二代测序技术检测伴神经内分泌分化乳腺癌的基因突变

伴神经内分泌分化乳腺癌(breast carcinomas with neuroendocrine differentiation, BCND)收录于WHO(2003)乳腺肿瘤分类中[1]，然而其是否可以作为独立的组织学亚型以及神经内分泌分化对乳腺癌的预后意义尚存争议[1-3]。有研究显示神经内分泌分化对浸润性乳腺癌预后缺乏实质性影响[4]，甚至提示预后良好[5-6]。根据WHO(2003)乳腺肿瘤分类标准纳入病例的多项近期研究显示BCND具有侵袭性的生物学行为和临床过程[7-13]。与非特殊型浸润性癌比较，BCND更易局部复发和(或)远处转移[7-8,11-12]，总体生存更差[7-10,13]，对浸润性乳腺癌传统的治疗方案反应不佳[7]。研究结果提示神经内分泌分化对浸润乳腺癌具有预后意义，对其进行独立分组具有临床价值，有必要探索BCND的治疗策略和手段。独特的神经内分泌免疫表型和侵袭性生物学行为，促使研究者关注BCND的分子遗传学特征，力图从细胞生物学角度为“BCND作为独立的乳腺癌亚型”提供更多的支撑依据。目前BCND相关的分子遗传学研究数量较少，涉及染色体核型分析、基因表达谱研究和基因突变等[14-18]。已有研究显示BCND与非特殊型浸润性癌存在分子遗传学上的差异[14-17]。本文使用基于LIFE-Ion Torrent平台的二代测序(next-generation sequencing, NGS)技术、Sanger测序和qPCR对BCND进行基因突变分析，探讨高通量测序技术在BCND分子遗传学研究中的应用，促进对该组肿瘤生物学特性的认识，寻找可能存在的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 WHO(2012)乳腺肿瘤分类中的BCND具有异质性，包含形态学与预后不同的3组肿瘤[2]：高分化神经内分泌肿瘤(类癌样)、低分化神经内分泌癌/小细胞癌、伴有神经内分泌分化的浸润性癌。同时，WHO(2012)乳腺肿瘤分类未对神经内分泌标记的阳性界值进行约定。为了减少研究病例的异质性，本组病例的纳入/排除标准参考WHO(2003)乳腺肿瘤分类[1]和2015年乳腺神经内分泌病变专家共识[3]：(1)≥50%浸润癌细胞表达CgA和(或)Syn；(2)排除表达神经内分泌标记的单纯性特殊型癌，如富于细胞型黏液癌、实体乳头状癌和浸润性小叶癌等。本组收集四川大学华西医院病理科2010年1月～2014年9月外检档案20例BCND。收集病例的临床病理信息，包括患者性别、年龄、组织学分级、分期和基于免疫组化染色的替代分子分型；替代分子分型参考St.Gallen早期乳腺癌国际共识。

12月4日，农业农村部部长韩长赋在中国农村土地制度改革——庆祝中国农村改革40周年座谈会上强调，今年是我国农村改革40周年，也是实施乡村振兴战略的开局之年。站在新的时代起点上，要深刻把握习近平总书记关于农村土地制度改革的重要论述，在系统梳理我国农村土地制度变革历程和历史经验的基础上，进一步认清形势、理清思路，把握好新时代农村土地制度改革的方向，加强制度创新和制度供给，让农村资源要素活化起来，激发广大农民积极性和创造性，为乡村振兴提供强大动力。

1.2 方法

1.2.1 肿瘤DNA提取和定量 选取研究病例具有代表性的乳腺原发灶石蜡组织块(肿瘤成分均超过50%)，使用德国Qiagen公司QIAamp DNA FFPE Tissue Kit试剂盒提取肿瘤组织DNA。使用Nanodrop分光光度计对DNA样本进行浓度测定。使用北京雅康博生物公司的DNA定量及质量检测试剂盒(NGS06-C96-01)进行DNA定量(荧光PCR法)。

1.2.2 Ion Torrent测序 所有流程均按试剂盒操作说明书进行。(1)文库构建：使用北京雅康博生物公司开发的科吉安CureSeq PAN-Cancer Panel V1试剂盒对肿瘤目的基因进行靶向扩增。该试剂盒涵盖17个常见肿瘤基因的44个外显子。检测基因包括：KRAS、PIK3CA、PDGFRA、EGFR、BRAF、NRAS、KIT、ERBB2、RET、FLT3、DNMT3A、ALK、DDR2、NPM1、SMO、ABL1、TSC1。使用北京雅康博生物公司文库制备通用试剂(NGS-Q0101-32、NGS-Q0201-32)和文库纯化磁珠(NGS-Q0301-32)标化PCR产物、添加测序接头和序列标签、纯化连接产物。使用ION文库定量检测试剂盒(NGS07-C96-01)进行文库定量和质量检测。(2)乳液PCR和磁珠颗粒富集：使用Life Technologies的PGM OT2200试剂盒在Ion OneTouch2上进行乳液PCR；使用PGM Enrichment Beads试剂盒在Ion Enrichment system上对模板阳性磁珠颗粒进行富集。(3)Ion Torrent PGM平台测序：使用Life Technologies的PGM Sequencing 200 V2试剂盒及Ion Torrent 318 V2芯片(P32129.1)在Ion Torrent PGM平台上进行测序反应，合计500个测序循环。(4)测序结果分析：使用北京雅康博生物公司的科吉安Pan panel V1.0软件对Ion Torrent数据进行分析，得到整体数据量、平均测序深度、测序特异性、测序均一性和参考序列匹配程度等数据。平均测序深度≥2 500，测序特异性≥95%，测序均一性≥95%。

[1] Tavassoli F A, Devilee P. World Health Organization classification of tumours. Pathology and genetics of tumours of the breast and female genital organs[M]. Lyon: LARC Press, 2003:32-34.

1.2.4 qPCR检测 针对EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、NRAS基因的12个突变位点，使用北京雅康博生物公司科吉安qPCR试剂盒对20例肿瘤进行qPCR检测。上述位点与NGS套餐涵盖的相应基因位点一致。反应条件：95 ℃预变性6 min，95 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，合计35个循环后，72 ℃延伸10 min。扩增产物使用ABI 7900T实时荧光定量PCR系统(美国应用生物系统公司)进行检测。将qPCR检测与NGS检测结果进行对比分析。

[12] Bogina G, Munari E, Brunelli M, et al. Neuroendocrine differentiation in breast carcinoma: clinicopathological features and outcome[J]. Histopathology, 2016,68(3):422-432.

2 结果

2.1 临床特点 本组BCND患者中女性19例，男性1例。发病年龄32～83岁，平均55.5岁。左侧乳腺肿块7例，右侧乳腺肿块13例。镜下肿瘤的组织学形态多数表现为WHO(2012)乳腺肿瘤分类界定的第三组肿瘤，即伴神经内分泌分化的浸润性癌(非特殊型)(图1～3)。少数病例的肿瘤细胞呈梭形(图4)、浆细胞样或胞质透明。1例肿瘤具有梁索状、脑回状结构(图5)。组织学分级2级12例，3级8例。16例肿瘤ER阳性/PR阳性、3例ER阳性/PR阴性、1例ER阴性/PR阴性。HER-2免疫组化8例0/1+、10例2+、2例3+，其中1例2+病例呈HER-2基因扩增(图6)。基于免疫组化染色的替代分子分型：7例Luminal A型，12例Luminal B型(10例HER-2阴性、2例HER-2阳性)，1例HER-2过表达型。肿瘤分期：Ⅰ期1例、Ⅱ期15例、Ⅲ期3例，1例穿刺病例缺乏分期信息(表1)。

[6] 郜红艺, 吴坤河, 张佳立, 等. 伴破骨细胞样巨细胞的乳腺神经内分泌癌1例[J]. 临床与实验病理学杂志, 2007,23(5):636-637.

3 讨论

随着近年相关临床病理研究的增多，BCND作为独立乳腺癌亚型的临床证据日益丰富[7-13]。相应分子遗传学研究则提供进一步的支撑数据[14-17]。Weigelt等[15]的基因表达谱研究发现多数BCND属于ER阳性管腔型特殊类型浸润癌，形成独立的分子亚组。进一步的转录谱分层聚类分析显示BCND与B型黏液癌归属同一类别，与组织学级别和分子亚型匹配的非特殊型浸润性乳腺癌不同[16]。Xiang等[14]的细胞遗传学研究发现BCND存在克隆性染色体异常、复杂染色体核型和可见于肺/胃肠道神经内分泌肿瘤的染色体异常。上述报道提示BCND具有独特的分子生物学特征。

 

表1 伴神经内分泌分化乳腺癌临床特点和基因突变检测

  

病例性别年龄(岁) 组织学分级TNM分期分子分型NGS检测Sanger检测qPCR检测EGFR/KRAS/BRAF/PIK3CA/NRAS1女612级T2N0M0，ⅡALuminalB型(HER⁃2阴性)野生型N/D野生型2女583级T3N1M0，ⅢALuminalB型(HER⁃2阴性)野生型N/D野生型3女782级T2N0M0，ⅡALuminalA型野生型N/D野生型4女482级T2N0M0，ⅡALuminalA型野生型N/D野生型5女493级T2N2M0，ⅢAHER⁃2过表达型PIK3CAH1047RPIK3CAH1047RPIK3CAH1047R6女562级-LuminalB型(HER⁃2阴性)野生型N/D野生型7女582级T2N0M0，ⅡALuminalB型(HER⁃2阴性)野生型N/D野生型8女552级T2N1M0，ⅡBLuminalB型(HER⁃2阴性)野生型N/D野生型9女423级T2N1M0，ⅡBLuminalB型(HER⁃2阴性)野生型N/D野生型10女453级T2N1M0，ⅡBLuminalB型(HER⁃2阴性)野生型N/D野生型11女483级T1cN1M0，ⅡALuminalB型(HER⁃2阴性)野生型N/D野生型12女462级T1cN0M0，ⅠALuminalB型(HER⁃2阳性)PIK3CAE542K野生型PIK3CAE542K13男483级T2N1M0，ⅡBLuminalA型野生型N/D野生型14女592级T2N1M0，ⅡBLuminalB型(HER⁃2阳性)野生型N/D野生型15女482级T2N1M0，ⅡBLuminalB型(HER⁃2阴性)野生型N/D野生型16女733级T1N1M0，ⅡALuminalA型野生型N/D野生型17女462级T2N0M0，ⅡALuminalA型野生型N/D野生型18女323级T2N3M0，ⅢCLuminalA样野生型N/D野生型19女772级T2N0M0，ⅡALuminalA型野生型N/D野生型20女832级T2N0M0，ⅡALuminalB型(HER⁃2阴性)野生型N/D野生型

N/D：未检测

  

①②A②B③④⑤⑥A⑥B图1 例5伴神经内分泌分化乳腺癌的肿瘤细胞团巢形态、大小不一，呈不规则浸润性生长；肿瘤细胞胞质红染，中等核级，可见核仁 图2 例5肿瘤细胞CgA(A)和Syn(B)呈阳性，非生物素标记Multimer法 图3 例12的组织学呈非特殊型浸润性癌形态，部分肿瘤团巢可见腺腔，间质纤维血管增生 图4 伴神经内分泌分化乳腺癌肿瘤细胞呈梭形 图5 伴神经内分泌分化乳腺癌肿瘤细胞呈梁索状、脑回状排列 图6 A．例14HER⁃2免疫组化染色3+，非生物素标记Multimer法；B．例12HER⁃2基因扩增，FISH法

  

图7 例5 Sanger测序显示PIK3CA H1047R突变

  

图8 例5 qPCR检测显示PIK3CA H1047R突变

目前，针对BCND的基因突变研究较少[17-18]。BCND的基因突变谱特点、与肿瘤发生、发展的相关性以及有无潜在的突变治疗靶点均需深入探索。本组使用基于LIFE-Ion Torrent平台的NGS以及Sanger测序和qPCR对20例BCND进行基因突变分析，发现2例(10%)BCND存在PIK3CA突变。Marchiò等[17]研究中BCND的PIK3CA突变率为13%(2/15)。Ang等[18]研究中PIK3CA突变率为20%(3/15)，其检测结果与本实验差异性可能与以下2个因素有关：(1)仅2例BCND使用NGS检测基因突变，多数肿瘤的检测方法是PCR/质谱分析技术；(2)BCND原发灶仅1例具有PIK3CA突变(1/11，9.1%)，另2例PIK3CA突变标本为BCND转移癌灶(2/5，40%)。因此，上述研究提示BCND原发灶的PIK3CA突变率约为10%，与The Cancer Genome Atlas(TCGA)数据库中 “neuroendocrine breast carcinoma-enriched cluster”的PIK3CA突变率(9%)一致[17]。既往研究显示非特殊型浸润性乳腺癌中PIK3CA突变率为25%～30%，其中Luminal型乳腺癌突变率更高(A型45%～49%、B型29%～32%)[18-19]。本组显示多数BCND分子分型属于Luminal型，但其PIK3CA突变率低于普通型Luminal乳腺癌，而与三阴型乳腺癌相似(突变率约9%)。普通型乳腺癌常见的PIK3CA突变位点包括9号外显子E542K、E545K以及20号外显子H1047R、H1047L[20]。本组2例肿瘤的突变位点是E542K和H1047R。Ang等[18]报道2例转移癌灶的突变位点分别为E542K、E545K，1例原发灶为N345K。BCND转移癌灶中PIK3CA突变率高于原发灶，与普通型乳腺癌中的发现一致[21]，提示PIK3CA突变可能与肿瘤转移有关。

除外PIK3CA基因突变，文献报道BCND还存在其他基因突变。Ang等[18]使用PCR/质谱分析(53基因)和NGS(37基因)检测15例BCND发现：PIK3CA E542K和N345K突变肿瘤分别伴FGFR4 V550M、FGFR1 P126S突变，1例BCND的原发灶和转移灶均存在HRAS G12A突变，1例原发灶存在KDR A1065T突变。以上伴随突变(FGFR、HRAS和KDR)在普通型乳腺癌中少见或未有报道。Marchiò等[17]NGS研究(254基因)发现BCND缺乏p53突变，阳性突变包括GATA3、FOXA1、TBX3、ARID1A(均为3/18，17%)、AKT1和CDH1(均为2/18，11%)。与普通型Luminal型乳腺癌相比，BCND具有不同的基因突变谱，即缺乏p53突变、低PIK3CA突变、更高比例的FOXA1、TBX3、ARID1A突变，且ARID1A突变见于其它脏器的神经内分泌肿瘤[17]。该研究还发现33% BCND的E-cadherin表达降低，类似于胃肠道和前列腺的神经内分泌肿瘤。上述结果支持BCND是不同于普通型乳腺癌的特殊类型。Marchiò等[17]研究提示伴神经内分泌分化的乳腺黏液癌和浸润性小叶癌的基因突变谱与经典型黏液癌、浸润性小叶癌一致，支持WHO(2015)乳腺专家组提出“特殊型乳腺癌的组织学分型标准应基于形态学，而不是神经内分泌标记是否阳性”。

(5)多元评价：课堂教学采用翻转课堂形式，每个创业工作坊团队派出成员进行作品展示，汇报实践成果，其他同学提出存在的问题，然后小组成员进行头脑风暴、讨论解决方案。最后进行多元评价，教师根据实践结果以及成员参与度进行评价，同时各团队之间进行互评，还可以邀请企业导师从行业角度进行阶段性结果评价。

参考文献：

尽管有研究显示乳腺癌患者通过依维莫司的治疗获益与PIK3CA基因状态缺乏相关性，近期的临床试验(BOLERO-1、BOLERO-3)数据显示[23]：PIK3CA基因突变或PI3K通路活化的HER-2阳性晚期乳腺癌患者可以从依维莫司治疗中获益，而PIK3CA野生型患者缺乏获益。因此，检测PIK3CA突变状态能够预测HER-2阳性乳腺癌对依维莫司的治疗效果。BOLERO-1和BOLERO-3中HER-2阳性乳腺癌患者的PIK3CA突变率分别为30%、32%[23]。本组3例BCND为HER-2阳性肿瘤，其PIK3CA突变率为66.7%；余17例HER-2阴性肿瘤缺乏PIK3CA突变，提示BCND中PIK3CA突变与HER-2阳性有相关性，HER-2阳性BCND患者可能是依维莫司靶向治疗的优选群体。

综上所述，BCND具有不同于非特殊型浸润性乳腺癌的基因突变谱，支持BCND是一种具有独特分子遗传学特征的乳腺癌亚型。BCND原发灶的PIK3CA突变率约10%，该基因突变可能与HER-2阳性相关。PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂可能成为BCND的靶向治疗选择。同时，高通量NGS技术可用于BCND石蜡标本的基因突变检测。鉴于本组病例数有限、基因检测试剂盒覆盖面较窄，关于BCND的广谱基因突变还有待于进一步分析。

在课前，教师可以将课程视频、课件以及其他学习资料上传到网络教学平台，发布学习任务和学习通知。由于网络教学平台有对应开发的手机端教师和学生分别使用的APP，这时这些学习资料、学习任务、学习通知也会同时推送给学生。学生可以用手机观看课程视频、课件等资料，也可进行课前测试、参与在线讨论等；教师可以通过手机端随时查看学生的学习情况，批阅学生的测试，参与论坛讨论等。

显然，正如前面所提及的，在此应清楚地看到理论的作用：正是后者决定了应当如何对相关事实或事件进行叙述、记载和表达．这也就如舒尔曼所说：“把经验叙述出来，本身进行了选择和概念化．”当然，这方面的工作往往又有一个逐步深入、不断加工的过程：“案例是对直接经验的再收集、再陈述、再经历和反思．记忆、复述、再经历和反思的过程，也就是从经验中学习的过程．”[5]显然，这事实上也就是理论与教学实践之间的辩证运动，只有这样，才能真正超越单纯的“经验总结”并使自己的研究工作具有更大的普遍意义．

本组进行基因突变检测的初始病例为21例，均为5年以内石蜡标本，NGS检测成功率为95.2%(20/21)。其中1例肿瘤样本因DNA和文库质量原因导致NGS测序深度不足。NGS、Sanger测序和qPCR检测结果对比分析，显示NGS和qPCR的检测灵敏度优于Sanger法。NGS检测例12发现PIK3CA E542K突变属于低丰度突变(4.9%)，导致Sanger法报告阴性。已有研究显示NGS能够成为测序检测的可靠方法[24]，特别是具有异质性的肿瘤样本和混杂组织样本。此外，在适合的参数设定下，NGS检测可以达到甚至超过qPCR的检测灵敏度和特异性，并提供更为丰富的基因突变信息、检测非热点突变、定量分析肿瘤基因的异质性。

基因突变谱分析和检测已经促进众多实体肿瘤的靶向治疗、辅助诊断和预后判定，其代表包括肺癌EGFR检测、胃肠道间质肿瘤c-Kit检测以及甲状腺乳头状癌BRAF检测。PIK3CA基因所属PI3K/AKT/mTOR信号通路在肿瘤细胞增殖、血管生成、肿瘤侵袭转移和治疗抵抗中具有重要作用。PIK3CA突变是该信号通路中常见的基因改变，可导致信号通路激活、mRNA转录和细胞增殖以及与内分泌信号通路形成交叉而诱导耐药[22]。约70%乳腺癌出现PI3K/AKT/mTOR信号通路活化，寻找相关治疗靶点成为研究热点。目前针对该通路研发的靶向药物包括PI3K抑制剂、PI3K/mTOR双重抑制剂、mTOR抑制剂以及AKT抑制剂等[22]。其中上市药物依维莫司(Everolimus属mTOR抑制剂)已被美国食品药品管理局批准用于治疗晚期乳腺癌和胰腺神经内分泌肿瘤。BCND对传统的乳腺癌辅助治疗反应性差，依维莫司可能成为其靶向治疗的选择。

1.2.3 Sanger测序验证NGS阳性检测结果 实验针对NGS阳性结果设计PCR引物、进行目标片段扩增。然后对PCR产物进行纯化及进一步测序扩增。使用ABI 3500XL基因分析仪进行Sanger测序，结果使用Mutation Surveyor软件进行分析。将Sanger测序结果与NGS检测比较，评估两者的检测一致性。

（2）持有或控制基金、证券业机构的股份。企业集团直接参与到非银行机构等金融机构中，直接参与金融机构的投资，从中获取高额回报，是企业集团产融结合的主要路径。企业集团投资到基金、证券行业等非银行金融机构中，能够极大地发挥基金、证券等融资、理财及投资工具的价值，吸收社会闲散资金、进行直接的社会融资，为企业提供稳定的资金来源及稳固的资金纽带。

枸杞(Lycium barbarum)，又称枸杞子、红耳坠，是茄科小灌木枸杞的成熟子实。枸杞子药食同源的历史悠久，是驰名中外的名贵中药材，早在《神农本草经》中就被列为上品。枸杞子中含有多种氨基酸，并含有甜菜碱、玉蜀黍黄素、酸浆果红素等特殊营养成分，使其具有非常好的保健功效。

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因盘山在清代是东陵的必经之地，并且《盘山志》的传播使其在当时人们心中地位极重，智朴虽静净自处，但亦不可避免会有与因公务来此或仰慕山名来此的朝臣文人接触、交流的机会。 如果说智朴与康熙来往，只能是主从之间恭敬的诗歌相和，那么他和朝臣、文人士大夫之间交游则方式多样，更加从容。 主要有以下四种：

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2.2 基因突变检测 NGS检测显示2例肿瘤(例5、12)分别存在PIK3CA 20号外显子H1047R和9号外显子E542K突变。其中H1047R突变也通过Sanger测序证实(图7)。NGS检测发现PIK3CA H1047R突变和E542K突变在qPCR中呈阳性(图8)，且例5、12均为HER-2阳性肿瘤(表1)。

地震释放的能量以波的形式向各个方向传播，引起地面晃动。地面的强烈震动使设备产生加速度，故设备所受到的地震影响程度可用地面加速度来表示。地震的响应谱是根据一次地震中强震仪记录的加速度时程曲线计算得到的谱，也就是具有不同周期和一定阻尼的单质点结构在地震地面运动影响下的最大反应与结构自振周期的关系曲线。在工程上，通常可分为位移、速度、加速度三种响应谱，一般而言，响应谱分析的激励采用的是加速度谱。

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两大园林盛事齐聚扬州市，目前规划与建设正在如火如荼地进行，努力建设融示范性、文化性、参与性于一体的区域郊野公园和大地景观，将园林园艺展览、生态休闲、健身漫步、非遗展示和公共艺术等融为一体，也为枣林湾创建国家级旅游度假区和打造宁镇扬都市圈后花园、长三角旅游目的地奠定基础。

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下一步，工业和信息化部将积极指导各基础电信运营企业做好5G系统试验的基站部署，开展好5G系统基站与同频段、邻频段卫星地球站等其他无线电台站的干扰协调工作，确保各类无线电业务兼容共存，促进我国5G产业的健康快速发展。

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S主要是作为集尘面积而存在，而ω则是粉尘在电场中的理论驱进速度，理论驱进速度是能够直接将粉尘在电晕场中运动的难易程度的指标反映出来。在设计烟气量一定的前提下，集尘面积S是由除尘器的结构所决定的，且与阳极管的长度、电场有效截面积和电场风速相关。因此，在一体式湿电选型设计时，电场有效截面积受到吸收塔截面积的制约，从而影响电场风速的选取。