β1-肾上腺素受体自身抗体通过促进肝细胞凋亡参与小鼠肝损伤

慢性肝损伤是全球范围内高致病率、高病死率的肝脏疾病，发病原因主要包括病毒感染、酒精性或非酒精性肝脏疾病、脂质代谢异常、 药物损伤及自身免疫性疾病[1]等，其中交感神经系统的过度激活在肝损伤过程中发挥的作用越来越引起人们的关注[2]。已有的研究发现，在小鼠肝纤维化过程中有β1-肾上腺素受体(β1-AR)的过度表达，而给予β肾上腺素受体阻滞剂可以明显改善肝脏纤维化，这提示β1-AR的过度激活参与了肝损伤的发生发展。近年来发现一种针对于β1-肾上腺素受体细胞外第二环(β1-AR-ECII)的自身抗体(β1-AA)，其广泛存在于扩张性心肌病、心律失常等心血管疾病中，可以通过持续激活β1-AR而发挥正性肌力、正性传导和升高细胞内钙离子的受体激动剂样作用。已知肝细胞表面有β1-AR的表达[3]，那么循环血液中的β1-AA是否会通过作用于肝脏表面的β1-AR而对肝脏产生影响尚不得而知。

因此，本研究的目的主要是探讨β1-AA对肝脏结构和功能的影响及作用机制，为临床β1-AA阳性患者肝功能损伤的治疗提供新的思路和研究基础。

能值为某种流动或贮存的能量所包含的另一能量的数量，能克服传统经济学与能量分析方法无法在统一尺度上对不同类别和等级的资源进行量化计算的缺陷，能以同一种能量类别单位来衡量社会经济系统中不同类别的物质。由于农业生产投入产出要素的多样性，本文的主要研究理论与方法为能值分析。

北方冬日有暖气的室内较为干燥，孕妈妈喜欢打开加湿器。加湿器可以使用，但要注意卫生，最好每周清洗一次，这是因为水中细菌容易繁殖。使用加湿器时，并非湿度越高越好，最好控制在40%～60%，湿度高对身体也不好，容易引起胸闷、痰多、呼吸困难等症状以及各种呼吸系统疾病。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性BALB/c小鼠，8周龄，体质量(20±2)g[首都医科大学动物中心，实验动物许可证号：SCXK(京)2012-0001]；15只SPF级SD大鼠的乳鼠，0～3 d (北京维通利华实验动物技术有限公司)；正常肝细胞系QSG7701细胞(中国医学科学院基础研究所细胞中心)。

β1-AA与IgG具有相同的蛋白条带，重链分子质量55 ku，轻链25 ku(图1A)；该单克隆抗体可以增加乳鼠心肌细胞跳动频率(P<0.01)，β1肾上腺素受体阻滞剂metoprolol可以部分逆转这一效应(图1B)；在β1-AA被动免疫小鼠第4 周，外周血清β1-AA浓度明显上升(P<0.05)，随后，被动免疫组小鼠血清中β1-AA浓度相对于正常对照组都明显升高，提示被动免疫小鼠模型建立成功(图1C)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理：以5 μg/g的β1-AA进行小鼠腹腔注射，每2 周给药1次，连续给药20 周，同期设置IgG阴性对照组。采用本实验室改良的酶联免疫吸附法(ELISA)动态监测血清中1-AA的含量[5]。

1.2.2 乳鼠心肌细胞跳动频率的检测：将提取的心肌细胞[6]接种于96孔板，培养2～3 d，实验分组为阴性IgG组、β1-AA组(10-7mol/L)、β1-AA(10-7mol/L)+ β1-AR阻断剂metoprolol组(3×10-7mol/L)和单独的metoprolol组(3×10-7mol/L)；加入阻断剂1 h后再加入β1-AA作用48 h，显微镜下每组观察7～8个培养孔，每个培养孔随机计数5～8个视野，每个视野每次计数30 s，最后计数分离的单个细胞1 min内同步收缩的次数，验证β1-AA的生物活性。

1.2.3 BALB/c小鼠血清中AST、ALT、GLB和ALB(谷草转氨酶、谷丙转氨酶、球蛋白和白蛋白)水平的检测：通过鼠尾静脉采血收集正常对照组和β1-AA被动免疫组小鼠4、8和12周的血清，委托北京北方生物技术研究所用速率法检测血清中AST、ALT、GLB和ALB的浓度。

几何模型取对称半结构，地基宽度取60 m，加宽前路面结构层厚度为79 cm，加宽后路面结构层厚度为85 cm。地基处理措施：采用复合地基桩网结构处理，桩体采用三角形布置，桩长15.0 m，桩间距2.0 m，桩径0.4 m。处理范围：原有路基边坡开挖的最后一级台阶内缘至加宽后路基坡角处；填筑路基时在最下一级台阶和路床底部(位于地表以上4.0 m左右处)分别铺设一层土工格栅，格栅长度8 m。

1.2.4 小鼠肝脏门静脉流速、肝静脉流速和肝脏直径的检测：将对照组和β1-AA被动免疫组小鼠在0、8周时，分别仰卧固定，于1.5%体积浓度的异氟烷吸入麻醉下，剪去腹部鼠毛后涂以耦合剂，用高频线阵探头 (75 MHz)探测肝脏大小、回声状况、肝静脉和门静脉血管内径，所有数据均测量3次并取其平均值。

纳米粒子3的合成。将5.000 g气相纳米二氧化硅(原生粒径12 nm)与200 mL乙醇的悬浊液超声处理12 min，然后转移至三口烧瓶中，氮气保护下加入KH550(1.500 g，6.787 mmol)和水(3.00 mL)，混合物在90℃机械搅拌下回流反应4 h。反应结束以后抽滤，以无水乙醇100 mL洗涤4次，滤饼真空干燥后得白色固体3。

1.2.5 Tunel染色检测肝细胞凋亡：肝组织用10%甲醛固定，分级乙醇(85%、95%和100%)脱水。在二甲苯中渗透后，石蜡包埋。将石蜡块切成4 μm切片，按试剂盒说明书所述进行Tunel染色，每张载玻片选取5～8个视野，计算凋亡细胞核的百分比,评估细胞凋亡指数。

[1] Garioud A, Cadranel JF.Autoimmune hepatitis [J]. Rev Prat, 2015, 65: 163- 169.

1.2.6 AnnexinV/PI检测肝细胞凋亡：将QSG7701细胞以(1～5)×105/孔接种到6孔板，过夜，分别设置阴性IgG组(10-7 mol/L)、β1-AA组(10-7mol/L)和β1-AA+metoprolol(3×10-7mol/L)组，作用24 h，根据说明书进行操作，利用流式细胞仪进行检测。

1.2.7 肝细胞caspase 3活性的检测：将QSG7701细胞以1×105/孔接种到12孔板，待其增殖良好，分别设置阴性IgG组(10-7 mol/L)、不同浓度的β1-AA组(10-6、10-7和10-8 mol/L)及β1-AA+metoprolol(3×10-7 mol/L)组，作用24 h，按照说明书进行操作，最后利用荧光酶标仪检测荧光度值(Ex: 400 nm，Em 508 nm)。

1.3 统计学分析

采用 SPSS 19.0 统计软件对数据进行管理和分析，以均数±标准差对数据进行描述，对乳鼠心肌细胞跳动实验进行正态性和方差齐性检验，应用t检验或 Bonferroni post hoc的单因素方差分析。

2 结果

2.1 成功制备β1-AA单克隆抗体，并建立β1-AA被动免疫小鼠模型

1.1.2 主要试剂：具有活性的单克隆抗体β1-AA[4]、胰蛋白酶1∶250 (trypsin powder，porcine 1∶250，Sigma-Aldrich公司)；Ⅱ型胶原酶(coll-agenase type 2，Worthington公司)；Tunel染色试剂盒(Roche公司)；annexin V/PI凋亡试剂盒(Invitrogen公司)；caspase 3活性检测试剂盒(Biomol公司)；美托洛尔(metoprolol tar-trate，Abcam公司)；2,2-azino-di (3-ethylbenzothiazoline) sulphonic acid (ABTS)-H2O2 (Roche公司)。

2.2 β1-AA长期被动免疫导致小鼠肝损伤

为了明确β1-AA对肝脏的影响，本研究首先构建了一种针对β1-AR细胞外第二环，并且与患者血清中的β1-AA具有相同生物学效应的单克隆抗体，即β1-AA，排除了其他非特异性抗体的干扰。另外，采用β1-AA长期被动免疫小鼠模型能够更好的模拟临床疾病，并且有效的排除了抗原肽段的影响。

2.3 β1-AA长期被动免疫致小鼠肝脏门静脉流速和肝静脉流速降低

β1-AA长期被动免疫小鼠第8 周时，肝静脉血流速(HPV)和门静脉流速(MPV)明显降低(表1)。

2.4 β1-AA长期被动免疫过程中小鼠肝细胞发生凋亡

β1-AA免疫第8 周肝组织凋亡的肝细胞核百分比为8.00%±0.02%，显著高于对照组的2.30%±0.03%(图3)。

英国现行的退休年龄主要分为国家养老金退休年龄与职业养老金退休年龄两部分，均呈逐年增长的趋势。英国政府于2006年颁发了明确规定英国国家法律规定的退休年龄是65周岁的《就业平等（年龄）条例》[1]。2007年至2008年间，英国政府通过向广大英国民众征求意见以及充分倾听英国民众的民意，决定从2010年4月6日开始，实行提高退休年龄的“两步走”战略。第一步分阶段上调女性退休年龄，以期在2020年实现男女统一的65周岁退休年龄。第二步将全社会的退休年龄提升至68周岁[2]。至今英国政府还在根据自身国情不断调整着本国的退休年龄，以期可以制定出最优化的退休方案。

2.5 β1-AA通过β1-肾上腺素受体促进肝细胞系QSG7701发生凋亡

[2] 刘娜,张晓岚，梁传栋，等.肝脏纤维化过程中去甲肾上腺素各受体亚型表达的动态变化[J]. 中华肝脏杂志, 2009, 17:653- 656.

 

A.β1-AA had the same molecule mass as commercial mice IgG tested by Coomassie brilliant blue staining; B.β1-AA that was synthesised had the biological activity; C.the serum value of β1-AA in the passive immunization model was higher than the negative IgG group; *P<0.05， **P<0.01 compared with IgG group

图1 具有生物活性的β1-AA单克隆抗体及β1-AA被动免疫模型小鼠的鉴定Fig 1 Identification of the biologically active of β1-AA and passive immunization mice model

  

*P<0.05, **P<0.01 compared with IgG group图2 β1-AA被动免疫小鼠过程中肝脏生化学指标的变化Fig 2 Changes of biochemical indexes in liver during the β1-AA passive n=6)

 

表1 小鼠肝脏超声学指标的变化Table 1 Changes of liver ultrasound

  

groupHPV/(mm/s)MPV/(mm/s)hepatictransfer/mmIgG 24.5±2.3 70.0±1.820.0±0.9β1-AA 19.3±1.3* 8.0±2.1**21.0±1.3

HPV.hepatic vein velocity; MPV.portal vein velocity; **P<0.05, *P<0.01 compared with IgG group.

3 讨论

血清ALT水平和AST水平常被用作临床试验肝功能的生物学标志物[10]。当肝脏长期受损时，ALB合成降低[11]。在本研究中，初步得到在被动免疫小鼠第8 周时ALT、AST明显升高，ALB明显下降。提示，β1-AA长期作用会导致肝损伤。肝脏超声结果提示，在β1-AA长期作用下肝静脉和门静脉流速明显下降，而肝脏大小尚无出现明显的变化。肝组织切片、Annexin V/PI染色和肝细胞caspase 3活性检测进一步验证了β1-AA对肝细胞的直接损伤作用，而β1-肾上腺素受体阻滞剂可以部分逆转这一效应，提示β1-AA可能通过β1-肾上腺素受体途径引起肝细胞凋亡，但并不能排除还有其他作用途径存在，比如非β1-肾上腺素受体途径。本研究初步阐明了β1-AA在导致心功能损伤的同时可能通过肝细胞表面的β1-AR致肝细胞凋亡，进而导致肝功能下降，为临床肝损伤发生发展的机制研究提供新的思路和实验基础。

(1)受原有隧道施工质量问题和基坑开挖卸载及偏压作用下，原有结构承载能力存在明显安全隐患。为确保隧道结构稳定和使用安全，需对原有隧道进行必要的加固和补强。

β1-AA免疫组小鼠血清中ALT、AST在被动免疫第8 周时明显升高(P<0.05)，ALB下降(P<0.01)(图2)。

本研究连续选取β1-AA被动免疫小鼠0、4、8和12周为监测点， 动态观察了小鼠肝功能的变化。

由表2可知，随着元明粉用量的增加，染色试样表观深度K/S值呈上升趋势，当元明粉用量超过40 g/L时，这种上升趋势不明显。这是由于元明粉在染液中电离成阴阳离子，阳离子被棉条吸附，从而使永光活性染料阴离子与棉条之间的相互作用力降低，提高染料的上染率，从而使棉条得色深，但元明粉用量过大，会影响染料的溶解。综合考虑，元明粉用量宜选择40 g/L较合适。

  

图3 β1-AA被动免疫过程中小鼠肝细胞的变化Fig 3 Hepatocytes changes during the β1-AA passive immunization

已知β1-AA最早是在扩张性心肌病患者体内发现的，可以结合β1肾上腺素受体细胞外第二环而致受体持续激活，是一种潜在的损伤因子。β1-AA作为机体免疫系统的产物，它可以促进小鼠源性巨噬细胞系RAW264.7细胞分泌TNFα[7]， 而β1-AR的激动剂异丙肾上腺素(ISO)可以抑制LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNFα[8]。 提示，β1-AA可能与β1-AR激动剂效应不同。同时，有文献报道β1-AA可以通过作用于T淋巴细胞增加胰岛素抵抗，进而影响血糖水平[9]。这进一步说明β1-AA和机体的免疫系统密不可分。肝脏是机体免疫反应系统的重要器官之一，β1-AA在导致心功能下降的同时，它对肝功能的影响是怎样的目前并不清楚。本研究发现，β1-AA可能通过作用于肝细胞表面的β1-AR导致肝细胞凋亡，进而引起肝功能受损。

 

A.the apoptosis of hepatocytes induced by β1-AA; B.the caspase- 3 relative activity of hepatocytes induced by different ooncentrative of β1-AA;*P<0.05, **P<0.01 compared with IgG group; #P<0.05 compared with 10-7 β1-AA group; ##P<0.01 compared with β1-AA group

图4 β1-AA对QSG7701细胞凋亡的影响Fig 4 Effect of β1-AA on the apoptosis of QSG7701

参考文献：

新疆医科大学附属中医医院作为新疆规模较大的教学基地之一，已形成临床实习全过程质量管理体系，在该领域积累了不少宝贵的经验。加强实习医师的基本技能操作，科教科对实习生进行入院前岗前培训，抽调全院教师参加培训工作，岗前培训的项目包括：四项基本技能（体格检查、心肺复苏、无菌操作、中医针灸操作）的强化训练。开展临床理论培训：加强实习医师的理论及基本技能掌握，在实习医师入院前[2-5]，科教科制定整个实习期间的培训计划，固定时间进行培训，使实习医师能较系统的掌握临床的基本知识。

Annexin V/PI染色发现β1-AA(10-7mol/L)可以促进正常肝细胞系QSG7701发生凋亡，当给予β1肾上腺素受体阻滞剂metoprolol(3×10-7mol/L)后，可以逆转这一效应(P<0.05)(图4A)，但并不能完全逆转；caspase 3活性检测发现，不同浓度的β1-AA(10-6、10-7及10-8 mol/L) 促进肝细胞caspase 3活性增加，而β1-AR特异性阻断剂metoprolol可以部分逆转此效应(图4B)。

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We thank the Zebrafish Model Animal Facility, Institute of Clinical and Translational Research, Sun Yat-Sen University for providing AB strain zebrafish eggs.

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