阿奇霉素和克拉霉素对铜绿假单胞菌生物膜形成的作用

铜绿假单胞菌是一种条件致病菌，分泌的多糖蛋白复合物相互黏连形成膜状物，即生物膜(biofilm，BF)[1-2]。BF的形成会减少抗菌药物的渗透，增加其水解，使其在BF内部达不到有效抑菌浓度，导致感染病灶内的细菌难以彻底清除[3-4]。因此，如何使药物穿透BF的屏障作用是亟待解决的问题。研究显示大环内酯类药物可以帮助某些抗菌药物渗透进入BF内部，起到有效抑菌作用[5]。克拉霉素、阿奇霉素作为十四元环、十五元环大环内酯类的代表药物，是否能增强头孢他啶、环丙沙星和庆大霉素等临床治疗铜绿假单胞菌感染常用药物的抑菌作用值得进一步研究。本研究选用铜绿假单胞菌标准菌株和3株临床分离菌株，建立BF体外模型，测定阿奇霉素和克拉霉素对BF形成的抑制作用，以及联合头孢他啶、环丙沙星或庆大霉素时对BF内细菌的灭杀作用。

1 材料与方法

1.1 菌株 铜绿假单胞菌ATCC 27853由山东大学第二医院检验科保存；临床分离菌株PA1(β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类药物均敏感的非黏液型)、PA2(β-内酰胺类、氨基糖苷类除外庆大霉素、喹诺酮类药物均耐药的非黏液型)、PA3(β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类药物部分敏感的黏液型)分离自2016年12月至2017年3月山东大学第二医院临床呼吸道标本，经MicroScan WalkAway-96全自动细菌鉴定药敏分析仪(德国西门子公司)完成鉴定及药敏试验。

1.2 主要试剂及仪器 0.22 μm孔径微孔滤膜(直径1 cm)、阿奇霉素(azithromycin，AZM)、克拉霉素(clarithromycin，CLR)、头孢他啶(ceftazidime，CAZ)、环丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate，GEN)标准品、Muller-Hinton琼脂(MHA)、Mueller-Hinton肉汤(MHB)和胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)(北京索莱宝公司)；噻唑蓝(MTT)试剂盒(江苏凯基生物公司)；戊二醛、甲醛、乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钙、硝酸银、对苯二酚、硫代硫酸钠、结晶紫、二甲亚砜(DMSO)均为分析纯(上海国药公司)；24孔和96孔培养板(浙江硕华公司)；比浊仪(德国西门子公司)；酶标仪(郑州安图公司)。

1.3 抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)测定[6] 用微量肉汤稀释法测定AZM、CLR、CAZ、CIP和GEN对铜绿假单胞菌的MIC值。挑取M-H平板37 ℃培养过夜单菌落至灭菌生理盐水中,调整浊度为0.5麦氏浊度单位；100倍稀释后(约1×106 CFU/mL)加入含对倍稀释抗菌药物的96孔板中，药物浓度范围为0.125～256 μg/mL；以不含抗菌药物的菌液和M-H肉汤作为阳性和阴性对照，37 ℃培养箱24 h后观察结果。

1.4 BF体外模型建立及银染法快速鉴定[7-8] 取MHB 中37 ℃培养过夜的菌液，并调整浓度至0.5麦氏浊度单位，然后吸取50 μL加入24孔板中，同时每孔加入2 mL TSB和无菌微孔滤膜，设3个复孔，以未经培养的微孔滤膜作为阴性对照，37 ℃培养7 d，每48小时更换一次培养基。取出24孔板中的微孔滤膜，经灭菌生理盐水漂洗，去除表面浮游菌。经体积分数为2.5%的戊二醛PBS溶液固定，饱和氯化钙结合，硝酸银染色，对苯二酚显色，硫代硫酸钠固定后，若微孔滤膜为灰黑色，即可初步鉴定已形成BF。

使用SPSS软件进行方差分析，结果见表4．由表4可以看出，在95%的置信水平下值明显小于0.05，所以应该拒绝原假设，接受备择假设，认为大学生对外卖服务的满意度影响他们对市场未来前景的观点．

1.6 AZM、CLR与其他抗菌药物协同作用[10] 按照方法1.4培养BF。取出已培养好的微孔滤膜，灭菌生理盐水漂洗去除浮游菌，再分别加入含有1 MIC CAZ、CIP、GEN(ATCC 27853：1、0.125、0.25 μg/mL；PA1：8、0.25、1 μg/mL；PA2：256、32、2 μg/mL；PA3：8、2、0.25 μg/mL)以及分别与1/16 MIC AZM、1/16 MIC CLR(ATCC 27853：2、4 μg/mL；PA1：2、16 μg/mL；PA2：4、8 μg/mL；PA3：4、8 μg/mL)两两组合的TSB溶液中，37 ℃培养24 h。取出微孔滤膜并用灭菌生理盐水轻轻漂洗，放入3 mL MHB中，超声作用10 min，涡旋震荡5 min，吸取100 μL加入96孔板，加入MTT溶液50 μL，37 ℃温育4 h，使MTT还原为甲臜，移除上清液，每孔加入150 μL DMSO使甲臜溶解，30 min后用酶联仪测定波长490 nm处的A值，以此代表铜绿假单胞菌BF中活菌数。设4个复孔。

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2.2 BF模型的银染法鉴定 银染后可见对ATCC 27853、PA1、PA2、PA3菌株进行培养的微孔滤膜表面覆盖物均为灰黑色，浓厚致密，呈棉絮状膜样，而空白对照仅可见散落的黑点，无黑色的絮状膜样物，见图1。说明4个菌株均形成BF。

2 结果

2.4 阿奇霉素、克拉霉素与其他抗菌药物的协同杀菌作用 MTT结果显示，1 MIC CAZ、CIP和GEN分别联合1/16 MIC AZM或CLR作用于BF，与单独使用前者相比，可明显减少BF中铜绿假单胞菌的活菌数量。与单独使用1 MIC CAZ相比，联合1/16 MIC AZM使ATCC 27853、PA1、PA2、PA3的A490 nm值显著降低，差异有统计学意义(t=2.57、1.94、2.57、1.94, P均<0.01)；联合1/16 MIC CLR使ATCC 27853、PA1、PA2、PA3的A490 nm值显著降低，差异有统计学意义(t=2.45、2.02、2.45和1.94，P均<0.01)。与单独使用1 MIC CIP相比，联合1/16 MIC AZM使ATCC 27853、PA1、PA2、PA3的A490 nm值显著降低，差异有统计学意义(t=2.45、1.94、2.45和2.02，P均<0.01)；联合1/16 MIC CLR使ATCC 27853、PA1、PA2、PA3的A490 nm值显著降低，差异有统计学意义(t=2.45、1.94、2.45和1.94，P均<0.01)。与单独使用1 MIC GEN相比，联合1/16 MIC AZM使ATCC 27853、PA1、PA2、PA3的A490 nm值显著降低，差异有统计学意义(t=2.45、2.02、2.45和1.94, P均<0.01)；联合1/16 MIC CLR使ATCC 27853、PA1、PA2、PA3的A490 nm值显著降低，差异有统计学意义(t=2.45、1.94、2.45和1.94，P均<0.01)。结果显示联合AZM后A490 nm值下降较联合CLR后明显。见表3。

1.7 统计学分析 用Stata软件进行。正态分布资料以均数±标准差表示，粘附性试验和协同试验数据分析采用两独立样本t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

 

表1 抗菌药物对铜绿假单胞菌MIC值(μg/mL)

  

菌株AZMCLRCAZCIPGENATCC2785332641≤0.1250.25PA13225680.251PA264128>256322PA364128820.25

 

注：A-E，空白微孔滤膜、ATCC 27853、PA1、PA2及PA3形成BF(银染法，×40)；F-J，空白微孔滤膜、ATCC 27853、PA1、PA2及PA3形成BF(银染法，×400)。

图1 银染法观察铜绿假单胞菌BF形成情况

2.3 阿奇霉素和克拉霉素对BF粘附性影响 结晶紫染色结果显示，与对照组粘附物染色的吸光度相比，1/16 MIC AZM使ATCC 27853、PA1、PA2和PA3吸光度明显下降，差异有统计学意义(t分别为2.45、2.45、2.57和3.18, P均<0.05)；1/16 MIC CLR使ATCC 27853、PA1、PA2、PA3吸光度明显下降，差异有统计学意义(t=2.57、2.45、2.45和2.45，P均<0.05)；1/4 MIC的AZM使ATCC 27853、PA1、PA2、PA3吸光度明显下降，差异有统计学意义(t=2.78、2.57、2.45和2.57，P均<0.01)；1/4 MIC的CLR使ATCC 27853、PA1、PA2、PA3吸光度明显下降，差异有统计学意义(t=2.45、2.45、2.45和2.57，P均<0.05)。见表2。

 

表2 AZM和CLR作用铜绿假单胞菌后BF粘附物染色的A595 nm值

  

菌株对照AZM1/16MIC1/4MICCLR1/16MIC1/4MICATCC278530.135±0.0030.121±0.004**0.111±0.006**0.119±0.005**0.114±0.003**PA10.144±0.0050.129±0.007*0.114±0.009**0.130±0.006*0.127±0.005**PA20.144±0.0070.122±0.010*0.118±0.008**0.125±0.008*0.120±0.006**PA30.133±0.0070.115±0.002*0.109±0.005**0.117±0.007*0.114±0.005*

注：与相应对照组(同一菌株未添加抗菌药物)比较，*P<0.05；**P<0.01。

2.1 4株铜绿假单胞菌对抗菌药物的敏感性 AZM、CLR、CAZ、CIP和GEN对铜绿假单胞菌ATCC 27853、PA1、PA2和PA3的MIC值结果见表1。

本文以总债务结构、短期债务结构和长期债务结构三个大类为一级指标建立债务结构指标评估体系，根据各类指标的定义及特征，下设7个二级指标进行第二维度展开分析。本文所选指标全部为比率这类相对值。具体评估体系见表1。

 

表3 AZM、CLR与CAZ、CIP、GEN对铜绿假单胞菌BF的协同杀菌作用(A490 nm值)

  

菌株无抗菌药物CAZCAZ+AZMCAZ+CLRCIPCIP+AZMATCC278530.649±0.0140.513±0.0110.258±0.008**0.405±0.009**0.323±0.0060.128±0.007**PA10.681±0.0100.442±0.0090.142±0.008**0.214±0.006**0.356±0.0090.162±0.007**PA20.566±0.0100.420±0.0080.191±0.005**0.313±0.007**0.382±0.0080.156±0.006**PA30.634±0.0090.492±0.0070.207±0.006**0.325±0.007**0.363±0.0080.200±0.004**菌株CIP+CLRGENGEN+AZMGEN+CLRATCC278530.208±0.008**0.360±0.0120.127±0.010**0.237±0.009**PA10.247±0.009**0.505±0.0090.203±0.006**0.319±0.007**PA20.225±0.007**0.507±0.0090.251±0.007**0.342±0.008**PA30.251±0.008**0.491±0.0050.218±0.006**0.327±0.007**

注：与单独使用相应抗菌药物作用于各菌株数据进行比较，**P<0.01。

3 讨论

当前，是军民融合发展由初步融合向深度融合过渡、进而实现跨越式发展的关键期。省军区系统作为军地联系沟通的桥梁纽带，必须解放思想、更新观念、开拓进取，主动适应新形势，大力宣传贯彻军民融合发展战略思想，使军地双方始终树牢“一盘棋”思想，坚持以国家利益和国家安全为统领，增强做好融合工作的责任感和使命感，营造军民一心、军地一体促进深度融合发展的浓厚氛围。

本研究选用4种铜绿假单胞菌，1种为标准菌株ATCC 27853，另外3种为临床分离菌株。对铜绿假单胞菌常规测定抗菌药物包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类药物。本研究所选取的临床分离菌株对上述抗菌药物具有不同的敏感性，其中PA1为对上述抗菌药物均敏感的菌株，PA2为对上述抗菌药物(除氨基糖苷类的庆大霉素以外)均耐药的菌株，PA3为对上述抗菌药物部分敏感的菌株。此外，在菌落形态方面，所选取菌株中PA1、PA2为非黏液型菌株，PA3为黏液型菌株。因此，这些菌株在耐药性和菌落形态方面均具有一定的代表性，而大环内酯类抗菌药物对其作用效应需要分别鉴定。

1.5 BF粘附性测定[9] 按照前述方法向24孔板中加入菌液、培养基和微孔滤膜，然后分别加入终浓度为1/16 MIC、1/4 MIC AZM(ATCC 27853：2、8 μg/mL；PA1：2、8 μg/mL；PA2：4、16 μg/mL；PA3：4、16 μg/mL)或1/16 MIC、1/4 MIC CLR(ATCC 27853：4、16 μg/mL；PA1：16、64 μg/mL；PA2：8、32 μg/mL；PA3：8、32 μg/mL)，设4个复孔，以不加抗菌药物的培养物为对照，37 ℃培养24 h。灭菌生理盐水漂洗去除表面浮游菌后，甲醛固定，结晶紫染色，体积分数为95%的乙醇脱色，吸取脱色后溶液100 μL至96孔板内，用酶联仪测定波长595 nm处的A值，以此代表铜绿假单胞菌BF粘附性的高低。

通过细菌BF体外模型建立和快速银染法鉴定，4株铜绿假单胞菌均可以在医用微孔滤膜表面形成稳定致密的BF。一般认为黏液型铜绿假单胞菌为BF形成阳性菌株，本研究中2株非黏液型临床分离菌株也形成了BF。有研究显示大多数铜绿假单胞菌临床分离株具有较强的BF形成能力[11]，黏液型和非黏液型铜绿假单胞菌均能够形成BF。但是两者形成BF形状存在差别，并且其与藻酸盐合成相关基因的表达可能有密切联系[12]。此外，本研究结果表明，1/16 MIC、1/4 MIC的AZM以及1/16 MIC、1/4 MIC的CLR均可显著降低BF粘附性。与单独使用1 MIC的CAZ、CIP和GEN相比，各抗菌药物联合1/16 MIC的AZM或1/16 MIC的CLR均可分别降低以上4株菌生物膜中的活菌数量。

大环内酯类药物抗菌谱较窄，CLR和AZM分别是其中具有代表性的十四元环和十五元环抗菌药物。本研究结果显示二者对铜绿假单胞菌BF的作用可分为2个方面。首先，二者可有效抑制铜绿假单胞菌BF的形成。近些年有研究报道大环内酯类药物具有抑制BF的形成和粘附作用，例如简丽娟等[13]分别使用铜绿假单胞菌野生株PAO1、PAO1-lasR/rhlR双缺陷株和标准菌株ATCC 27853建立BF体外模型，并与2 μg/mL AZM共同培养3、7 d后用扫描显微镜观察，发现AZM不仅延缓BF的形成，还可以抑制BF的形成。另一方面，本研究结果显示CLR和AZM分别与CAZ、CIP或GEN联合应用有协同作用，与部分研究报道相似[14-15]。例如，Wang等[14]研究发现，共同使用AZM和CAZ作用于铜绿假单胞菌，比单独使用两者之一有更低的MIC值，并且对细菌定植的抑制效果更强。Saini等[15]联合应用AZM与CIP浸渍导尿管并作为其涂层，可有效防止导尿管中的细菌定植及BF形成等过程，并可防止由铜绿假单胞菌引起的尿管伴随性尿路感染。上述研究表明对以CLR和AZM为代表的大环内酯类抗菌药物作用于铜绿假单胞菌的效果及机理进行研究，可以为建立预防和治疗铜绿假单胞菌感染的方法提供帮助。

品管圈人员还组织了医护人员临床营养知识调查。调查发现，目前医护人员营养知识掌握不够，尤其是临床营养知识不足。

大环内酯类抗菌药物作用于铜绿假单胞菌BF的机理目前尚无统一的结论。AZM和CLR虽不可直接杀灭铜绿假单胞菌，但作用于细菌BF形成初期，均可明显抑制BF的形成和对微孔滤膜的粘附。对于产生这一现象的原因有不同的解释。对于AZM的作用，有研究认为由于减少铜绿假单胞菌毒力因子的合成，或是由于通过改变细胞膜的透过性而影响信号分子3-oxo-C12-HSL的流量[14]。也有研究报道AZM可以通过降低铜绿假单胞菌依赖于4号菌毛的蹭行运动能力来抑制其粘附性和形成BF的能力[16]。CLR同样被证实能够减少细菌毒力因子的合成及抑制细菌的蹭行运动和迁移运动能力[17]。对于已经形成的稳定BF，在CAZ、CIP和GEN分别联合AZM或CLR作用后，显示出比前者单独应用更强大的杀菌作用，可能是由于AZM和CLR可破坏成熟BF的屏障作用，帮助其他抗菌药物渗透到BF内部，从而起到有效杀灭细菌的作用。研究显示CLR不仅可以破坏铜绿假单胞菌的外被多糖，还可以抑制多糖的从头合成[17]。此外，也有报道在协同作用条件下，菌株的蹭行运动能力和毒力因子鼠李糖脂的合成量会进一步降低[14]。

综上所述，本研究选取的4种铜绿假单胞菌经培养均可以形成BF，且AZM和CLR也均显示出对上述4种菌株BF的粘附抑制和协同杀菌作用，说明AZM和CLR作用于临床铜绿假单胞菌感染可以显示出一定效用。另外，本研究结果还显示AZM的协同杀菌作用在一定程度上优于CLR，但其作用机制及临床应用效果还有待于进一步研究。

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