不同种属来源肝素鉴定方法的研究进展

肝素是一种抗凝剂，是预防治疗血拴形成的重要药物。临床医疗中常常用到普通肝素和低分子肝素，普通肝素可以直接用作医疗药物，也可以作为生产低分子肝素的原材料。普通肝素和低分子肝素的分子结构很复杂，都属于一种糖胺聚糖的高度解聚混合物，平均分子量分别为15 000和5 000道尔顿[1]。在很多动物(例如牛、羊、猪、鸡、狗、鲸鱼等)的多种组织器官中(例如肠、肺、肝、皮肤等)都有肝素的存在，猪肠是目前临床使用肝素的最重要的来源。反刍动物(牛、羊)也曾是药用肝素的主要来源动物，但由于传染性海绵状脑病的存在，来源于反刍动物或者含有反刍动物成分的肝素现在已经被视为不合格产品。猪源肝素易受反刍动物成分的污染，这些成分残留在猪体内，最终导致肝素含有反刍动物成分[2]。因此，肝素种属来源的鉴定是肝素质量检测的一项重要指标，尤其是其中反刍动物成分的检测。目前，粗品肝素不同种属来源的鉴定方法主要有两种，一种是基于肝素本身的结构的鉴定，一种是对肝素中残留动物源成分的检测。

1 基于肝素本身结构的鉴定

不同来源的肝素钠具有不同的化学结构和生物活性，也会引起不同的不良反应。马志华等[3]用肝素酶酶解不同种属来源的粗品肝素钠，以其酶解后的二糖组份为研究对象，通过阴离子交换高效液相色谱法(SAX-HPLC)法比较二糖的相对组成，鉴定种属来源。同时在猪来源肝素中分别添加不同比例的牛来源肝素或羊来源肝素，经肝素酶酶解后，通过SAX-HPLC法鉴别在猪来源肝素中是否能快速检出不同种属来源的其他肝素。结果显示，对于不同种属来源的粗品肝素钠，它们的二糖组成具有显著差异；若猪来源肝素混入5%羊来源肝素，即可通过其二糖组成判断。但文中结果也指出该方法并不能鉴别牛来源肝素的混入。毛细管电泳[4]、醋酸纤维素膜电泳[5]、高效液相色谱法[6]、核磁共振法等[7]方法也被应用于肝素的检测，但多被用于检测多硫酸软骨素、硫酸皮肤素等杂质的检测，还未见用来鉴别肝素动物种属来源的报道。

2 基于肝素中残留动物成分的检测

2.1 基于物种特异性蛋白的检测方法

免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。抗原与相应抗体相遇可发生特异性结合，并在外界条件的影响下呈现某种反应现象，如凝集或沉淀，藉此可用已知抗原(或抗体)检测未知抗体(或抗原)。试验所采用的抗体常存在于血清中，因此又称之为血清学反应。Rivera等[8]为了建立一种免疫学检测技术来监测提取粗品肝素的动物原材料来源，以牛肠粗品肝素的最终纯化样品为抗原，在兔子体内构建多克隆抗血清。他们在两种不同的工业过程纯化的牛粗品肝素中发现了一种重要的牛特异性抗原Ag1，在牛的肺、肝、小肠、脾、肾等器官中含量都很高，并发明了一种放射免疫分析法来定量Ag1抗原。利用这种免疫方法，6‰的牛源肝素溶于猪源肝素溶液(50 mg/mL)2 h后可以被检测出来。Levieux等[9]为了能检测生产肝素的猪小肠粘膜原料中的反刍动物(牛、羊)组织的含量，构建了抗牛、羊、猪血清白蛋白的抗血清，并建立了相应的酶联免疫吸附测定法和单向免疫扩散法两种免疫测定方法。其研究结果显示，酶联免疫法灵敏度很高，猪小肠粘膜中只含有1 ng/mL的牛血清蛋白或者10 ppm的牛小肠粘膜都能检测出来。而对于一般检测，单向免疫扩散法更为方便但灵敏度较低，能检测出2 μg/mL血清白蛋白或者3‰的牛羊小肠粘膜；而且由于牛肠和牛肺所含的白蛋白更多，因此单向免疫扩散法对他们的检测更为灵敏，分别达到1.5‰和0.9‰。Levieux等[10]发明了新的酶联免疫吸附测定法，以粗品肝素中的特异抗原杂质或者纯化过程中色谱分离的洗脱物为抗原制造兔抗血清。利用这种优化的酶联免疫法能从粗品肝素中检测出低至0.6‰到1.5‰的绵羊和山羊的成分。

2.2 基于物种特异性的DNA分析方法

由于蛋白质在动物死亡后很容易失活，其存在和特点也依赖于细胞的类型，因此基于物种特异性蛋白的检测方法有很大的局限性，依赖于特定物种的DNA分析方法相对而言在检测的敏感性、特异性和准确性都有着明显的优势。陈川等[11]通过柱回收和胶回收两步回收法，从粗品肝素钠中提取动物残留核酸，以其为模板，通过常规 PCR 法进行种属来源的鉴定。分别以猪、羊来源的核酸为模板，用 3 种种属特异性引物进行 PCR 扩增，验证引物的特异性；对柱回收、胶回收和两步回收法提取的核酸样品及含不同比例羊来源肝素钠的混合样品进行 PCR 检测，并检测 3 批次肝素钠样品的种属来源。结果显示，猪的引物能特异性扩增猪来源的核酸，羊的引物能特异性扩增羊来源的核酸；采用单一胶回收和柱回收法提取的残留核酸，不能有效地利用常规 PCR 鉴定种属来源，而两步回收法提取的残留核酸，能有效地利用常规PCR鉴定种属来源；采用两步回收法提取核酸，可检测到含 1%羊来源肝素钠的混合样品；3 批次的肝素钠样品中均混有羊肝素钠。Huang等[12]用七种方法从工业猪粗品肝素中提取残留DNA，并用抑制物控制性PCR(inhibitor-controlled PCR)验证DNA提取的效果，结果证明只有琼脂糖凝胶纯化方法可以完全消除工业猪粗品肝素中的PCR抑制物质。于智勇等[13]对家猪、野猪及其他7种动物的线粒体DNA(mtDNA)D-loop区进行序列分析, 设计了专门用于鉴别猪基源肝素钠的AS-PCR(allele-specific PCR)引物及ARMS(amplification refractory mutation system)引物，对家猪、野猪及其他7种动物来源的肝素、肌肉或血液共49个样品的基源进行了分子检测。结果表明，AS-PCR及ARMS方法均可用于猪基源肝素粗品的快速鉴别。王自强等[14]利用土壤基因组DNA提取纯化试剂盒从肝素钠粗品及原料药中提取残留核酸，以其为模板，通过常规PCR及实时荧光PCR 法进行动物源性成分鉴定。以提取猪肝、牛心、羊肝的DNA 为对照品，验证所建立的检测方法的特异性及灵敏度，并用以上两种方法对3 批肝素钠粗品及4 批肝素钠原料药进行动物源性成分鉴定。结果表明，采用的两种PCR方法对猪、牛、羊源性成分的鉴定具有特异性，且灵敏度分别达到pg级及10-1pg级。Concannon等[15]根据反刍动物Bov-A2短散布核元件序列和猪的PRE1短散布核元件序列设计引物和探针，用肝素酶处理猪粗品肝素样本，并用荧光定量PCR方法来检测其中的反刍动物DNA，能定量出范围为0.3～3 000 ppm反刍动物DNA。Houiste等[16]用荧光定量PCR检测低分子肝素的种属来源，可以检测出低至1 ppm的牛和10 ppm的绵羊污染物，而且认为荧光定量PCR法结合二糖分析可以更好地控制低分子肝素的质量。

我国的生猪屠宰量占全球50%以上，拥有全球最丰富的肝素原料资源，肝素原料药产量在全球占绝对优势，是全球最为重要的肝素粗品和原料药的主要生产国和出口国。近年来，欧美对肝素执行越来越严格的质量标准，肝素中反刍动物成分成为出口肝素检测的重要指标之一。建立操作方便简单，成本低廉，重复性好，检测灵敏度高的反刍动物成分检测方法十分必要，既可以保证我国肝素生产出口的优势，还能间接促进生猪养殖业的健康可持续发展。在目前的检测方法当中，包括常规PCR法、实时荧光定量PCR法在内的基于物种特异性的DNA分析方法是目前的主流检测方法，但这些方法中还有值得改进和优化的地方。一方面，残留DNA的提取方法可以优化。肝素对PCR技术有着强烈的抑制作用，50 μL PCR反应体系中，低于0.002 U的肝素就可以强烈抑制PCR的进行[17]，因此提取的残留动物DNA必须没有肝素杂质。现有的肝素酶消化法成本高昂，肝素酶稳定性差；而琼脂糖凝胶纯化法、土壤基因组DNA提取纯化试剂盒、胶回收柱回收两步回收法等也没有得到很好的认证和应用，因此需要进一步优化残留DNA的提取纯化方法。另一方面，DNA分析方法可以优化。实时荧光定量 PCR实现了常规PCR从定性到定量的突破，而且具有特异性强、灵敏度高、速度快、定量准确、重复性好、全封闭等优点，迅速成为了现代分子生物学研究中的重要工具。其使用的荧光化学方法主要有DNA结合荧光染料、水解探针、分子信标、荧光标记引物、杂交探针等五种，成本也各不相同，因此需要实验并找寻合适的、灵敏的、低廉的荧光化学方法。

就EAR而言，通过计算得出EARr和EARl后，将EARr和EARl分别与预先设定好的阈值进行比较，判断左右眼是否闭眼，当双眼同时满足闭眼条件时，开启定时器，结束条件为下一次某只眼睛睁眼或同时睁眼，测得闭眼时长,与预先设定好的时间阈值进行比较后判断是否存在长时间闭眼。同理可以得到打哈欠状态。

当地主要种植玉米和土豆，用肥高峰期主要集中在2月份，目前处于用肥淡季。张仁荣反映，今年当地化肥整体销量较往年相比下滑较为严重，一是因为在当地政府的号召下，今年玉米的种植面积有所减少，大大减少了用肥量；二是因为农产品卖不上价，农民种地不挣钱，种植的积极性下降，很多农民将土地撂荒，据了解，当地土地撂荒面积达到当前耕地面积的30%以上。

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