构建出稳定的三维结构。

Clustal X 软件是由欧洲生物信息研究所(European Bioinformatics Institute,Cambridge,UK)研发。Bioedit 分析软件由美国宝蓝软件公司(Borland Software Corporation)开发。在线软件SignalP4.1( http://www.cbs.dtu.dk/ services /SignalP/ )和在线软件TMHMM v2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)由丹麦技术大学生物序列分析中心研发。Antheprot 5.0软件由法国蛋白质生物与化学研究院(Institute of Biology and Chemistry of Proteins)研究开发。

在所比对分析的15株H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白中，受体结合相关位点分布于H5 A1中E186，K212，S217-K218,G221-Q222-S223-G224等区域[6]，非常保守。仅在HA-F序列出现L129S突变，HA-L序列L129发生缺失，HA-M序列发生S223R突变。

2.4.5 免疫表位位点

H5N1甲型流感病毒H5血凝素蛋白有3条Th和B细胞表位,分别为HA141-155、HA206-223、HA302-316[7]。三条表位都处于H5NI甲型流感病毒HA1蛋白氨基酸序列上相对保守的区域内，在HA206-223表位区，有9个样本出现了单个点突变，其他2个表位只有单个标本出现单个点突变。

实现社会公平，就要解决好“三农”问题。历史原因形成的二元社会中，城市发展速度快，城市居民的生活越来越殷实，而农村、农业发展相对滞后。河北省城乡发展不平衡、农村发展不充分，是新时代社会矛盾的突出表现。促进城乡融合发展，是河北省发展的着力点，也是推进全面小康社会实现的重要内容。恩格斯认为，城乡融合是应当建立在一定的物质条件基础上。在我国社会经济发展已取得了巨大成就的背景下，推动城乡融合发展迎来了新的契机[1]。

2.5 H5N1甲型流感病毒H5血凝蛋白的二级结构分析

H5血凝蛋白的二级结构进行预测结果显示，不同H5N1流感病毒H5血凝素蛋白发生二级结构的区域相近(图3)，不同的H5血凝蛋白的氨基酸残基均富含潜在α螺旋(29%～35%)、β折叠(22%～25%)和卷曲结构(22%～25%)(表3)。各种二级结构在不同株间的发生概率略有差异。

  

图3 H5N1甲型流感病毒H5血凝蛋白二级结构预测分析图

 

表3 不同株H5N1甲型流感病毒H5血凝蛋白 氨基酸残基潜在结构所占比例 %

  

基因序列号α螺旋β折叠卷曲结构基因序列号α螺旋β折叠卷曲结构AY676033332423JN646714342423EU635874322423JQ638673332424GU182158312425JQ966928322324GU477548332424KF638579332524GU477549332424KP288324312424HM172453292524KP735814342224HQ677023352222KP762501332424JN646713322524

3 讨论

流感病毒表面刺突蛋白血凝素(HA)是决定病毒毒力、侵袭力及感染宿主范围的关键分子。本文选取的15条 H5血凝素蛋白基因开放读码框架(open reading frame,ORF)长度存在一个氨基酸的差异。8株H5血凝素蛋白 ORF长度为1707 bp,编码568个氨基酸多肽，7株H5血凝素蛋白ORF长为1704 bp，编码567个氨基酸多肽。不同H5N1甲型流感病毒H5血凝蛋白存在一定程度的异质性，其氨基酸同源性为86.7%～99.2%，核苷酸同源性为85.6%～99.5%。H5血凝素蛋白与基因的一级结构的异质性可能改变H5N1甲型流感病毒的生物学性质及致病性质。有研究[8]发现1918年大流行的H1N1流感病毒血凝素受体识别区的2个氨基酸变异，改变了其对靶细胞受体结合的特异性及致病性。

甲型流感病毒血凝素分子 A1和A2二个亚单位的切割序列特征与毒力密切相关。高致病性甲型禽流感病毒与低致病性甲型禽流感病毒的A1和A2切割核序存在明显差异，低致病性甲型禽流感病毒的HA裂解核序仅含一个碱性氨基酸(精氨酸)，该序列仅由呼吸道上皮细胞内的精氨酸特异的蛋白酶识别切割，说明低致病性流感病毒只在呼吸道局部繁殖，引起轻微症状甚至是无症状感染。而高致病性甲型禽流感病毒的HA所含的A1和A2裂解核序均具有6个连续碱性氨基酸(R/K)序列，这一序列可被机体多数组织细胞内的蛋白裂解酶识别并切割，决定了高致病性甲型禽流感病毒广泛的嗜细胞性，病毒侵入宿主后，极易复制导致全身全身扩散。 在本研究分析的15个H5血凝素序列中，A1和A2裂解核序存在8种不同排列方式，多数含有6个连续碱性氨基酸(K/R),为高致病性禽流感病毒特异的H5血凝素蛋白分子结构特征[9-10]。仅有2株出现R325G 突变，有7株K329位点发生缺失，均缺失一个碱性氨基酸。这些单一位点的变异对与病毒毒力的影响有待进一步研究。

其中“低于基本生活水平”和“穷尽其他帮助”两项要件源于对法律规范的解释，并通过政策文件的细化填充了丰富的内容，“值得救助”源于中央与地方政策文件的内容。可见，与公法上其他权利多以法律规范为根基，辅之以适当的政策解释不同，社会救助权从要件解释到要件构造都明显地依赖于政策的作用，而此时的法律规范更像是一幅未完成的画作，填充颜色或是补充空白均需政策予以完成。就此意义上，我国当下的社会救助权具有强烈的政策意味，“法味”不足，呈现出以下特点：

氢气作为保护气氛在钨、钼加热炉中使用，从生产成本，产品质量各方面都有重要的影响。我公司开发的钼板加热电阻炉，结合近年来多台设备的实际生产使用情况，相比传统的生产线上的加热炉，生产效率高，电能消耗低，炉体密封性好，加热元件使用寿命延长，设备运行安全可靠，维护成本显著降低，取得了良好的成效。

H5血凝素蛋白中形成分子间二硫键的10个半胱氨酸位点高度保守，也未见新的半胱氨酸位点出现，有利于H5血凝素蛋白形成稳定保守的二级结构。15株病毒的H5血凝素蛋白均有丰富的分子内二级结构，发生α螺旋(29%～35%)、β折叠(22%～25%)和卷曲结构(22%～25%)的概率有细微差别，说明分子局部空间构象存在差异。H5血凝素蛋白内部丰富略显差异的二级结构决定血凝素分子的生物学功能多样性，如识别靶细胞受体[6,11]，形成具有不同构象的T和B细胞抗原表位 [7,12]。

流感病毒的侵入与感染过程中，病毒表面的血凝素蛋白识别结合宿主细胞表面的靶受体起始感染的第一步[6]。 禽流感病毒受体为α-2,3糖苷键连接的唾液酸分子，而人流感病毒的受体为α-2,6糖苷键连接的唾液酸分子[6,11]。所分析的H5血凝素蛋白序列中，尽管A1亚单位含有4个高变区，但A1受体结合相关位点E186，K212，S217-K218-L129,G221-Q222-S223-G224非常保守，显示出对禽类呼吸道黏膜表面α-2,3糖苷键连接的唾液酸分子受体高亲和力的分子特征[11]。有研究[13]发现E186D,Q222L,S223,G224S位点变异可以导致H5N1 AIV 结合α-2,6糖苷键连接的唾液酸分子受体，从而对人感染。本文分析的H5序列，仅有三株在受体识别区发生突变，分别为HA-F 序列的L129S突变，HA-L序列的L129缺失和HA-M序列的S223R突变，这些位点变异对病毒的感染侵袭力的影响未见报道，有待进一步研究。

H5血凝素蛋白是诱导保护性免疫的关键分子。本研究发现H5血凝素蛋白 Th和B细胞表位序列高度保守，尤其是B细胞表位HA206-223与受体识别位点G221-Q222-S223-G224重叠，说明H5血凝素蛋白尽管存在一定的异质性，但其稳定的免疫表位所诱导的免疫反应具有一定保护作用，可以阻断H5N1流感病毒与受体的结合[14]。

本文采用生物信息学方法[7]对H5N1流感病毒H5血凝素蛋白中重要功能域序列的变异进行了分析，为进一步开展大标本数据的分析奠定了基础。以及进一步分析其免疫学性质和致病性，预防禽流感病毒的感染流行有重要指导意义。

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(责任编辑：况荣华)