古田县柿子亲缘关系的ISSR分析

柿树科(Ebenaceae) 柿属(Diospyros L.)中的柿(Diospyros kaki L.)是落叶乔木，原产东亚，主要分布在温带、亚热带和热带，柿属中以柿种质资源最为丰富[1]。中国是柿的主要原产国之一，柿栽培品种数量已达1058个[2-5]。柿树在中国种植面积广泛，遗传多样性高，栽培历史已有 3000 多年，是中国主要的栽培果树之一[6]。柿的果实成熟后颜色根据品种呈浅橘黄色到红色不等，鲜丽悦目，风味独特，含有多种矿质元素、维生素和糖类等。至今为止，已发现多种活性物质，其中包括类胡萝卜素、黄酮类、脂肪酸、酚类和多种氨基酸、微量元素等。柿在园林中既能观叶、观果又能结合生产，是很好的栽培及绿化造林果树。根据在成熟前能否自然脱涩，柿可以分为涩柿和甜柿2类。古田栽培柿已有300多年的历史，当地栽培品种大多为涩柿，部分为甜柿。甜柿成熟时已经自然脱涩，可以直接食用，我国上市的柿子大部分是涩柿，采摘后须经人工脱涩后方可食用。

ISSR(Inter simple sequence repeat)分子标记是类似 RAPD(Random amplified polymorphic DNA)标记的一种简单重复区间扩增多态性的分子标记技术[7]，是最近几年在 SSR 微卫星分子标记(simple sequence repeat)基础上发展起来的一种新型分子标记技术[8-9]；ISSR 分子标记相比于其他标记技术具有快速、灵敏、高效的特点，而且样品用量少，可重复性好，方便操作，成本较低，已广泛应用于植物的遗传多样性研究，进而分析其系统分化规律，研究群体遗传结构[10-11]。本文应用 ISSR 分子标记技术对古田县境内主要柿子种质资源进行遗传多样性分析，旨在为柿子的种质资源的收集、鉴定和栽培利用提供参考。

混合后的综合污水经过格栅、调节池和气浮设备后，去除水中悬浮物及分散油。由于混合水中COD含量高，并可能存在大量的难降解有机污染物，这类有机物一般都对生物体具有毒害或不良作用。因此，选用芬顿法作为预防性手段，对污水进行高级氧化处理，以提高废水的可生化性能。具体工艺流程可见图1。

1　材料与方法

1.1　材料

供试材料甜柿(TS)、大粒黄柿(DLH)、雍菜籽柿(YCZ)、小盘柿(XPS)、野生甜柿(YST)、长炮弹柿(CPD)、无名柿(WM)、乌柿(WS)、长尖柿(CJ)、小叶柿(XY)、鸭蛋柿(YD)、枣柿(ZS)、炮弹柿(PD)、八月黄柿(BYH)、猴柿(HS)，均在2016年采集于福建省宁德市古田县利洋村(编号、名称以及来源见表1)。采集新鲜嫩叶，和变色硅胶一同放进自封袋中带回实验室，经液氮速冻后，置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2　方法

2.虽然仅是部分实现了内部价格市场化，但同样为炼化结构调整指明了方向，催生了调整产品结构的动力。将使炼厂主动将石脑油、蜡油等原料由生产成品油转为乙烯、芳烃和航煤原料，有利于产销平衡，从而实现更好的综合效益。

表1　供试材料的编号、名称及来源

编号名称采样地点1甜柿(TS)古田县利洋村2大粒黄柿(DLH)古田县吉巷村3雍菜籽柿(YCZ)古田县廷元里村4小盘柿(XPS)古田县极乐村5野生甜柿(YST)古田县极乐村6长炮弹柿(CPD)古田县昆山村7无名柿(WM)古田县廷元里村8乌柿(WS)古田县廷元里村9长尖柿(CJ)古田县峦垅村10小叶柿(XY)古田县利洋村11鸭蛋柿(YD)古田县极乐村12枣柿(ZS)古田县极乐村13炮弹柿(PD)古田县利洋村14八月黄柿(BYH)古田县极乐村15猴柿(HS)古田县吉巷村

*：括号中字母为样品名称拼音简称，下同。

CTAB提取液(0.1mol·L-1 Tris-Hcl pH 8.0，1.5 mol·L-1 EDTA，2% CTAB，2% β-巯基乙醇)、β-巯基乙醇、可溶性PVPP、氯仿-异戊醇(24∶1)、无水乙醇、TE缓冲液(10 mmol·L-1 Tris-Hcl pH 8.0，0.1mmol·L-1 EDTA pH 8.0)、双蒸水、6×DNA Loading Buffer(福州都拜特生物技术有限公司)、琼脂糖、TAE、ISSR引物(上海捷瑞生物科技有限公司)、Gelstain、2×easy taq PCR SuperMix(+dye)(北京全式金生物科技有限公司)、Trans2K PlusDNA Marker(福州都拜特生物技术有限公司)。

1.2.2　基因组DNA的提取　采用植物基因组DNA提取试剂盒和改良的CTAB法提取DNA，DNA试剂盒法提取参照试剂盒说明书进行，改良CTAB法参照易庆平[12]的方法进行改进。比较2种方法提取DNA效果的差异，结果由图1可以看出，植物基因组DNA提取试剂盒法提取DNA的效果不理想，浓度过小，DNA不纯；而改良CTAB法比植物基因组DNA提取试剂盒法更加高质高效，最终全部采取改良CTAB法提取DNA。DNA质量及浓度用Cayr-50紫外分光光度计检测其完整性，选择OD260/OD280比值在1.8～2.0之间，且无拖尾、清晰的DNA于-20 ℃冰箱保存备用。

3、10为供试材料的编号；S为试剂盒法；C为CTAB法 　　图1　试剂盒与CTAB法提取DNA的差异比较

综合考虑各种因素，最终确定最合适的20 μL体系总体积中包括：2×easy taq PCR Super Mix(+dye) 10 μL，引物浓度 0.3 μmol·L-1，DNA 模板 30 ng·μL-1，ddH2O 8.4 μL。PCR 扩增程序设置为：预变性 94 ℃ 3 min；变性94 ℃ 30 s；退火温度52 ℃(因引物不同而有所不同)45 s；延伸72 ℃ 90 s；循环35次；后72 ℃延伸7 min；最后4 ℃ 保存。吸取7 μL扩增产物和2 μL 6×Loading Buffer 混合，以Marker DL 2000 为分子质量标准，在1.5%的琼脂糖凝胶中用1×TAE缓冲液中进行电泳分离，电泳电压与电流设置为1∶1(110 V∶110 A)，之后用JS-3000全自动凝胶成像分析仪进行拍照分析。

1.2.3　ISSR-PCR扩增　2×easy taq PCR Super Mix(+dye)为预混的含有优化浓度的高纯度的Taq DNA聚合酶、dNTPS、Mg2+、反应缓冲液和稳定剂等成分的即用型2倍浓度的PCR溶液以及引物、DNA模板和ddH2O混合构成20 μL体系，由于引物和模板浓度对实验影响未知，因此设计引物和DNA模板这2种因素的梯度组合进行正交试验，以优化ISSR体系。将这2种因素分别设置5个水平，其中引物水平为0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μmol·L-1，DNA 模板水平为 10、20、30、40、50、60 ng·μL-1，在整个梯度设置试验中，随着各种因素水平的变化，要相应调整ddH2O的量，以保证20 μL体系不变。

1.2.4　引物筛选　根据已经优化好的体系，选用DNA纯度较高的样品为模板，参照哥伦比亚大学(UBC)公布的第9套引物序列进行筛选，根据前人实验，选择45条引物进行筛选，用退火温度范围内较为合适的温度进行PCR扩增，先用0.8%的琼脂糖凝胶电泳进行初步检测，筛选条带清晰、多态性高、稳定性好的引物作为15个样品的鉴定引物。

1.2.5　数据处理与分析　ISSR-PCR扩增之后的电泳谱带结果中，采用Clark[13]的方法，对DNA条带的有无进行标记，有条带记为1，无条带记为0，建立二元矩阵。用Ntsys-pc 2.10e软件进行分析，使用非加权组平均法(UPGMA)进行聚类分析，构建聚类树状图[14]。

1.2.1　仪器与试剂　高速冷冻离心机、DK-S22电热恒温水浴锅(上海精宏)、电子天平、DYY-6C电泳仪(北京六一生物科技有限公司)、电泳槽、梳子、Biometra PCR扩增仪(德国耶拿)、Eppendorf BioSpectrometer紫外分光光度计、JS-3000全自动凝胶成像分析仪(上海培清科技有限公司)。

2　结果与分析

2.1　引物筛选与多态性分析

实验室资源与创新平台利用率低 随着高等院校越来越注重学生的实践动手能力培养，国家对教育投入的持续增加，很多高校在开放实验室和双创平台建设上投入的人力、财力和物力不断增加，但在这个过程中，实验室重复建设、资源配置不合理等高校开放实验室与双创平台利用率不高的问题不断出现[6]。由于管理和协调方面存在很多缺陷，大多数实验室只是满足基本的本科和研究生教学任务，进实验室进行科技创新实验和到平台进行双创实践的学生很少，因此，创新平台和实验室利用率低。

(3) 环青藏高原边缘的新构造运动强烈、活跃，地震作用强烈而频发，河流持续下切和青藏高原持续隆升，造成川藏高速公路所经地区的高陡峡谷区发生了强烈的动力作用过程，促进了危岩的形成和崩塌的发生。

表2　ISSR引物扩增及其多态性

编号引物引物序列(5′-3′)退火温度/℃扩增条带数/条多态性条带数/条多态性带占比/%1UBC809AGAGAGAGAGAGAGAGG521010100002UBC810GAGAGAGAGAGAGAGAT507342863UBC813CTCTCTCTCTCTCTCTT527342864UBC815CTCTCTCTCTCTCTCTG548675005UBC818CACACACACACACACAG518675006UBC825ACACACACACACACACT529777787UBC834AGAGAGAGAGAGAGAGYT529666678UBC840GAGAGAGAGAGAGAGAYT5277100009UBC845CTCTCTCTCTCTCTCTRG51991000010UBC846CACACACACACACACART54771000011UBC853TCTCTCTCTCTCTCTCRT5165833312UBC855ACACACACACACACACYT5511111000013UBC857ACACACACACACACACYG54771000014UBC860TGTGTGTGTGTGTGTGRA51867500平均8076648228合计113938230

2.2　聚类分析

使用UPGMA方法进行聚类分析，得到15份材料的聚类树状图(图3)，以0.70为阀值的遗传相似系数，可将这些材料分为5组。其中第1组为甜柿、大粒黄柿、雍菜籽柿、无名柿、长炮弹柿，第2组为乌柿、小叶柿、猴柿、八月黄、长尖柿、鸭蛋柿、炮弹柿，第3组小盘柿，第4组野生甜柿，第5组枣柿；说明后3组在分子水平上与其它柿属植物差异较大。

图2　引物UBC860扩增15份柿种质资源的电泳结果图3　古田柿属的UDPGM聚类分析树状图

2.3　遗传相似系数分析

采用Ntsys-pc 2.10e软件计算古田柿种质之间的遗传相似系数，结果见表3。古田15个柿种质材料的遗传相似系数范围为0.8230～0.5841，平均遗传相似系数为0.6929。其中，小叶柿、猴柿的遗传相似系数最大(0.8230)，说明这2个材料亲缘关系很近，遗传差异较小；甜柿、枣柿的遗传相似系数最小(0.5841)，表明这2个材料的亲缘关系较远，遗传差异较大。

行政层级分布方面（表2），民主党派中央主办的微信公众号是发布优质推文的主力军，阅读量普遍偏高，这与所投入的人力物力资源和运营经验有关。除台湾民主自治同盟外，7个民主党派中央的微信公众号共发布优质推文77篇，占61.6%；21个省级（包含直辖市）的民主党派微信公众号共发布38篇推文，占30.4%，其中河北民建表现极为突出，发布了9篇；7个地市级的民主党派微信公众号共发布10篇，占8%，其中潍坊民革表现突出，发布了2篇。

表3　古田柿种质之间的遗传相似系数

古田柿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古田柿CJXYYDZSPDBYHHSCJ10000XY0796510000YD070800734510000ZS06283063720601810000PD0699107257074340628310000BYH073450778807257059290752210000HS06903082300787606372074340778810000

3　结论与讨论

ISSR分子标记体系的稳定性是准确分析遗传多样性的重要条件，而影响ISSR-PCR反应体系的因素包括模版DNA浓度、引物浓度、Taq-DNA聚合酶、dNTP、循环数和退火温度等方面。其中退火温度影响较大，模板浓度、引物浓度影响较小，本实验从公司购置Mix，体系稳定，简单方便，省去较多时间。相较于RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)、RAPD、AFLP(amplifiedfragmentlengthpolymorphism)、SSR(Simplesequencerepeat0)等遗传标记，ISSR具有多态性高、可靠、重复性高、方便快捷、成本较低、DNA用量小、安全性较高等优点，因此在种质鉴定、亲缘关系分析、遗传多样性分析、遗传图谱构建等方面应用广泛[15]。

另外，与RJ版教科书有理数例题中的卡通插图相比，CM教科书有理数例题中的插图均为实景图，相对而言更加贴近生活．

*：衷心感谢古田县农村联动服务中心的林永安高级农艺师和福建农林大学的本科生朱海燕同学的帮助！

筛选出200～2000 bp之间的条带建立0-1矩阵，最终14条引物共扩增出113条DNA条带，其中多态带93条，多态百分率为82.30%，ISSR引物扩增结果及其多态性见表2。不同引物扩增条带数不等，条带最少的是UBC853，6条；条带最多的是UBC855，11条。14条引物平均跑出条带8.07条，条带片段大小分布在250～2500 bp之间。其中UBC810和UBC813的多态性占比为42.86%，相对较低。引物UBC860的扩增结果见图2。表明宁德市古田县柿属种质资源遗传多样性比较丰富，个体间遗传差异较大。

参考文献：

反射光分布测量装置如图2所示[9]。激光辐照在样品表面，通过改变激光入射方向入射角度，利用半圆阵列分布的光电探测器收集散射光，实现各路信号的光电转换，利用数据采集记录探测阵列的输出信号。利用所设计的实验装置，对不同材料粗糙表面、不同入射角度粗糙表面及同一材料不同表面粗糙度的BRDF特性开展了实验测试，测试的散射光强分布用归一化值进行表征[10]。

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[7]张起，安华明.贵州砂梨种质资源遗传多样性的ISSR分析[J].果树学报，2015，32(1)：6-12.

大多数民营企业和张佳佳一样都感受到税收优惠带来的利好，云南健之佳健康连锁店股份有限公司财务总监李恒说：“公司有1400多家连锁店，是一家劳动密集型企业，个税改革过度期政策实施后，员工获得了实实在在的‘红包’，工作热情更加饱满。”

[5]罗正荣，蔡礼鸿，胡春根.柿属植物种质资源及其利用研究现状[J].华中农业大学学报，1996，15(4)：381-388.

[9]Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification[J].Genomics，1994(20)：176-183.

用筛选到的14条引物对福建古田县柿子种质进行ISSR-PCR扩增，最终14条引物共扩增出113条DNA条带，其中多态带93条，多态百分率为82.30%。筛选出的引物较少，电泳条带也较少，可能是由于柿种质资源种间亲缘关系较近，不易得到有多态性的引物。通过形态与分子层面的比较分析，发现炮弹柿与长炮弹柿外观相似，但是口感差别较大，长炮弹柿肉质软而炮弹柿肉质脆，虽然名字都为炮弹，但遗传上没有实质关联。小盘柿、野生甜柿和枣柿聚类分析后单独聚为一类，说明古田县柿子种质资源基因差异较大，分子标记能清晰反映基因组本质差异[16]。此外在这些供试柿子材料中，炮弹柿外形美观、极耐储存，脱涩后风味极佳。今后应进一步加强古田县柿子资源的管理及利用，以期利用其遗传差异优势创造优良品种，为柿种质资源的收集、鉴定和栽培利用提供一些参考。

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样本数据包括中国长三角地区的江苏省、浙江省和上海市，样本区间为2005—2014年。各变量的统计性描述特征如下。

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