槭属树种DNA提取方法比较研究

槭属Acer植物是世界闻名的观赏树种，其主要产地为中国和日本，我国有160余种，占全世界槭属种类的75%[1]。槭属植物多为乔木或灌木，树姿优美、叶形秀丽，其观赏价值主要由叶色和叶形决定。秋季叶渐变为红色或黄色，亦有青色或紫色，极具观赏价值，是具有重要经济价值的庭园绿化树种[2]。由于槭属树种种类多样，遗传变异频繁，是高度分化的类群[3]，利用分子技术进行遗传多样性研究及对其杂交后代进行鉴定，探讨相近种间的系统关系才能更好地对槭属树种进行科学的分类及亲缘关系分析[4]。DNA是遗传信息的载体，是分子生物学研究的主要对象，因此，DNA的提取应是分子生物学实验中最基本也是最重要的操作技术[5]。不同试材选择适宜的提取方法提取高质量的DNA至关重要。本试验采用了实验室常用的3种DNA提取方法，对槭属树种基因组DNA进行提取，旨在比较不同提取方法的提取效果及优缺点，以期获得高质量槭属树种基因组DNA提取的有效方法，为进一步开展槭属树种种质资源遗传多样性研究和指纹图谱的构建奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料采自辽宁省林业科学研究院凤城苗圃内栽植的美国红枫（表1），选取幼嫩的新生枝条于冰盒内带回备用，液氮冷冻后于-70℃保存。

1.3.2.1 健康与教育管理 对管理组患者管理，每月记录患者血压、血脂与血糖等情况，并进行患者自行药物治疗的监督与指导。每季度开展一次健康教育讲座与交流，使病人对冠心病的临床表现及其危害、如何预防及药物治疗等有进一步的认识。通过上门入户进行一对一宣教、日常门诊随访等形式，定期对建立健康卡的冠心病患者进行危险因素的评估、科学合理的生活方式指导和监督，同时也对患者家属进行宣教，使患者的生活方式科学化及冠心病高危因素的控制得到落实。

 

表1 供试槭树树种

  

中文名红花槭色木槭糖 槭挪威槭元宝槭拧筋槭三角槭假色槭拉丁名Acer rubrum A.mono A.saccharum A.platanoides A.truncatum A.triflorum A.buergerianum A.pseudo-sieboldianum

1.2 试验方法

1.2.1 改良CTAB法

称取0.5 g供试树种叶片，洗净擦干并剪碎，在液氮中研磨成粉末后，转入装有700 μL 2%CTAB的1.5 mL离心管中，漩涡振荡5 s；将离心管放入65℃水浴锅中水浴30 min，每隔10 min轻轻摇匀1次；加入700 μL酚、氯仿、异戊醇混合液（25：24：1），并轻轻摇动，12 000 r·min-1离心5 min，取上清液，重复1～2次；将上清液移至另一1.5 mL离心管中，加入3 μL RNase A，充分混匀后，37 ℃保温20 min；取上清液加入1 mL-20℃预冷的无水乙醇，然后-20℃放置30 min，4 ℃ 10 000 r·min-1离心10 min，收集沉淀；将沉淀移至另一1.5 mL离心管中，加入1.5 mL 70%的乙醇，轻摇 5 min，4 ℃ 10 000 r·min-1离心10 min，收集沉淀，重复1次；打开离心管盖，在超净工作台晾干后，加入50 μL TE缓冲液，4℃放置至DNA完全溶解，-20℃保存备用。

1.2.2 改良SDS法

WG-50的参数：14米防水，1.6米防摔，零下10摄氏度防冻，相比对手来说并不起眼，但是100公斤的防冲击设计只有奥林巴斯和理光才有。这台相机的做工出色，不过手柄较浅，很难提供足够的握持空间。2.7英寸的显示屏也不尽如人意。拍摄视频时效果尚可，1600万像素的4：3静态图像则会显得太小，23万画点的分辨率的屏幕难以满足需求，较低的对比度也让用户很难通过屏幕查看曝光。

称取0.5 g供试树种叶片，洗净擦干并剪碎，在液氮中研磨成粉末后，转入装有700 μL 1.5%SDS和10 μL β-巯基乙醇的1.5 mL离心管中，漩涡振荡5 s；将离心管放入65℃水浴锅中水浴30 min，每隔10 min轻轻摇匀1次；加入700 μL酚、氯仿、异戊醇混合液（25：24：1），并轻轻摇动，12 000 r·min-1离心5 min，取上清液，重复1～2次；将上清液移至另一1.5 mL离心管中，加入3 μL RNase A，充分混匀后，37℃保温20 min；取上清液加入1 mL-20℃预冷的异丙醇，然后-20℃放置30 min，4℃下10 000 r·min-1离心10 min，收集沉淀；将沉淀移至另一1.5 mL离心管中，加入1.5 mL70%乙醇，轻摇5 min，4℃下10 000·min-1离心10 min，收集沉淀，重复1次；打开离心管盖，在超净工作台晾干后，加入50 μL TE缓冲液，4℃放置至DNA完全溶解，-20℃保存备用。

归因理论既关乎我们的日常生活，又影响着教育教学活动的开展与更新。思想政治教育工作者理应根据当代大学生实际境况，结合归因理论进行思想政治教育。

按照植物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN）的操作手册进行实验。

2015年中央“一号文件”《关于加大改革创新力度加快农业现代化建设的若干意见》回答了在经济新常态下怎样实现农业农村新发展。文件分5部分32条，包括围绕建设现代农业，加快转变农业发展方式；围绕促进农民增收，加大惠农政策力度；围绕城乡发展一体化，深入推进新农村建设；围绕增添农村发展活力，全面深化农村改革；围绕做好“三农”工作，加强农村法治建设。进一步让农业强起来，让农村美起来，让农民富起来。

1.2.4 DNA完成性检测

取4 μL提取的基因组DNA样品，在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测，并使用紫外凝胶成像系统（BIO-RAD）观察、拍照，分析DNA完整性。

一般而言，纯净的基因组DNA OD260/OD280值应介于1.8～2.0。如果比值低于1.8，表明存在蛋白质或者酚类物质的影响，如果比值大于2.0表明可能存在RNA污染。

从图1可以看出，用改良的CTAB法和试剂盒法提取的DNA条带完整清晰，无明显拖尾现象，其中改良CTAB法提取的DNA条带亮度较高，试剂盒法提取的DNA条带更干净无杂质。改良SDS法提取的DNA条带模糊弥散，且拖尾较严重，杂质较多。

参考文献：

④在宪法理论上，制宪权属于人民，一个新的政权诞生时会制定宪法，在该政权存续期间只是对所制定的宪法进行修改，所以在我国宪法中只规定全国人大有修改宪法的权力，并没有赋予其制定宪法的权力。

2 结果与分析

2.1 DNA完成性检测

取1 μL基因组DNA样品，稀释10倍后于Nanodrop 2000（Thermo）上点样，分别测定DNA纯度及浓度。

  

图1 不同方法提取槭属树种基因组DNA电泳结果

 

注：A为改良CTAB法；B为改良SDS法；C为试剂盒法。

2.2 DNA纯度与浓度检测

1.2.5 DNA纯度与浓度检测

较单一模式的句酷批改网而言，学生认为三稿式人机结合的反馈模式能更加显著地提高他们的英语写作水平（P=0.006），这与上文前后测的结果一致。

 

表1 不同方法槭属树种基因组DNA提取结果

  

提取方法改良CTAB法改良SDS法试剂盒法OD260/OD280 1.91 1.46 1.83 OD260/OD230 2.03 1.25 2.13 DNA纯度＞1.8＜1.8＞1.8 DNA浓度/μg·μL-1 48.82 13.48 35.57

从表1看出，采用的3种基因组DNA提取方法的OD260/OD280值存在较大差异。改良CTAB法和试剂盒法提取的基因组DNA OD260/OD280平均值在1.8～2.0，说明这2种方法提取的DNA中蛋白质、酚污染较少，纯度较高，总体来看试剂盒法提取的基因组DNA纯度更好。而改良SDS法提取的基因组DNA OD260/OD280平均值小于1.8，说明提取的基因组DNA中存在着一定的蛋白质或酚类物质。此外，230 nm波长是多肽、芳香基团和一些碳水化合物的吸光度，因此OD260/OD230值的大小反映了DNA样品中存在的碳水化合物、盐类或有机溶剂等的污染情况。一般情况下OD260/OD230值应大于2.0。结果表明，改良CTAB法和试剂盒法OD260/OD230值均大于2.0，而改良SDS法OD260/OD230值远小于2.0，说明提取的DNA中存在碳水化合物、盐类或有机溶剂等杂质污染。改良CTAB法的DNA提取浓度最高，试剂盒法次之，改良SDS法提取浓度最少。

3 讨论

槭属树种叶片细胞中含有大量色素，如花青素、叶绿素、胡萝卜素等，而且种类和含量会随季节变换而发生变化。同时，槭属树种中糖类和酚类物质含量较高，这些物质往往会对后续PCR扩增结果造成较大影响，因此在其基因组DNA提取过程中，选择合适的提取方法尤为重要。本研究使用目前比较常用的3种DNA提取方法提取了8种槭属树种叶片的基因组DNA，通过对提取的DNA完整性、纯度以及浓度比较后发现，改良CTAB法与试剂盒法的提取效果较好，均可以满足后续研究[6]。而改良SDS法的提取效果最差，蛋白质、多糖及酚类物质等杂质含量较多，电泳条带弥散严重，DNA提取率也不高。改良CTAB法提取的DNA浓度虽然最高，但是纯度比TIANGEN试剂盒提取的纯度低，而使用TIANGEN试剂盒提取的DNA浓度虽比改良CTAB法低，但是提取的纯度最高，且完整性好，从试验成本方面看，试剂盒价格较高。因此，可以根据实验实际情况来选取适宜的提取方法。

1.2.3 试剂盒法

以上试验所用试剂均购于北京TIANGEN生物有限公司。

［1］刘静波，林士杰，张忠辉，等.槭属植物种质资源研究进展[J].中国农学通报，2012，28(25)：1-5.

［2］李倩中，苏家乐，陈尚平，等.江苏省槭树科植物的利用现状与发展建议[J].江苏农业科学，2006(6)：282-284.

［3］胡颖.槭属植物SRAP技术体系的建立及其遗传多样性研究[D].郑州：河南农业大学，2009.

［4］钱永生，王慧中，黎念林，等.十一种槭属植物遗传多样性AFLP分析[J].浙江林业科技，2007(1)：1-5.

［5］张继红，陶能国，张小云，等.三种豆科植物总DNA提取方法的比较[J].湖南农业科学，2007(2)：31-33.

再美的梦也终究是梦，一定会有醒来的那一刻。党的十八大以来，在正风反腐高压态势下，一起起案例公开曝光，一只只蛀虫被清除出干部队伍，在社会上引起强烈震动，使李青海从自己的酣梦中惊醒了过来。

［6］刘巍，陈罡，颜廷武，等.美国红枫SRAP反应体系优化[J].北方园艺，2015(2)：79-83.