模拟原煤赋存环境下甲烷氧化菌降解煤吸附甲烷实验

煤矿瓦斯是煤在地质历史演化过程中生成的以甲烷为主气体的地质体[1]。瓦斯作为一种窒息气体不仅严重威胁煤矿井下作业安全，而且是导致采掘工作面瓦斯异常涌出、煤与瓦斯突出等重大矿井灾害的主要动力源[2-3]，同时还是加剧全球温室效应的重要气体之一[4-5]。如何清洁高效地治理煤矿瓦斯已成为专家、学者们研究的热点之一[6]。甲烷氧化菌(Methylotrophic bacteria)是以甲烷作为唯一碳源进行合成及分解代谢的微生物[7]，研究者不仅从温和的中性环境中发现了甲烷氧化菌的存在，而且还在极端环境下探测到其踪迹[8]：闵航等[9]首次从青紫泥水稻田中分离、纯化出甲烷氧化菌株AMOB3，该菌为革兰氏阴性菌,细胞大小仅为 0.3～0.5 μm×0.7～0.8 μm；刘晓宁等[10]从若尔盖高原不同地点采集的样品中筛选得到一株名为XN1 的甲烷氧化菌，其最适生长温度为25 ℃, 最适生长pH值为6.5；龙於洋等[11]从好氧污泥中分离得到的甲烷氧化菌，其具有生长迟滞期短、生长速率高等特点；刘欢等[12]从健康奶牛粪便样本中分离、筛选出甲烷氧化菌株，发现该菌能够利用多种碳源进行生长，但以甲醇为碳源生长最为良好。纵观上述研究成果，研究者主要关注甲烷氧化菌筛选过程及其生理生化特性，而对其应用于煤矿瓦斯治理等工业实践活动较少论述。因此，若能以现代微生物学方法解决传统煤矿瓦斯治理的难题，在煤矿开采之前或开采过程中通过超前钻孔将菌液注入煤体，以降低煤层瓦斯含量，将会从根本上切断瓦斯涌出的来源。笔者研制了模拟原煤体赋存环境下微生物降解煤吸附甲烷实验系统，考察在恒定轴压围压加载条件下，注入不同压力、体积和温度的菌液后甲烷氧化菌降解原煤体吸附甲烷的效能。

1 甲烷氧化菌的分类

迄今为止，已经有17个属100多种甲烷氧化菌被发现[13]。1970 年，Whittenbury 等对分离和鉴定的 100 多种甲烷氧化菌进行了分类[14]，在此基础上，Bowman 等采用分离方法对更多甲烷氧化菌进行了保存，并进行了更加系统的分类和描述[15]。现在依据其形态结构及生理生化性质，大致可以把甲烷氧化菌分为typeⅠ型、typeⅡ型和typeⅩ型。typeⅠ型甲烷氧化菌属变形菌(Proteobacteria)γ纲，通过RUMP途径吸收HCHO；typeⅡ型甲烷氧化菌属变形菌(Proteobacteria)α纲，通过Serine途径吸收HCHO；typeⅩ型甲烷氧化菌不仅可以利用RUMP途径氧化HCHO，而且还具有较低水平的丝氨酸途径[16]。然而，随着疣微菌门(Verrucomicrobia) 甲烷氧化菌的发现，传统分类方法的瓶颈愈加明显，并非所有的甲烷氧化菌都能完美归属这三类，因此迫切需要新的分类方法。根据其对氧气的需求状况可以分为好氧型、厌氧型两大类，而厌氧型甲烷氧化菌根据其耐氧程度又可分为兼性厌氧型、有氧耐受厌氧型和专性厌氧型。

尽管甲烷是一种非常稳定的烷烃，然而甲烷氧化菌可在自身含有特征酶(甲烷单加氧酶，methane monooxygenase，简称MMO)的作用下将甲烷氧化成甲醇，甲醇在脱氢酶作用下进而被氧化成甲醛。甲醛经过丝氨酸途径(Serine pathway)或磷酸核酮糖途径(Ribulose monophosphate,简称RUMP)合成细胞生命物质。

2 实验过程

2.1 菌种的筛选

实验用菌种富集源取自新郑市十七里河底泥，实验时以甲烷作为培养过程中唯一碳源，培养基为无机盐培养基，培养周期为7 d，重复液体培养4次。然后通过梯度稀释、在固体培养基上划线，最后挑选单菌落至液体培养基中待用。与此同时，从固体培养基中挑选单菌落进行革兰氏染色及显微观察，发现该菌为革兰氏阴性菌，呈杆状或月牙形杆状，这与已发现的兼性厌氧型甲烷氧化菌的特征相一致。

2.2 原煤试件的制作

实验用煤样取自耿村煤矿、芦沟煤矿、告成煤矿和九里山煤矿。由于所取用的煤样为松软构造煤，其内生裂隙较为发育，因此以“二次成型法”制作原煤试件，具体方法是：先在工作面新暴露煤壁上锯出一个近似正方体的煤柱，用塑料薄膜等密封好，然后用事先加工的方铁皮框罩住，并保证加工轴线与原煤层理垂直，在方框四周缝隙中填充聚氨酯，最后用宽手锯将方形煤柱体的底部小心锯断，搬运至实验室，手工加工成Ф50 mm×100 mm的原煤标准试件。煤样基础参数见表1。

 

表1 不同组煤样基础参数

  

煤样类别水分Mad/%灰分Aad/%挥发分Vdaf/%坚固性系数f瓦斯放散初速度ΔP耿村煤0.7911.4215.020.5925芦沟煤0.8812.4616.220.4522告成煤0.9610.2413.460.2721九里山煤0.7511.5312.550.2218

2.3 微生物降解原煤体吸附甲烷实验系统

[2] 潘一山.煤与瓦斯突出、冲击地压复合动力灾害一体化研究[J].煤炭学报,2016,41(1):105-112.

  

1—甲烷气体钢瓶；2—气体减压阀；3—气体质量流量计；4—针型控制阀；5—注液泵；6—菌液；7—温度控制器；8—三轴加载仪；

 

9—真空泵；10—干燥塔；11—瓦斯解吸仪；12—气相色谱仪；13—三轴加载控制台；14—液压油。

 

图1 模拟原煤体赋存环境下微生物降解煤吸附甲烷实验系统

2.4 实验步骤

4)降解时间控制为24 h，降解完成后抽取三轴室的甲烷气体，使其涌入瓦斯解吸仪，并使用气相色谱仪分析气体成分。

(1)该同学推测,铝热反应所得到的熔融物应是铁铝合金。理由是:该反应放出的热量使铁熔化,而铝的熔点比铁低,此时液态的铁和铝融合形成铁铝合金。你认为他的解释是否合理:____(填“合理”或“不合理”)。

2)打开GT-7001-M10应力设备电脑软件界面并开启油压泵站，点击“围压升高”按钮，使围压持续升高达到8 MPa并稳定，点击“轴压升高”按钮，压力自动上升到12 MPa后停止。

②注重信息互通和业务协同。系统建设中秉持了 “一个系统、分级应用”的设计理念，全市水资源管理业务统一使用上海市水资源管理系统，水资源管理的各个环节在统一系统中实现信息互通和业务协同。同时，不同层级用户登录系统后，根据权限不同，工作在各自权限范围的业务平台上。

（5）不锈钢地铁侧墙单元电磁吸附压紧工装研究 根据焊接工艺试验结果表明，电磁场的加入有利于激光焊接焊缝性能的提升，现车生产具备使用电磁吸附压紧工装完成侧墙单元激光焊接的条件。根据现车激光焊缝特点，结合电磁吸附工装原理，针对现有侧墙单元激光焊接结构，研究可应用于现车的新型侧墙单元装配压紧工装结构及规格参数，进行侧墙单元电磁吸附工装概念设计。

3)调节甲烷气体减压阀使瓦斯气体压力稳定在0.2 MPa，吸附24 h后关闭甲烷气体总阀门。采用单因素变量法共设计3个水平的实验，第一水平实验中分别控制温度为10、15、20、25、30、35、40、45 ℃，菌液注入压力和体积为不变量；第二水平实验中菌液注入压力分别为2、4、6、8、10、12、14、16 MPa，菌液体积和温度为恒定值；第三水平实验中菌液注入体积分别为10、15、20、25、30、35 mL，菌液注入压力和温度恒定不变。

（四）实验室诊断 取肝、脾作抹片，革兰氏染色镜检，见单个或2～5个短链状革兰氏阳性球菌。无菌取6份肝、脾分别接种普通琼脂平板及血液琼脂平板，经37℃24 h培养，普通平板上形成圆形、湿润、不透明凸起的光滑菌落，继续培养菌落变成橙黄色。3份在血液琼脂平板上形成白色圆形菌落，周围有溶血环，取上述菌落作革兰氏染色镜检，见典型葡萄串状的革兰氏阳性球菌。

1)打开实验室门窗，检查实验系统管路的气密性，在确保不漏气的情况下方可进行实验。

3 实验结果与分析

3.1 温度对甲烷氧化菌降解率的影响

从图2中可以看出，30 ℃条件为该型甲烷氧化菌生长的最适温度，甲烷降解率可达到33.2%～35.2%，平均降解率为34.2%。甲烷氧化菌对温度较为敏感，当温度升高到45 ℃时甲烷降解率急剧下降，仅为最适温度下的1.2%；10 ℃时平均甲烷降解率为8.5%，为最适温度下的25.0%。分析其原因：从宏观上来说可能与菌种的来源及筛选过程中温度的设定有关，在设定温度下具有较高降解效能的菌种被最大限度地保存下来；从微观上来说微生物新陈代谢作用是由无数个酶促反应综合决定的，低温条件下酶活性受到了极大的抑制，此种情况下随着温度的升高，酶活性则逐渐得到恢复，而在高温条件下往往引起蛋白质的凝固、变性，对酶活性造成不可逆转的影响。

拟定此研究于2015年1月至2017年12月在我院进行,以规定研究时段内收治的150例急诊内科患者为研究对象,随机均分对照组与观察组,各75例。此次研究经医学伦理委员会审核通过,且所有患者家属均知情同意。

根据煤层赋存温度情况，第一水平实验中控制菌液注入压力为2 MPa、菌液注入体积为20 mL恒定不变，考察温度对甲烷氧化菌降解效能的影响，实验结果如图2所示。

[6] 周生芳,陶秀祥,朱红威,等.煤矿土壤甲烷氧化菌的筛选及其培养条件的优化的初步研究[J].洁净煤技术,2008,14(4):98-100.

  

图2 不同温度条件下甲烷降解率

第三水平实验中以菌液注入压力2 MPa，温度30 ℃为不变量，以菌液注入体积为变量，考察不同菌液注入体积对甲烷氧化菌降解效能的影响，实验结果如图4所示。

3.2 菌液压力对甲烷氧化菌降解率的影响

第二水平实验中控制菌液注入体积为20 mL，温度保持30 ℃，考察不同菌液注入压力对甲烷氧化菌降解效能的影响，实验结果如图3所示。

  

图3 不同菌液压力条件下甲烷降解率

从图3中可以看出，随着菌液注入压力的增大，其降解效能也在不断地增大，然而增幅逐渐变缓。当菌液注入压力为16 MPa时，其降解率平均可达45.6%，这是由于随着菌液压力的增大，煤体中老旧裂隙、孔隙通道进一步增大，同时也产生了不少新的孔隙通道，煤体孔隙率增加，甲烷气体更容易解吸出来，因此提高了甲烷降解率；在相同的菌液压力下不同煤样的甲烷降解率有所不同，这可能与煤体本身的瓦斯放散初速度、坚固性系数等因素有关。

3.3 菌液体积对甲烷氧化菌降解率的影响

  

图4 不同菌液体积条件下甲烷降解率

从图4中可以看出，4组煤样在注入菌液量为10 mL的条件下，甲烷平均降解率为18.4%；当菌液注入量为40 mL时，甲烷降解率约为54.6%。随着菌液体积的增加，活性菌体数量成比例增加，同时微生物之间的协同作用增强，甲烷降解率提高。另一方面,水对煤体具有湿润作用，促使煤体中吸附甲烷从煤体中解吸出来，也增强了降解效能。另一个不可忽略的因素是煤样为松软构造煤，菌液注入煤体时部分水分被煤体吸收，菌液失去最适生存条件，造成降解甲烷量偏小，在注入的菌液体积较少时此种现象则较为明显。

4 结语

1)筛选出以甲烷作为唯一碳源的兼性厌氧型甲烷氧化菌种，并对其进行了初步鉴定。

2)用“二次成型法”制作出多组构造煤原煤标准试件；自主设计了“模拟原煤体赋存环境下微生物降解煤吸附甲烷实验系统”，满足了实验需求。

滑坡区及其附近地下水类型为松散岩类孔隙水和基岩裂隙水两大类。根据对在滑坡场地钻孔内所取的雨水汇集水样进行了室内分析，地下水pH值7.29～7.32。场地内地下水对混凝土及混凝土中钢结构具微腐蚀性，对钢结构具微腐蚀性。

一次设备包括的发电机、水轮机、断路器、主变压器以及高压配电装置等设备，必须要是国家评级的一类设备，机组的进水阀、事故闸门以及快速闸门等应尽量选择用PLC自动控制。系统设计需要保证所选设备运行的可靠性，能够保证机组、输水管以及建筑物的安全，并且在此基础上能够顺利将消息传运到远程监控中心。一般情况下厂用电源可以选择2台电变压器，其中1台主要由系统供电，而零1台则主要由本站完成供电，以此来组成双电源供电模式。双电源模式的设计，可以将两个电源作为相互的备用设备，并且能够完成自动投切，保证主电源消失以及设备故障时能够及时完成备用电源的供电[2]。

3)甲烷的降解率随着菌液注入体积、注入压力增大而增大，然而并非符合简单的线性关系；30 ℃为甲烷氧化菌最适温度，在温度为10 ℃和40 ℃时甲烷氧化菌的活性均受到了较大抑制。

参考文献：

[1] 张子敏.瓦斯地质学[M].徐州:中国矿业大学出版社,2009:3-4.

最后，共产主义社会的基本特征与世界历史的本质相契合。消灭生产资料私有制和剥削，消除国家、民族间的商品经济和商品交换，实现个人劳动与社会劳动直接统一，实现个人与历史直接统一，是共产主义社会的重要特征。因此，马克思称共产主义是“世界历史性的事业”，民族地域性的个人将转变为世界历史性的个人。世界历史性的个人本质上是自由的，每个人的自由发展将是一切人自由发展的条件。

模拟原煤体赋存环境下微生物降解煤吸附甲烷实验系统如图1所示，其是在GT-7001-M10三轴应力渗流实验装置的基础上，设计、改装而成的。该实验系统主要由三轴应力加载系统、充气系统与菌液注入系统、传感与控制系统、气体收集与成分分析系统组成。利用该实验系统可实现轴压、围压的动静态加卸载过程，其参数可在控制主机上实时读取，实现了自动化控制。降解完成后抽取三轴室内气体使其涌入瓦斯解吸仪，读取气体体积。气相色谱仪连接瓦斯解吸仪，通过该仪器可准确分析气体的组分及含量。

[3] 胡千庭,赵旭生.中国煤与瓦斯突出事故现状及其预防的对策建议[J].矿业安全与环保,2012,39(5):1-6．

[4] 崔学锋,张瑞林.风流中低浓度甲烷微生物降解效能实验[J].煤矿安全,2016,47(9):28-31.

1.Cut off（切掉）the top（顶端）of a strawberry.It is the hat of Santa Claus.The other part is the body.

[5] 田坤云,张瑞林,崔学锋.好氧型甲烷氧化菌对风流中甲烷的降解实验[J].矿业安全与环保, 2016,43(6):5-8．

1.6 旺树养分回流引起萎蔫 根据调查，果实萎蔫的树普遍偏旺，立秋后甲口愈合养分回流萎蔫多。这是由于甲口愈合后，根系为了满足恢复生长，调运大量养分，果实营养不足引起萎蔫。

[7] 韩冰,苏涛,李信,等.甲烷氧化菌及甲烷单加氧酶的研究进展[J].生物工程学报,2008, 24(9):1511-1519.

[8] 邓永翠,车荣晓,吴伊波,等.好氧甲烷氧化菌生理生态特征及其在自然湿地中的群落多样性研究进展[J].生态学报,2015, 35(14):4579-4591.

[9] 闵航,谭玉龙,吴伟祥,等.一个厌氧甲烷氧化菌菌株的分离、纯化和特征研究[J].浙江大学学报(农业与生命科学版),2002,28(6):619-624.

[10] 刘晓宁,李珍,林国秀,等.一株甲烷氧化菌的分离鉴定与特性[J].微生物学通报,2010, 37(9): 1265-1271.

[11] 龙於洋,方圆,廖燕,等.甲烷氧化菌在填埋场覆盖层的工程应用 (Ⅰ):分离与筛选[J].环境科学学报,2015,35(7):2210-2216.

[12] 刘欢,王亚洲,赵晨旭,等.一株奶牛粪便中甲烷氧化菌的分离与鉴定[J]. 黑龙江八一农垦大学学报,2016, 28(6):25-30.

[13] 魏素珍.甲烷氧化菌及其在环境治理中的应用[J]. 应用生态学报,2012,23(8):2309-2318.

[14] WHITTENBURY R, PHILLIPS K C, WILKINSON J F. Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria[J]. Journal of General Microbiology, 1970,61(2): 205-218.

[15] BOWMAN J P. The methanotrophs-the families Methylococcaceae and Methylocystaceae[J]. Prokaryotes, 2006, 5: 266-289．

[16] 蔡朝阳,何崭飞,胡宝兰.甲烷氧化菌分类及代谢途径研究进展[J].浙江大学学报(农业与生命科学版),2016,42(3): 273-281.