血管生成素样蛋白8基因罕见突变与严重高三酰甘油血症

高三酰甘油血症(hypertriglyceridemia，HTG)在中国患病率高达13.1%，严重HTG是高三酰甘油血症相关性急性胰腺炎发病的独立危险因素[1]。如果能够发现HTG的病因，并进行有效干预，对降低急性胰腺炎的发病具有重要意义。HTG的发病受遗传因素影响，严重HTG是由单基因突变所致[2]。

该设计选用STM32F103RCT6作为控制核心，需要调用几个片内外设，Nokia5110显示器需要一组连续的普通GPIO口资源，驱动定时器需要定时器的PWM输出，还需要一个串口USART用来调试。外部晶振采用了8MHz的无源晶振，另外还增加了22pF的补偿电容，作为系统时钟源。STM32F103RCT6的引脚数目能够满足要求。

近年研究表明血管生成素样蛋白 8(angiopoietin-like protein 8，ANGPTL8)参与三酰甘油(triglyceride, TG)代谢[3]：ANGPTL8 重组蛋白刺激3T3-L1细胞，促进TG在细胞内聚积[4]；ANGPTL8-/-小鼠血浆ANGPTL8浓度减低，餐后TG水平降低[3]； 全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)研究发现，白种人和黑种人中ANGPTL8罕见突变使血清 TG水平下降 15%[5]，而ANGPTL8罕见突变在中国人群中尚缺乏研究。

目前，目标基因靶向捕获测序技术已成功地应用于检测血脂异常[6- 7]。本研究对严重HTG患者进行目标基因靶向捕获测序，筛选与TG相关的ANGPTL8突变。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取 2016-2017年就诊于北京安贞医院且临床诊断为严重HTG血症的患者43例。所有患者签署知情同意书。详细记录患者年龄、民族、性别、质量、籍贯、血压、吸烟、身高和饮酒等情况；采集血脂、血糖、肝肾功能和血常规等多项生化指标检测结果，仔细询问心血管疾病、肝肾疾病等疾病病史以及家族史等情况。所有研究对象均为汉族。本研究得到首都医科大学附属北京安贞医院伦理委员会批准。

1.2.1 培训方法 由专职耳鼻喉科专科护士对实验组的社区护士实施培训，35～50个学时，形式包括:①举办学习班:2010年10月10—15日举办国家级继续教育医学项目《头颈部肿瘤患者护理和新技术》学习班。②临床见习:耳鼻喉科专科病房临床实践，熟悉健康教育方法，练习专科护理操作。③统一考核:制定考核标准，对完成培训的社区护士进行统一的理论、实践操作考核。④喉切除术后患者院外访视模拟示教:由专科护士模拟访视过程，统一访视标准，传授交流沟通技巧。对照组不给予培训，直接考核理论及专科实践。

严重HTG血症患者的入选标准[8]：TG>10.0 mmol/L。

排除标准：排除肝、肾功能障碍、血糖及血钙代谢等异常，排除骨髓瘤、柯兴氏综合征、胰腺炎、甲状腺功能亢进或减低、系统性红斑狼疮和垂体机能减退症等导致继发性血脂异常的疾病，排除使用降脂药物者。

1.2 方法

1.2.1 标基因靶向捕获测序：基因组 DNA 的提取：抽取参与者外周静脉血2～3 mL，放入EDTA抗凝试管，暂时4℃保存。分离外周血白细胞，1.5 mL离心管中存放，然后-80 ℃保存。采用血液样本DNA提取试剂盒(Qiagen公司)，根据说明书操作提取外周血基因组DNA，采用Qubit®2.0(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific公司)进行DNA定量。设计相关基因多重引物对(panel)：在线设计包含9个已知HTG相关基因的多重引物对(https://www.ampliseq.com)，包括基因的外显子区和非翻译区(untranslated region，UTR)，多重引物对包括已知的促进血管内脂肪分解的基因LPL、APOA5、APOA4、APOC3、APOC2、APOE；以及本研究观察的具有抑制脂肪分解作用的血管生成素样蛋白家族基因ANGPTL3、ANGPTL4和ANGPTL8，覆盖率为99%。对于总胆固醇水平大于7.8 mmol/L或者低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol, LDL-C)水平大于4.9 mmol/L的严重HTG患者进行家族性高胆固醇血症相关基因筛查，以排除胆固醇相关基因的干扰。同样在线设计包含4个已知胆固醇相关基因(LDLR、APOB、PCSK9、ABCA1)的多重引物对，包括基因的外显子区和UTR区。DNA文库构建和富集：采用Ion AmpliSeqTM Library Kit 2.0- 96LV (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific公司)、10 ng基因组DNA，Ion XpressTM Barcode Adapters kit、Ion AmpliSeqTM Custom and Community DNA Panels、Agencourt®AMPure® XP Kit，按照说明进行多重PCR扩增，构建基因cDNA文库；扩增后的产物采用Ion PGMTM Hi-QTM OT2 Kit、Dynabeads® MyOneTM Streptavidin C1、Ion 318 Chip Kit 进行富集。目标基因靶向捕获测序：采用Ion PGM HI-Q Seq Kit、Ion PGM Wash 2 Bottle Kit在 Ion PGM测序仪上进行二代测序。在运行结束时，采用Ion Torrent Suite 5.0.2 version对数据进行初步注释。采用人类基因组(hg19)为映射参考基因，校准结果与BAM格式文件(SAM的压缩形式)结合。突变检测及注释：检测到的突变采用Ion Reporter (version5.0)进行注释，每个突变包括突变频率注释(ExAc、ESP6500、G1000、中国人数据库等)及功能预测注释(sift、ppt- 2、Mutation Taster)。

1.2.2 生物信息学分析：测序数据经过质量控制后，将得到的样本突变信息与人类基因突变数据库(HGMD)、外显子组测序项目数据库 (ESP6500)、千人基因组数据库(1 000 g)及本地人群数据库(Inhouse) 进行比对分析。去掉同义突变，去掉在1 000 g、ESP6500 和Inhouse 数据库中出现频率大于1%的突变；对于HGMD数据库中明确报道过的突变位点：对比 HGMD 数据库中与样本遗传疾病相关的突变热点，分析已报道位点的疾病临床症状与样本临床症状是否一致，如果一致则可以考虑该突变为致病突变；对于不携带已知致病突变的患者：根据sift、ppt- 2、Mutation Taster功能预测结果，筛选出氨基酸改变为无义突变(stop gain)、移码突变(frame shift)、前接突变(splicing)、终止密码子丢失(stop loss)、错义突变(missense)等对蛋白功能影响比较大的突变位点；结合基因与疾病的关联信息和样本的临床信息，筛选样本的可疑致病基因突变。

2 结果

2.1 目标基因靶向捕获测序多重引物对

设计了TG代谢相关基因多重引物对(表1)，包含9个基因，覆盖外显子区和UTR区，每个外显子碱基的平均测序深度在100×，覆盖度为99.7%。

 

表1 测序基因列表Table 1 List of genes to be sequenced

  

genechromosomeexonfunctionLPLchr810lipolysisAPOA5chr115lipolysisAPOA4chr113lipolysisAPOC3chr114lipolysisAPOC2chr194lipolysisAPOEchr194lipolysisANGPTL8chr194inhibitionoflipolysisANGPTL4chr198inhibitionoflipolysisANGPTL3chr17inhibitionoflipolysis

2.2 严重HTG患者临床特征

[5] Peloso GM, Auer PL, Bis JC, et al. Association of low-frequency and rare coding-sequence variants with blood lipids and coronary heart disease in 56,000 whites and blacks[J].Am J Hum Genet,2014,94:223- 232.

2.3 严重HTG患者的罕见突变

通过目标基因靶向捕获测序，在43例严重HTG患者中，共发现了7个已知的致病突变或可疑致病突变(表3)，其中位于LPL和APOA5的3个错义突变(p.E269K, p.D48V, p.G185C)是在HGMD数据库中已收录的已知致病突变； 位于基因LPL 3′UTR区的突变、APOA4的缺失突变(p.D335fs)、APOE的错义突变(p.E189K)和ANGPTL8 5′UTR区的突变经过功能预测可能为致病的有害新突变。在本研究患者中APOC3/C2、ANGPTL3/4均未发现可疑基因突变。43例严重HTG患者中，有33例患者携带有已知致病突变或可疑致病突变，10例患者未发现致病和可疑致病的突变，这说明仍有未知基因突变影响TG水平。

 

表2 严重HTG患者的临床特征

 

Table 2 Clinical characteristics of the patientswith extreme TG

  

variableHTGgroup(n=43)age/year52.8±10.4gender/male74.4%TG/(mmol/L)14.0±4.4TC/(mmol/L)6.7±2.4HDL-C/(mmol/L)0.8±0.2acutepancreatitis/case4

TC.total cholesterol; data are presented as mean ± standard deviation or %.

2.4 ANGPTL8突变引起三酰甘油和胆固醇的改变

[4] Zhang Y, Li S, Donelan W, et al. Angiopoietin-like protein 8 (betatrophin) is a stress-response protein that down-regulates expression of adipocyte triglyceride lipase[J].Biochim Biophys Acta,2016,1861:130- 137.

 

表3 严重HTG患者中的致病和可疑致病突变Table 3 Pathogenic and probably pathogenic mutations identified in patients with extreme TG

  

locusmutationfunctionalpredictionNuc.changeaminoacidchangeSIFTppt-2mutationtasterHGMDNo.ofcarriersHTG(n=43)LPL:19813381c.G805Ap.E269KNDDDM1LPL:19805745c.A143Tp.D48VNTNDM?1LPL:198242603'UTR(novel)----14APOA5:116661392c.G553Tp.G185CTDNDFP17APOA4:116691771c.1003delGp.D335fs(novel)----2APOE:45412118c.G565Ap.E189K(novel)TDD-1ANGPTL8:113503055'UTR-(novel)----1

Nuc.nulceotide; SIFT.sorting intolerant from tolerant; ppt- 2.PolyPhen2; DM.disease-causing mutation in HGMD; DFP.disease-associated functional polymorphism in HGMD.

3 讨论

通过对43例严重HTG血症患者进行目标基因靶向捕获测序， 筛查出3个已报道的致病突变(p.E269K,p.D48V, p.G185C)和4个新的基因突变：位于LPL 3′UTR区的突变、APOA4的缺失突变(p.D335fs)、APOE的错义突变(p.E189K)和ANGPTL8 5′UTR区的突变。其中位于ANGPTL8的突变在人类遗传突变相关数据库中都未曾报道，为了进一步确定该突变是罕见突变，本研究对149例非高三酰甘油血症人群进行目标基因靶向捕获测序，未发现该突变，说明该突变在中国人群中属罕见突变，低频率携带率多提示为可疑突变，由于缺乏功能验证，其致病性有待进一步证实，但该突变是首次发现的与血脂相关的ANGPTL8罕见可疑致病突变。

近年来，榆阳区在以能源开发为前提的能源基地建设带动下，榆阳生产总值、固定资产投资和地方财政收入的增长率呈现出跳跃式的发展，而榆阳的农民年均收入的增长幅度，却始终低于全国农民平均年收入水平。研究和解决榆阳“三农”问题，是摆在榆阳区这个经济增长率超常规发展地区最大的社会课题。

通过对严重HTG患者进行目标基因靶向捕获测序，发现TG代谢已知基因的新突变，并发现ANGPTL8新的罕见突变，扩大了TG代谢的基因谱，为ANGPTL8与脂质代谢的研究奠定理论基础。

本研究有一定局限性：目标基因靶向捕获测序无法检测大片段缺失；新的可疑致病突变需要扩大人群验证并需要进一步功能验证；另有10例患者未筛查出致病突变，虽然排除了继发性高脂血症进行基因突变筛查，但仍可能存在其他未知的继发因素，同时也可能是由于设计的多重引物对中未涉及的基因突变导致。

严重HTG主要是单基因突变，常见的原因是LPL突变导致LPL缺乏[9]。另外，APOC2突变也可以影响LPL的激活，从而导致TG蓄积[10]。近年来研究发现ANGPTL8与该家族成员ANGPTL3、ANGPTL4的N端有同源性，通过ANGPTL3、ANGPTL4协同作用调控脂代谢[11]，研究[12]已证实ANGPTL3发生突变可导致血浆中LDL-C和TG水平下降， 可能通过调节LPL、肝酯酶(hepatic lipase，HL)和内皮酯酶(endothelial lipase，EL)的活性参与血脂的调节。ANGPTL4敲除小鼠[13]可导致循环中TG水平的降低，过表达该基因则导致血浆中TG水平升高。ANGPTL4通过抑制LPL和EL的活性，降低循环中TG的清除率。本研究中发现的ANGPTL8罕见突变同时影响TG和总胆固醇，可能是由于该突变同时影响了相关酶的活性和功能，进而影响到脂质代谢。

参考文献：

民国时期是一个新旧思想碰撞、百家争鸣的时期，民国时期文献以文字记录了那个时期的历史，保护民国时期文献是我们的神圣使命的。经过多年的发展，民国文献整理、保护、开发利用工作已经取得了长足发展，相关学术研究水平也在不断提升，实践成果日出不穷，国家相关部门和社会大众对民国文献的研究内容越来越深入。民国文献主要收藏在国家图书馆(约67万册/件)、南京图书馆(约70万册/件)、吉林图书馆(16万册)、上海图书馆、重庆图书馆(约10万/册)，另外分散收藏于多家图书馆和档案馆的满清资料约有40万册/件[2]。

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3.3.2 效度分析。效度是用来衡量测量的有效性和准确性，效度分析包括内容效度和结构效度。本研究问卷中各潜在变量的衡量指标均是基于国内外学者的相关文献和研究问卷，结合中国目前的无现金支付特性整理得到的，并进行了预试和征求了无现金支付使用者的意见，因此量表具有较好的内容效度。

[2] Cefalu AB, Spina R, Noto D, et al. Identification of a novel LMF1 nonsense mutation responsible for severe hypertriglyceridemia by targeted next-generation sequencing[J].J Clin Lipidol,2017,11:272- 281.

（1）干预到分娩前，统计并比较两组患者妊娠期血液粘稠度、红细胞压积、24小时尿蛋白定量、S/D、RI值。抽取患者空腹静脉血，送检验科，采用全自动血液分析仪、全自动生化分析仪检测血液粘稠度、红细胞压积、S/D和RI值，留取患者早晨8点到次晨8点尿液，送检验科，分析24小时尿蛋白定量。（2）干预到分娩前，测量并比较两组患者收缩压（SBP）舒张压（DBP）水平。（3）分娩结束后，统计并比较两组新生儿Agpar评分、新生儿窘迫、新生儿平均血糖水平。

在7个突变中，LPL、APOA5/A4/C3/A1基因簇、APOE突变主要影响TG，而携带有ANGPTL8突变的患者不仅表现为TG水平升高(TG=18.1 mmol/L)，总胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇水平也发生了显著改变(TC=9.03 mmol/L,HDL-C=0.68 mmol/L)，对该患者进行了已知胆固醇相关基因(LDLR、APOB、PCSK9、ABCA1)突变的筛查，未发现携带有胆固醇相关基因已知突变，推测ANGPTL8突变可能同时影响TG和胆固醇水平，有待于进一步研究。

43例严重HTG的临床特征见表2，严重HTG患者的TG、总胆固醇水平显著升高，高密度脂蛋白胆固醇水平显著降低。4例患者有急性胰腺炎病史。

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我国太阳能光伏产业起步较西方国家略晚，借鉴和了解掌握全球新能源政策尤其是针对光伏项目补贴政策，对促进我国可再生能源健康发展和未来光伏市场发展至关重要。自2009年开始实施“金太阳示范工程”以来，法规政策趋于完善，100多项国家政策性文件和地方政府促进区域光伏产业健康发展的措施，营造有利于产业发展互补配套的政策环境，培育了国内光伏市场，扶持了产业龙头企业，在推动能源转型中发挥了重要作用，中国光伏“两头在外”的局面得到大幅度的改善。未来10年太阳能发电容量持续增长，中国将成为全球规模最大、增长速度最快的太阳能市场。

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随着经济的发展，人民的思想观念发生了很大的变化，对于生活质量的要求在不断的提高，园林建设是城市中不可缺少的部分，人民对于其的重视程度较高，近些年我国园林绿化水平在不断的提高，彩色树种在园林绿化过程中发挥着重要作用，本文对彩色树种在园林绿化中的应用与作用进行深入研究。

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