农药对稻田共生黑斑蛙毒性影响研究

0 引言

随着农业现代化和集约化的不断发展，农药在防治农作物病虫害，保证农作物正常生长等方面起到重要作用。随着农产品需求量的不断增加，农业种植实现规模化集约化，农业生产中各种农药的施用量也在不断增加。农药在提高农作物产量和质量的同时，也被列为环境中常见的三大类污染物之一。

农药作为一种化学性环境污染物，是一种有毒的化学药品。近几年，农村使用的各种杀虫剂、杀菌剂和除草剂等农药一般是高效低毒种类，虽减轻了对环境的部分污染，但由于大面积使用各种农药，由于产品剂型、施用方法及超量使用等原因，农药对环境带来了严重的负面效应，导致近些年黑斑蛙种群数目急剧减少以及畸形蛙大量出现。原因可能是其蝌蚪在变态前有外鳃暴露于水环境、而成蛙皮肤裸露缺少保护结构致使具有较高的渗透性，水环境中的污染物会较快地在其体内大量富集，从而对两栖动物黑斑蛙的发育、生长构成了一定的危害。随着人们生活水平的提高以及对绿色安全食品的呼唤，生物农药在当前农药市场中倍受青睐。

黑斑侧褶蛙（Rana nigronaculata），俗称青蛙、田鸡，属两栖纲、无尾目、蛙科、蛙属，野生黑斑侧褶蛙为国家保护的重点野生动物，以稻田、水塘等水域为繁殖、生存和捕食活动的主要场所。稻田施药及水塘等水域的污染，都会增加其接触有害毒物的机会并受到伤害。黑斑蛙是我国农田中常见的两栖动物之一，在农田生态系统中具有重要的地位，黑斑蛙能吞食大量昆虫，一昼夜捕虫可达70余只，是消灭田间害虫的有益动物，是农业害虫生物防治的重要成员之一。因为幼体蝌蚪生活在水中以及成蛙皮肤裸露和高渗透性，农业污染物极易在其体内富集和放大，农药残留对水域的污染会直接影响到它们的生长、生殖、发育、内分泌的调节、神经和血液循环等，导致黑斑蛙生物资源迅速衰竭。

1 农药污染问题

目前农药问题主要是使用不合理，表现在：第一，大多数农药直接喷洒于农作物表面，其中仅有10%左右药剂被吸收，而大部分农药则随大气流动或雨水流失。大气中的农药分子与人体皮肤和眼睛黏膜等接触，或通过呼吸道吸入可引起疾病，严重的会导致急性中毒、慢性中毒，甚至致癌；第二，农药喷施的粗颗粒、粉粒落入土壤中，这些农药在土壤中的分解缓慢，而数量又在不断增加，导致土壤物理化学性质的改变，进而直接影响作物的生长；第三，土壤中农药残留量及衍生物含量增加，对土壤中有益的动物及微生物具有明显的危害，降低了土壤的生物活性，破坏了土壤的生态环境；第四，土壤中的农药被灌溉水、雨水冲刷到水渠中，污染水源，影响黑斑蛙生长发育。

卢祥云等（2002）研究表明，农村中所使用的农药对黑斑蛙胚胎和蝌蚪的毒性大小依次为使它隆、多效唑、多菌灵、异丙隆、甲胺磷，对黑斑蛙胚胎和蝌蚪的致死浓度明显高于其安全浓度，如果按规定正确使用这些农药，对两栖类动物生长发育影响不大。但如果农药使用不当或用后药剂处理工作不完善，如废药倒在田间沟渠中，就可能影响两栖类动物生长发育。

2 农药对黑斑蛙的毒性效应

2.1 农药对黑斑蛙蝌蚪生长发育时期影响

黑斑蛙个体发育过程中，农药对其有显著影响。首先，农药对蝌蚪有致死效应，但是致死率会受发育期的影响。通常孵化期、开口期对农药刺激的敏感性较强。

总之，作者的研究有一定的贡献但是非常有限，如果想要了解更多在英留学生的网络购物行为，还需要进一步深入研究。那些想要吸引更多留学生消费者的网络零售商和电商公司应该对在英留学生的消费行为和特点进行深入的研究和探析。

黄敏毅等(2011b)报道三氯杀螨醇降低雄性黑斑蛙活力，并具有神经毒性，进一步研究发现三氯杀螨醇降低黑斑蛙精子活力，减少精子总数，增加精子畸形率，影响黑斑蛙种群发展。

4.深化科技体制改革，加快形成有利于科技进步和自主创新的体制机制。一是要确立企业技术创新的主体地位。切实增强企业技术创新的动力和活力，引导企业成为技术创新投入和研究开发活动的主体。支持企业建立和完善研究开发机构，鼓励企业以各种形式参与实施国家科技计划。建立为中小企业开展技术创新服务的平台。二是完善科技成果转化机制。深化地方科技体制改革，促进科研力量和产业力量的有机结合，加速科技成果产业化。大力支持科技中介机构的发展。

2.2 农药对黑斑蛙蝌蚪组织结构影响

鳃是蝌蚪与外界进行气体交换的器官，由于鳃丝及其内毛细血管的结构相当简单，故其对水环境中毒物具有极强的敏感性。农药可导致蝌蚪鳃结构损伤。

肝脏是蝌蚪重要的解毒器官，在农药作用下，蝌蚪肝脏结构与功能受损。主要表现在：肝脏外观颜色变浅、肝细胞排列紧密以及脂滴及糖原堆积等。

农药可通过蝌蚪皮肤的渗透，作用于分化中的生殖原基，导致蝌蚪性腺发育缺陷，严重影响黑斑蛙个体的正常繁殖功能，同时也导致畸形个体的增长。

2.3 农药对黑斑蛙抗氧化系统影响

黑斑蛙在长期进化过程中，形成了一套完整的抗氧化系统，用于清除体内多余的活性氧。抗氧化酶作为抗氧化系统的重要组成，在诊断环境污染问题中发挥着重要的生物指示作用。黑斑蛙体内的抗氧化酶主要包括：超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、谷胱甘肽过氧化物（GSH-PX）和谷胱甘肽（GSH）等。当生物体遭受氧化胁迫时，其抗氧化酶就会被诱导或抑制。

2.4 农药对黑斑蛙遗传物质的影响

农药对无尾两栖类蝌蚪的遗传毒性已被大量实验证实。由于蝌蚪的红细胞较大且易于观察，因此蝌蚪红细胞微核被广泛用于水环境中农药遗传毒性的检测。微核是由染色体断裂产生的无着丝粒断片形成的或是由于纺锤丝断裂造成的一条或一组染色体而滞留在胞质中形成。微核率能快速、可靠地反映机体的染色体损伤和DNA复制紊乱等异常情况，在评价蓄积性毒物对遗传物质的损害程度和毒理效应方面具有很高的实用价值，而红细胞微核率是目前较为流行的致癌剂和诱变剂检测的遗传毒理学指标之一。

Feng等（2004）采用微核试验及彗星试验研究了两种新型杀虫剂（Imidaeloprid和RH-5849）对黑斑蛙蝌蚪及成体血细胞的遗传毒性，发现当Imidaeloprid和RH-5849的浓度分别为0.05mg/L和5mg/L时，对黑斑蛙成体红细胞DNA就有极显著的损伤作用，且具有明显的剂量-效应关系。叶圣涛（2013）通过单细胞凝胶电泳技术(DNA损伤分析，也称彗星分析)和微核率实验来检测五种稻田内常用农药包括噻嗪酮、吡蚜酮、毗虫啉、乙草胺、丁草胺对黑斑蛙红细胞的遗传毒性。结果表明稻田蛙类红细胞DNA损伤程度与五种常用农药浓度间的关系多数呈现剂量效应。

3 杀虫剂对黑斑蛙毒性影响

农业生产上采用杀虫剂防治病虫害发生的同时，往往会对土壤以及水体等自然环境造成污染，直接或间接地对农田里的生物以及人类造成危害。

一般对于红豆杉种子的收集时间都是在9月下旬到10月上旬之间，这时红豆杉的果实成熟后，要及时的将这些果实进行采摘。当种子成熟后为了能够保证选择的树种质量，需要选择一些生长健壮、没有病虫害的红豆杉母株进行树种的采集，并且将采集的红豆杉果实进行洗搓，帮助去除果实表面的红色假种皮，然后用水进行冲洗干净，并浸泡在高锰酸钾溶液中进行消毒，最终将其用湿沙进行储藏，等待播种的选用。因为红豆杉的种子成熟期较长，并且具有双休眠特性，因此需要经过两冬一夏方可萌发。

3.1 阿维菌素

阿维菌素是土壤微生物阿维链霉菌发酵产生的环内酯二糖苷类化合物，对蔬菜、果树、棉花、水稻等多种作物的相关害虫有良好的防治效果，是当前农业害虫综合防治中理想的生物农药。按照世界卫生组织（WHO）五级分级标准，阿维菌素属于剧毒化合物，在动物组织中残效时间长，具有神经和发育毒性，对神经系统、肝脏等有明显的损伤作用，若经动物性食品残留进入人体便会对人的健康产生不良影响。

王丹丹等（2013）急性毒性实验结果表明，阿维菌素对黑斑侧褶蛙24h、48h、72h、96h的LC50分别为:0.3227 mg/L、0.0966 mg/L、0.0623 mg/L、0.0432 mg/L，其对黑斑侧褶蛙的安全浓度(SC)为0.004316 mg/L。亚急性毒性实验结果表明，暴露期间，随着浓度的升高，毒害作用越大，其对黑斑侧褶蛙肝脏组织损害也越大，而经恢复期后，各实验组肝脏组织受损程度较暴露期都有降低。红细胞核异常及微核诱导实验结果表明，微核和核异常现象与阿维菌素浓度的相关性有一定的联系。

3.2 吡虫啉

丁草胺是一类酰胺类除草剂，因其具有高效、低毒、价廉等特点而被广泛地应用于水稻田中。除草剂的应用极大地降低了劳动强度，直接或间接地提高了农业生产水平。由于除草剂多为有一定残效期的化合物，且可在生物体内富集，因此其对生态环境的影响已引起世界各国的重视。赵艳等（2010）报道丁草胺对黑斑蛙胚后发育的毒性作用明显强于胚胎发育，较正常稻田使用浓度低得多时丁草胺就对黑斑蛙胚后发育具有明显的致死、致畸和滞育效应。

王坤英等（2007）运用体视学方法和单细胞凝胶电泳技术，分析不同浓度噻嗪酮溶液对黑斑蛙胚胎发育和蝌蚪生长的影响，结果表明，低浓度噻嗪酮（125mg/L）的使用对两栖动物蝌蚪的生长、发育和外周血细胞DNA是相对安全的，不会对水生生物的生存环境造成危害，但高浓度噻嗪酮(500～1000 mg/L)的使用会对两栖动物的生存环境造成一定程度的危害。

3.3 噻嗪酮

由于生油岩的成烃增压作用，在沙三下早期最大湖泛面之下地层中形成了异常高压带，亦称高压流体封存箱，地震和钻井资料也揭示了这一点［16］。箱内压力系数高达1.72～1.73，而超压伴有微裂缝产生［5］。可见沙三下储层压力系数如此之高，足以形成足够的微裂缝。同时由于成烃增压后对岩石的解压实作用，还可使岩石产生约3% 岩石体积的裂缝空间［17］。根据电镜扫描、岩心观察及岩屑样品分析发现，该储层中微裂缝及高角度裂缝发育。因此高压流体封存箱内具有较好的储集物性，同时也具有较好的含油性。目前地层异常高压带的识别与分布，除钻井外主要利用声波测井和地震层速度谱分析的方法来研究和预测［16］。

全李涛等（2006）报道指出吡虫啉对蝌蚪急性毒性的LC50-48 h值为218.8 mg L，比该农药田间推荐使用的浓度100～150 mg L高。微核试验和彗星试验结果则显示吡虫啉在一定的剂量范围内能引起黑斑蛙微核率的升高和具有DNA损伤能力，具遗传毒性。吡虫啉能在蔬菜、水稻、水果上残留1～2个月的时间，残留水平大约在0.01～0.6 mg/kg的范围，从而可能通过食物链而对人体健康存在潜在风险。

依据公式(2)估计产业创新速度对创新效益贡献的弹性，经检验采用固定效应模型，结果见表1。结果显示，所有变量均通过了统计检验，模型拥有较高的拟合优度。其中，研发经费对创新效益的贡献最大，弹性系数为0.494，产业创新速度对创新效益的弹性系数次之，为0.141，而研发人员折合全时当量的弹性系数为－0.044，其中原因是多方面的，比如该指标无法区分不同水平科技人员的贡献，研发人员存在绩效不高问题等。

3.4 三氯杀螨醇

三氯杀螨醇，是以滴滴涕为原料合成的一种有机氯杀螨剂，在现代农牧业生产中广泛使用，对环境可造成较大污染，杀螨谱广，活性高，对成、若螨和卵均有很强的毒杀作用，田间推荐使用浓度为20%的乳液，稀释800～1000倍，约20～25mg/L，三氯杀螨醇可通过各种途径排放进入水中，从而在环境中残留，对农牧业区动物和人具有较强的毒性、雌激素效应以及致畸、致癌、致突变影响。

黄敏毅等（2011a）观测三氯杀螨醇对黑斑蛙蝌蚪急性毒性反应发现，其48h的LC50为13.82mg/L，属于低毒性农药，但田间推荐使用浓度为20～25mg/L，对黑斑蛙蝌蚪仍具有一定的毒性效应。而且，实验显示在相同浓度下，随着时间的增加，蝌蚪的死亡率逐渐增加，说明三氯杀螨醇对黑斑蛙蝌蚪的毒性效应具有蓄积作用。

农药对蝌蚪具有显著的致畸效应。如部分农药可引起蝌蚪代谢受阻导致其体内的渗透压改变，引起胚体水肿，表现在：蝌蚪尾部和躯体出现明显扭曲，腹部膨大呈透明状，四肢发育不健全；由于蝌蚪体壁结构简单，而其神经系统及脊索（柱）又位于体背部的表层，故极易受到农药成分的浸蚀，进而引起神经系统及脊索（柱）发育的异常，导致蝌蚪出现扭曲。农药对蝌蚪的体重、体长也有显著影响。

阿花宣布景光厂倒闭的时候，几个负责检查的妹仔哭了。最后的晚餐上，阿花泣不成声。我和十来个男孩，喝了个不醉不归。

4 除草剂对黑斑蛙毒性影响

在各种形式的污染中，水体污染危害最大、最广泛。造成水资源严重污染的元凶之一是化学农药在农田的大量使用，其中除草剂的施用量国内外都已超过杀虫剂而跃居农药施用量之首。

以上这些并不是我的无端臆想，毕竟一家经验丰富的好莱坞电影道具公司就曾公开表示，上世纪70～90年代的经典沃尔沃车型是他们凸显影视剧中“好好先生”（Mr Nice Guy）形象的惯用道具。

明代大学士的排名非常严格，且遵循一定的规则。这是前代以及随后的清朝所没有的。唐、五代、宋时期的翰林学士排名主要看资历。清代的大学士排名也主要看资历，领班大学士则常由皇帝指定。清代的大学士自身品级极高，不需要加官来提高身份。

4.1 丁草胺

吡虫啉又名蚜虱净，是我国新研制的农药品种，系一种硝基亚甲基内吸杀虫剂。它对生物体的作用与烟碱相似，能与乙酰胆碱受体结合，但不被乙酰胆碱酯酶分解，这使生物体神经系统受过度刺激而导致神经传导受阻，最终导致生物体死亡，用于防治刺吸式口器害虫，如蚜虫、叶蝉、飞虱等及其抗性品系。它广泛应用于水稻、小麦、玉米、马铃薯、甜菜、棉花、蔬菜等的害虫防治。根据现行的农药毒性分级标准，吡虫啉对黑斑蛙蝌蚪LC50-48h值165.04mg/L，大于10mg/L，因此吡虫啉对黑斑蛙蝌蚪属于低毒农药。

噻嗪酮，商品名扑虱灵，用于稻飞虱等防治，是一种低毒、高效的内吸型选择性杀虫剂，以触杀和胃毒方式防治病虫害的发生，作用机制是通过抑制昆虫几丁质的合成和干扰昆虫的新陈代谢，使若虫蜕皮致畸而缓慢死亡。由于噻嗪酮在使用时要求存在一定的水层，在水溶液中又不易分解，加之蛙及其蝌蚪的皮肤通透性高，故水体中的噻嗪酮易于进入体内。此外，蛙吞食染毒昆虫后，噻嗪酮也可随之进入体内富集。

4.2 除草通

除草通又名施田补，瑞士氰胺（国际）公司制造，属二硝基苯胺类。易溶于氯代烃及芳香烃类溶剂，性质较稳定，不易光解。除草通是适用于叶菜类蔬菜、玉米、棉花等多种旱田作物的选择性除草剂，其水溶性不高。吴美仙等研究表明，核异常现象与除草剂浓度的相关性有一定的范围；随着时间的推移，黑斑蛙红细胞核异常率呈现先上升后下降的规律性变化。实验结果表明，尽管其水溶性不高，但作为一种旱田除草剂仍能引起蛙类红细胞核的异常，说明除草通对两栖类红细胞具有明显的遗传毒性，诱导正常细胞核异常。充分显示旱田除草剂对环境的污染作用。

4.3 阿特拉津

阿特拉津是一种在世界范围内广泛使用的中等偏低毒性除草剂，国外使用该除草剂已有50年历史，曾被认为是生态安全的除草剂，由于使用量大、残留期长，农田施用后随着地表径流、淋溶、沉降等多种途径进入地表水和地下水，它在水中能抵抗自然的递降分解作用，从而对水生态系统和饮用水源构成威胁。对动物的生殖功能有极大的影响，被世界野生动物基金会（WWF）列为环境荷尔蒙（内分泌干扰剂）的可疑物质，有扰乱内分泌的作用，是人类潜在的致癌物

曹慧（2012）采用半静态亚慢性毒理实验法，研究了阿特拉津对黑斑侧褶蛙血液免疫因子(血清碱性磷酸酶、血清总蛋白、血清IgM球蛋白)、总淋巴细胞数和淋巴细胞活性的影响，阿特拉津急性毒性实验表明，一定浓度的阿特拉津对黑斑侧褶蛙能产生毒性，对黑斑侧褶蛙96h LC为49.25mg/L。在不同浓度阿特拉津暴露下，黑斑侧褶蛙淋巴细胞DNA损伤率、尾长、尾相均随染毒剂量的增加而呈上升趋势，并存在剂量-效应关系。

5 农药添加剂对黑斑蛙毒性影响

5.1 壬基酚

壬基酚（Nonylphenol，NP）是一种多用途的非离子表面活性剂，是烷基酚类化合物中有代表性的环境污染物，被广泛应用于农药乳化剂等方面。由于高度疏水性，使其易于在水体下的淤泥中浓集，而在厌氧环境下相当稳定，不易降解。壬基酚可经生物蓄积作用进入土壤、食品和饮用水中，并可通过生物链进入动物和人体，影响动物和人类的神经、生殖、内分泌、免疫及心血管等系统的功能。

黄敏毅等（2009a）用 200、400和 600 mg/kg壬基酚分别对黑斑蛙腹部淋巴囊注射染毒，研究壬基酚对黑斑蛙血浆渗透压以及血细胞的影响，结果显示壬基酚对黑斑蛙的血浆渗透压的影响呈浓度-时间-效应关系，壬基酚时间的延长和处理浓度的增大，血液中血细胞膨大，血细胞核受损程度严重。黄敏毅等（2009b）探讨壬基酚对黑斑蛙神经活动的毒性效应，研究结果显示，壬基酚作用下，黑斑蛙神经活动对刺激反应的灵敏性降低，动作电位的产生及传导受到一定程度的抑制和阻碍。黄敏毅等（2010）研究不同剂量壬基酚对雄性黑斑蛙成体的精子和精巢的影响，结果表明，与对照组相比，随着壬基酚浓度的升高，染毒组黑斑蛙的精巢系数下降，精子数减少，精子畸形率明显增大，精巢显微结构也发生变化，说明壬基酚对雄性黑斑蛙生殖系统具有毒性效应。

为探索钻井废弃泥浆用于路基路面材料可行性，取了5口井的样品，并对其主要污染指标进行了分析，分析结果见表1。5个钻井废泥浆样品，其主要污染情况不同，其中样品1号，污染指标主要是色度、COD超标；其他四个样品除了色度、COD超标外，重金属六价铬也超标。5个样品中样品3号污染最严重，处理难度更大一些。因此，选择3号样品作为试验对象。

5.2 双酚A

双酚A（BPA）是重要的有机化工原料，是苯酚和丙酮的重要衍生物，可用来合成环氧树脂等重要原料，也可用于农药添加剂，目前报道具有广泛的生物毒性和人体暴露风险。而其替代品双酚S和双酚F结构与其类似，具有碳原子或者硫原子连接的2个酚状结构。李圆圆等（2015）比较了三种双酚类产品对黑斑蛙胚胎和蝌蚪的毒性，依据《化学农药环境安全评价准则》的毒性分级标准，判定BPA和BPF的毒性等级为中毒，BPS的毒性等级为低毒。

5.3 异噻唑啉酮衍生类化合物

异噻唑啉酮衍生类化合物因具有抗菌能力强、药效持久、对环境安全以及抗菌谱宽广等优良性能，在工业、农业、医药等行业广泛使用。1，2-苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)和甲基异噻唑啉酮(MIT)是目前使用最多的两种异噻唑啉酮类杀菌剂，半衰期一个星期，且由于长期排放至水体，对环境的污染不容忽视。付旭锋等（2014）研究发现，BIT和MIT对黑斑蛙胚胎的96 h半致死浓度分别为2.99mg/L和5.30mg/L，对蝌蚪的则分别为6.44mg/L和7.58mg/L，根据《化学农药环境安全评价准则报批稿》中两栖动物蝌蚪急性毒性的分级标准，判定BIT和MIT的毒性等级为中等。考虑到安全系数和长期暴露的风险，其毒性不容忽视。

6 总结

农药对黑斑蛙的影响目前研究较为深入，其对蝌蚪活动行为、胚后发育、组织结构、抗氧化系统、遗传物质等造成的损伤已有充分的实验依据，但是尽快开展众多新型农药对黑斑蛙的毒性影响评价，更好的开展黑斑蛙共生稻田环境评价与黑斑蛙保护增殖工作。

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