基因编辑在细胞生物学的应用有哪些

生物技术日新月异的今天，即使是像《经济学人》这样的时政批判杂志，也会放过当下热门领域，与惊喜不断而又忧心忡忡的我们讨论未来生物技术的走向。近日，《经济学人》披露，基因编辑技术可能会使运动员更强壮。早在这一技术出现之前，竞技比赛中就出现了各种兴奋剂，但这种通过修饰运动员的基因，使其更强壮的技术更隐秘，从而让对金牌有非分之想的运动员铤而走险。但它真的安全吗？这样使用基因编辑技术，是否会触及伦理问题？图片来自TED ideas基因编辑技术伦理引起争论2015年12月，一场由美国国家科学院和医学科学院、中国科学院以及英国皇家学会共同主办的“全球基因编辑峰会”（International Summit on Human Gene Editing: AGlobal Discussion）引发关注。这是有关基因编辑技术基础研究、临床应用以及伦理问题，举行的首个全球峰会。峰会在美国华盛顿召开，为期三天，与会者既有这一领域的顶尖科学家、政策制定者还有伦理学者。峰会既回顾了基因编辑在基础科学领域取得的突破，同时也探讨了可能的医学应用，由此引申出来的伦理问题，同样进行了广泛的探讨。此次峰会还达成了一项共识，即鼓励基因编辑的基础研究和在体细胞层面上的临床应用，但是对于生殖细胞的基因编辑，需考虑技术、社会以及伦理问题，属于限制级研究。峰会的导火索是由2015年4月份，来自中山大学研究者黄军就对已不能正常发育的三核胚胎进行基因编辑，论文因触碰伦理高压，在投递过程中四处碰壁，最后只得发表在影响因子很小的杂志《蛋白质与细胞》上，这是首次公开报道的科学家对人类胚胎进行的基因编辑。该研究所不断延伸出伦理讨论，先后在顶级学术期刊《自然》、《科学》等不断发酵，最终促成了当年12月份召开的全球基因编辑峰会。2017年2月，美国科学院公布的《人类基因编辑：科学、伦理以及监管》（Human Genome Editing: Science, Ethics, and Governance）报告，这份报告也是此次峰会讨论的成果之一。这份报告认为，每项科学技术的应用，我们都需要评估其效益、风险、规范以及社会伦理问题。为了能够更好地以及更为广泛地使用基因编辑技术，为人类健康造福，我们应该全面评估基因编辑技术由此带来的科学、伦理以及社会问题，并评估现有政府的行政措施，确保技术安全地被使用。图片来源网络不同的使用目的，采用不同的监管策略基因编辑技术CRISPR/Cas9是一种精准、能灵活地改变DNA序列的新兴技术，它要比最早的基因编辑技术ZFNs技术，以及后来的TALENs技术更为精准，2011年，基因编辑技术被评为《自然·方法》（NatureMethods）的“年度方法”，但直到CRISPR/Cas9技术出现后，基因编辑工具才真正变得强大起来。它能在核酸序列上精准地添加、删除以及改变遗传密码，不仅更简单方便，同时也使得基因编辑的准确率大大提高。2015年，《科学》杂志将其列为“十大年度科学突破之首”，从基础科研到对人类疾病的治疗，基因编辑技术带来的前景令人振奋，该技术拥有广阔的前景。基因编辑技术2015年被《科学》杂志评为年度科学突破之首基因编辑技术的原理简图在生物医学领域，基因编辑技术可起到三重作用：对基础科学的影响，对体细胞的基因编辑以及对生殖细胞的编辑。具体来讲，从基础科学角度来看，基因编辑技术可应用于细胞、分子、生物化学、遗传、免疫机制，包括生殖发育过程中的疾病，这些领域并不在美国伦理委员会的监管范围内。非生殖类细胞的体细胞基因编辑，包括皮肤、肝、肺、心脏细胞，但有时候体细胞会用于生殖细胞中（如体细胞核移植技术）等，它们则会受到伦理委员会的监管，伦理委员会需要了解收集以及使用这些细胞的目的。在美国以及大多数国家，这类研究都拥有健全的伦理制度监管，对体细胞基因编辑的临床应用，需以基因治疗或干预疾病为导向，但是不可影响到后代。基因编辑的基础科学试验对于我们理解以及改善基因编辑技术来说非常重要，同时也让我们了解疾病的分子机理，以至于未来可以进行人工干预。同样在实验室中，进行的生殖细胞的基础研究，也有助于我们了解人类发育的分子机制。目前来说，现有的监管体制对于这类实验有着较好的管控。由于对体细胞的基因编辑不会涉及到遗传的基因治疗，有关体细胞的基因编辑，目前主要有两种不同方式，一种是将特定的细胞在体外进行精确编辑，然后再回输到体内。另一种是将基因编辑体统通过载体打入到体内，从而实现身体某一具体部位细胞的基因，后者对基因编辑的效率以及精准率都难以把控，目前也是这类手术风险的关键所在。通过该方式治疗的疾病目前有血友病、粘多糖沉积症等。由于这种技术影响到的个体只是个人层面，所以相关伦理主要考虑的是风险与收益的问题，监管体系目前主要的任务是建立治疗标准以及监管这类手术不被滥用。这类手术的脱靶问题，在不同的平台，呈现的问题也不一样，这也是监管体系关注的问题。有关人类生殖医学的基因治疗，是目前监管最为严厉的试验。从伦理到法律，甚至延伸至社会问题，都是围绕着这个领域的基因治疗展开的。因此，有关基因编辑技术从基础研究到临床应用都需要进行全面的科学评估，这一点在政府、工业界、科学界以及与健康相关的协会组织都均已达成共识。生殖细胞的基因编辑，研究者已在动物身上成功地实现过，但如果将其使用于人身上那么就必须要求其安全且风险可控。进行这类研究的科学家之所以屡次触碰现有的监管体系，主要原因在于，人类的很多疾病是由单个基因造成，研究者仅需对他们的基因进行修饰即可改变他们日后可能出现的疾病，一方面是，基因编辑技术能够给患者带来福祉，另一方面，这种生殖细胞的基因编辑会遗传至下一代，由此迁出诸多伦理问题，原本这项技术影响到的仅是个人层面，转而变为更加复杂的社会以及宗教问题，因此政策制定者们需要认真地评估不同的文化标准，以及是否有能力建立管控不合理或滥用该技术的监管体系。因此，我们需要开展会议评估现有风险以及临床试验获益标准，并制定严格的监管体系。公众对这一话题的参与，也是促进科学以及医学进步的关键。在美国，监管体系并未放开编辑人类生殖细胞的闸口，因为美国食品与药品监督管理禁止“有关人类胚胎细胞进行的可遗传基因修饰。”而在另外一些国家，则会完全禁止这类研究。人类生殖细胞基因修饰规定，在调查的39个国家中，有25个国家法律禁止（粉色），4个国家明令禁止，9个国家不明确，1个国家限制性使用。无颜色，即不在此次调查范围内。图片来自Araki & Ishii Reproductive Biology and E 12:108生殖细胞的基因编辑应慎之又慎目前，对人类生殖细胞的基因编辑，仅需在下面的伦理框架下才被考虑。仅限于对严重疾病以及条件下使用；仅限于对病情以及状况充分认识下使用；有充分的临床前和临床数据，对患者的疾病风险和获益程度充分评估；有严格的临床监管，从而评估试验对患者的影响；最大限度地保护患者的隐私；如大规模使用，需考虑带来的社会风险。进行这类实验须遵如下几个原则：促进患者的健康福祉，将患者的利益最大化，同时将风险降为最低；透明，要求将所有信息公开透明，不仅对患者，对投资者同样需要透明公开；制定行为准则以及临床程序都需要拥有非常强而有力的依据；负责任的科学，既需要高水平的试验，同时也需要拥有良好的评估系统；尊重患者。随着基因编辑技术迅速普及到全球分子生物实验室，基因编辑技术的基础研究已非常普遍，体细胞基因编辑的临床应用目前处于初期，而未来有关生殖细胞基因编辑的临床应用可能会逐渐被接受。对此，我们应建立健全伦理体系。图片来源网络中国科学院动物研究所周琪院士是此次峰会中方代表之一，他表示“这一技术诞生后，短短几年间，就在生物医学基础研究、人口健康、农业育种和工业生产等方面发挥了重大作用。科技界和生物产业界已经形成共识：基因编辑将给基础研究和转化医学研究带来革命性变革，是下一代生物技术的核心”。鉴于基因编辑技术将带给人类治疗诸多遗传疾病的巨大潜力和好处，我们应该在规范的前提下鼓励和支持基因编辑研究。他呼吁要制定我国《基因编辑等颠覆性技术伦理指导原则》，因为这些技术一旦滥用则可能会引起巨大的伦理争议、影响国际形象、社会稳定和行业发展。“对无明显伦理争议且有重大应用价值的研究方向，支持在安全有序的基础上进行临床前研究和临床试验，对可能带来巨大伦理和社会问题的基因编辑工作，应设定严格的研究边界，禁止临床试验和应用。”编辑：姚迪（专家：纪十，科普作者，生命健康领域观察者，科普中国微平台原创首发）

基因编辑技术，可以用于编辑动植物甚至病毒的基因。通过改变基因让其改变性状，对人来说当然是有益的，不过目前这个技术并不完善。如果人类真正的掌握了基因编辑技术，那么就相当于掌握了任何物种的生物源代码，可以随意改变其性状向人类有益的地方发展。

ZFNZFN，即锌指核糖核酸酶，由一个 DNA 识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。DNA 识别域是由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般 3~4 个），每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。锌指蛋白源自转录调控因子家族（transcription factor family），在真核生物中从酵母到人类广泛存在，形成alpha-beta-beta二级结构。其中alpha螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性，骨架结构保守。对决定DNA结合特异性的氨基酸引入序列的改变可以获得新的DNA结合特异性。多个锌指蛋白可以串联起来形成一个锌指蛋白组识别一段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性，很适合用于设计ZFNs。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域(Kim et , 1996)。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性(Kim et , 1994)，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时（6~8 bp），两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到 DNA 定点剪切的目的。TALENTALENs中文名是转录激活因子样效应物核酸酶，TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。TAL效应子可被设计识别和结合所有的目的DNA序列。对TAL效应子附加一个核酸酶就生成了TALENs。TAL效应核酸酶可与DNA结合并在特异位点对DNA链进行切割，从而导入新的遗传物质。相对锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)而言，TALEN能够靶向更长的基因序列，而且也更容易构建。但是直到现在，人们一直都没有一种低成本的而且公开能够获得的方法来快速地产生大量的TALENs。CRISPRCRISPR是生命进化历史上，细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器，简单说就是病毒能把自己的基因整合到细菌，利用细菌的细胞工具为自己的基因复制服务，细菌为了将病毒的外来入侵基因清除，进化出CRISPR系统，利用这个系统，细菌可以不动声色地把病毒基因从自己的染色体上切除，这是细菌特有的免疫系统。微生物学家10年前就掌握了细菌拥有多种切除外来病毒基因的免疫功能，其中比较典型的模式是依靠一个复合物，该复合物能在一段RNA指导下，定向寻找目标DNA序列，然后将该序列进行切除。许多细菌免疫复合物都相对复杂，其中科学家掌握了对一种蛋白Cas9的操作技术，并先后对多种目标细胞DNA进行切除。以往研究表明，通过这些介入，CRISPR能使基因组更有效地产生变化或突变，效率比TALEN（转录激活因子类感受器核酸酶）等其他基因编辑技术更高。但最近研究发现，虽然CRISPR有许多优点，在人类癌细胞系列中，它也可能产生大量“误伤目标”，尤其是对不希望改变的基因做修改。三种系统的比较那么，可能会有人疑问了，既然如此，这三种系统的区别和联系又是什么呢？小编特意从有效性，特异性，载体性及其它四个方面，进行了一个小小的总结。有效性在不同的基因位点基因靶向性的有效性都是不同的，并且这也依赖于每种细胞的转染的效率。因此，只能点对点的比较靶向位点，细胞系和转染方法，这样的比较才有意义。基于我们课题组和其他课题组的ZFN和TALENs的靶向效率的实验，我们在细胞系水平上进行了比较，虽然他们可能与不同的突变特征有关。Chen的课题组的最近的研究进行了大规模的体外分析，发现TALENs在使用与上下游相关的序列的时候比ZFNs显著的具有更多的突变产生。另一个组比较了TALENs和CRISPRs在人类ESCs细胞中的情况，观察到，通过用CRISPR更换掉TALENs，在其他方面条件相同的情况下，通过产生更多的基因突变的克隆，本质上提高了效率。最近，功能上重新编码的TALENs（reTALENs）已经得到了发展，并且在人类的iPSCs细胞中的基因编辑的有效性相比较于CRISPR得到了提高。但是这个研究发现，CRISPR比reTALENs能够实现7-8倍的同源重组效率，并且其一定程度的比HE更有效率，挡雨ODN捐赠者进行比较。特异性ZFN和TALENs都是作为二聚体发挥作用的，其特异性是由DNA绑定的区域决定的，这个区域在每个剪切位点最多可以识别36bp。然而，在在II型CRISPR系统中的Cas9是由一种RNA引导的核酸，它的特异性是由PAM和PAM上游的20个引导核苷酸决定的。这表明，3’12个碱基的“种子序列”是最关键的，而剩下的8个碱基（非种子序列）甚至PAM序列都是可以错配的。ZFN的特异性由一种不带偏见的全基因组分析进行，并且发现存在频率低，但是可以检测到的脱靶事件的发生，其可以定义为一个高度有限的一部分。已经有研究表明，TALENs有比ZFN更低的细胞毒性和脱靶效率。基于这个研究，TALENs诱导的CCR5特异性突变在CCR5的对偶基因上发生率是17%，而在高度同源的CCR2位点上只有1%。相反，CCR5特异性的ZFN的活性在这两个位点是相在当的，CCR5位点的突变频率是14%，而CCR2的是12%。几个研究也报告了，CRISPR/Cas系统在细胞毒性评价或者DSB诱导的检测（即，H2AX免疫染色）中都没有明显的脱靶现象。然而，最近的研究发现，CRISPR诱导的靶向不同的人类细胞的基因出现了显著的脱靶现象。例如，靶向CCR5的CRSIPR/Cas9系统偶到的在CCR2上的脱靶切除的突变率为5-20%，这是非常接近之前讨论的CCR5靶向的ZFN诱导的突变率。三个其他的小组利用更系统的方法在人类细胞中评估了CRISPR的脱靶活性，其结果表明CRISPR可能能够发生目标不匹配，从而在预测的脱靶位点上引入微缺失或者插入（插入缺失）。此外，靶向位点的定位和内涵能够显著的影响gRNA识别他们的靶向目标，而在基因组序列中的“脱靶序列”也是一样的。已经有报告说，脱靶效应能够通过小心的控制Cas9的mRNA的浓度来克服。此外，在基因编辑的时候使用配对的Cas9的切口酶已经表明能够显著的减少至少1500倍的脱靶活性。病毒为基础的传递ZFN基因可以通过慢病毒和腺病毒进行传递。当前，ZFNs导入体细胞是通过共转染两个慢病毒载体，每个载体编码一个功能性异源二聚体对的一个单体。相反，腺病毒，但不是基于HIV的慢病毒，载体使用与TALEN的基因的传递，因为TALENs的大尺寸和TALE重复序列的种应用。Cas9也是一个较大的基因，并且其酶促死的版本也可以通过慢病毒进行传递，虽然也盛行的Cas9的稳定的表达对于细胞的毒性依然是不清楚的。其他方面ZFNs和TALENs都能够在切割时产生粘性末端，因此可以使用标签绑定，如果具有互补突出部分的双链寡聚核苷酸（dsODN）是可以进行预测的。ZFNs和TALENs都可以在捐赠的质粒的基因组中引入同一个核酸靶向位点来实现。ZFNs和TALENs通过采取同源二聚体的方式从而获得优势，绑定门通过设计实现了重组（Ob-LiGaRe）。这种方法在使用的质粒中倒置了两半的核酸酶的结合位点，这是在没有改变接头区的方向实现的，因此通过相同的ZFN/TALEN碱基对能够阻止连接产物的消化。因为CRISPR产生了一个非粘性末端，直接连接会遇到挑战。最近的文章表明，具有Cas9n的gRNAs的碱基对能够诱导具有徒步部分的DSBs，并且促进dsODN的高效率的NHEJ介导的插入。虽然至今还没有出版，但是进入的转基因大小的DNA能够通过引入在目标质粒的CRISPR/Cas9靶向位点的具有CRISPR/Cas的基因组使用。CRISPR/Cas系统相比较于ZFNs和TALENs具有几个优势，例如易于构建，花费低，并且产物具有可扩展性，并且能够用于多个靶向基因组位点。

基因编辑可以应用在生物科学领域，来帮助人类解决一些难以解决的疾病。对人体是有益的。