CRH介导妊娠期慢性应激致子代雄鼠抑郁

抑郁症是一种常见的心境障碍，实验研究[1]显示，抑郁的发病与下丘脑、杏仁核、大脑皮层和海马等部位异常有关。本课题组前期研究[2]显示，妊娠期慢性应激可引起子代雄鼠呈现抑郁症状，但其机制不明。促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone，CRH)主要由下丘脑室旁核分泌，大脑皮层、杏仁核、海马等脑组织也表达一定量的CRH[3]。以往研究[2,4]显示高水平CRH可能与抑郁的发生有关，但CRH是否介导妊娠期慢性应激致抑郁尚不清楚。因此，该研究拟用妊娠期慢性不可预见性复合应激建立子代雄鼠抑郁模型，并用CRHR1拮抗剂(antalarmin)对子鼠进行干预，观察子代雄鼠抑郁程度并进一步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 antalarmin hydrochloride(美国Sigma公司)；雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)单克隆抗体(美国Abcam公司)；β-actin单克隆抗体、山羊抗兔二抗、化学发光检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；小鼠CRH酶联免疫试剂盒(武汉华美生物公司)；电泳仪、凝胶成像分析系统(北京Tanon公司)；强迫游泳图像采集及分析系统(上海欣软公司)；旷场实验图像采集及分析系统(荷兰Noldus公司)。

1.2 实验动物与分组 8周龄SPF级小鼠，雌性40只，雄性10只，由安徽医科大学实验动物中心提供。遵循安徽医科大学生物医学伦理委员会动物饲养要求，室温为(23±1)℃，摄食饮水自由，50%的相对湿度，饲养1周。按照雌雄比例2 ∶1在晚上19:00合笼，第2天早上07:00前检查阴栓，查到阴栓的小鼠单独饲养，并标记为受孕第1天，并将孕鼠按2 ∶1随机分为慢性应激组和正常处理组。慢性应激组正常饲养1周，受孕第8天施加应激：束缚、禁水(24 h)、夹尾(5 min)、温水游泳(30 ℃，15 min)、禁食(24 h)、改变居住环境(让鼠在潮湿的垫料上生存24 h)、冰水游泳(4 ℃，5 min)等7种应激方式。小鼠每天随机接受一种应激方法(禁水、禁食除外)，直至小鼠分娩。正常处理组正常饲养即可。子代雄鼠母乳喂养21 d断奶，随机分为三组(n=10)：正常对照组(Control组)、产前应激+溶剂对照组(CPS组)、产前应激+CRHR1拮抗剂组(CPS+ANT组)，CPS+ANT组子代雄鼠于产后21～41 d每天腹腔注射微量CRHR1拮抗剂[5](20 μg/g)，CPS组和Control组注射等量的生理盐水。

1.3 行为学实验

1.3.1 旷场实验 每组随机选取8只子代雄鼠于产后45 d进行旷场实验，在实验的过程中确保实验室安静，旷场实验时将小鼠转移至试验箱的中央，于2 min后开始测试，记时3 min，记录小鼠爬行总路程、平均速度、穿越象限次数、站立次数。每结束一次实验，用酒精擦拭旷场实验箱并清理小鼠的粪便和尿液，待酒精挥发完，再换下一只小鼠进行实验。

1.3.2 强迫游泳实验 每组随机选取8只子代雄鼠于产后47 d进行强迫游泳实验，第1天将三组小鼠置于装有25 ℃水的钢化玻璃桶中游泳15 min(水深30 cm，直径20 cm)，一次实验只能用一只鼠，以免小鼠互相影响。第2天，随机将子代雄鼠放入装有水的钢化玻璃桶中(水深及温度与前1 d相同)，录像、记录并观察小鼠6 min内后4 min小鼠在桶内禁止不动时间，即小鼠在水面漂浮不动或仅有四肢微小的动作维持身体平衡的时间。

将式(4)傅立叶展开,可得一次谐波和二次谐波的系数分别为:If=Ioη;I2f=-kαoCLIo,可见一次谐波中含有光强信息,二次谐波中则含有气体浓度信息。令二次谐波和一次谐波的比值则m值既包括了气体浓度信息,同时消除了半导体激光器初始光强的影响[1-3]。因此本文重点为求取光源通过被测气体后的二次谐波和一次谐波强度的比值,并将此比值与标准仪器测量的气体浓度进行标教比对,确定甲烷气体浓度的计算公式。

1.3.3 糖水偏好实验 每组随机选取4只子代雄鼠于产后50 d进行糖水偏好实验，小鼠单笼饲养在安静的鼠房内，每笼放置两个水瓶(大小、形状，颜色相同)。第一个24 h，两瓶都放置相同重量1%的蔗糖水，使小鼠适应蔗糖的甜味；第二个24 h，让小鼠适应两种不同甜味的饮用水，其中一瓶装有1%的蔗糖溶液，第二瓶装有相同体积的饮用水；第三个24 h，禁食禁水24 h，随后给予相同重量的蔗糖水和纯水进行糖水偏好实验，24 h后对两水瓶进行称重，计算糖水偏好率。

1.7 统计学处理 应用SPSS 18.0软件对数据进行分析，并用表示，三组数据采用单因素方差分析，每组之间比较采用LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

Different dimensions of lexical knowledge are related to each other in the way that enables their participation in the overall schemeof meaningconstruction and languageuse.

1.6 ELISA法检测海马CRH水平 用研磨机将海马研碎，按照说明书离心取海马组织上清液并测量海马组织CRH浓度。

首先，使用sqlite3_open()函数，打开数据库，创建一个连接对象；其次，使用sqlite3_prepare_v2()函数，准备一个statement，接收SQL语句，并将其编译为虚拟数据库引擎（VDBE）可读的字节码；接着，使用sqlite3_step()函数，接收语句句柄并直接与VDBE通信，生成执行SQL语句的一个有一个步骤的字节码指令，直到游标到达结果集末尾；完成执行后，使用sqlite3_finalize()函数，释放资源；最后，由sqlite3_close()函数关闭数据库连接。

1.4 HE染色观察病理形态学改变 所有行为学实验结束后，随机选取5只小鼠，眼球取血，颈椎脱臼处死，在冰上取脑。用4%多聚甲醛将取下来的脑组织固定，然后脱水、包埋，最后于前囱后3 mm作6 μm的冠状切片。应用HE染色技术将每组相同位置的脑组织切片进行染色，每组取6张，在显微镜下观察海马CA3区神经元的形态变化，拍照保存。然后用Image-Pro Plus Image 软件计算出神经元的数目并求出平均值。

2 结果

CRH神经元处于HPA轴顶端、具有整合心理和物理刺激的功能，被公认为是应激反应的中枢驱动力[6]。CRH主要由下丘脑室旁核分泌，大脑皮层、海马、杏仁核等脑组织也表达一定量的CRH[7]。本研究结果显示，CPS组较Control组海马组织CRH浓度上升，说明妊娠期慢性应激可致子代海马组织CRH升高。

2.2 CRHR1拮抗剂改善妊娠期慢性应激所致的子代雄鼠海马CA3区神经元病理改变 HE染色结果显示，Control组小鼠海马CA3区神经元染色清晰，数量相对较多，排列紧密，细胞核表现出圆形，核仁较明显；CPS组神经元排列疏松，数量相对较少，脱失现象明显，部分细胞核浓染、固缩。CPS+ANT组小鼠海马CA3区神经元染色清晰，数量较多，呈椎体状、圆球状，细胞核呈圆形，核仁明显。用Image-Pro PlusImage分析软件计数海马CA3区神经元总数，结果显示与Control组(173.000±8.888)相比，CPS组(85.667±8.737)神经元总数明显减少(P<0.05)；与CPS组相比，CPS+ANT组(171.667±6.506)神经元总数明显增多(P<0.05)。见图1。

1.5 Western blot法检测海马组织mTOR的表达量 冰上取脑结束后，将取出的全脑在冰上进行海马剥离，置于匀浆机中，提取总蛋白，应用BCA试剂盒测定海马组织蛋白的总浓度并定量，变性10 min。灌制8%的胶，每孔上样28 μg；电泳(60 V/50 min，120 V/300 min)；转膜(200 mA/300 min)；室温封闭1.5 h；洗膜3次；一抗4 ℃孵育24 h；洗膜3次，二抗室温孵育1.5 h；洗膜，滴加显影液，测量条带的光密度值。所用抗体浓度：一抗 β-actin(兔单抗，1 ∶2 000)、mTOR(兔单抗，1 ∶1 000)，二抗(羊抗兔，1 ∶2 000)。

2.3 CRHR1拮抗剂上调妊娠期慢性应激子代雄鼠海马下降的mTOR的表达 Western blot结果显示，与Control组相比，CPS组小鼠海马组织mTOR表达量减少(P<0.05)；与CPS组相比，CPS+ANT组小鼠海马组织的mTOR表达量增加(P<0.05)；Control组与CPS+ANT组小鼠海马组织mTOR表达量差异无统计学意义。见图2。

2018年初国家统计局公布的数据显示：2017年农民工总量达28652万人，1980年后的新生代农民工占农民工总量的50.5%，老一代农民工占全国农民工总量的49.5%,可见,新生代农民工正在成为农民工主力。新生代农民工是指1980年以后出生的、户籍在农村的劳动者，他们主要从事第二、第三产业劳动。这些新生代农民工相对于第一代进城务工的农民工，这个群体除了自身条件的改善以外，还在工作责任、工作要求和工作环境等方面正发生着许多积极的变化，这个群体正成为农民工群体的主要中坚力量，也是当代我国产业工人、特别是建筑工人的重要组成部分。

穿过格斗笼拍摄是一个好主意，使这幅作品看起来尤为别致。网眼的清晰度处理的正合适，透过网眼，画面正确对焦在了Dylan的脸上。苛刻地说，如果这幅作品里能同时看到Carys的两条腿就更完美了。但“不完美”本就是拍摄动态场景的精髓所在，你几乎不可能完全掌控所有的元素，只能在机会出现的时候，尽可能地把握住它。虽然Craig自己还不太满意，但他已经做得很出色了！

2.4 妊娠期慢性应激致子代雄鼠海马CRH水平升高 ELISA法检测小鼠海马CRH结果显示，3组子代雄鼠海马CRH浓度差异有统计学意义，与Control组相比，CPS组子代雄鼠海马CRH水平升高(P<0.05)；与CPS组相比，CPS+ANT组小鼠海马CRH水平降低(P<0.05)，见图3。

3 讨论

2.1 CRHR1拮抗剂抑制妊娠期慢性应激致子代雄鼠抑郁 与Control组相比，CPS组强迫游泳实验中小鼠不动时间增多(P<0.05)；糖水偏好实验中糖水偏好率下降(P<0.05)；旷场实验中鼠爬行总路程、平均速度、穿越象限次数、站立次数减少(P<0.05)；与CPS组相比，CPS+ANT组强迫游泳实验中小鼠不动时间减少(P<0.05)，糖水偏好率增高(P<0.05)，旷场实验中鼠爬行总路程、平均速度、穿越象限次数、站立次数增加(P<0.05)。见表1。

表1 CRHR1拮抗剂抑制妊娠期慢性应激致子代雄鼠抑郁

组别不动时间(s,n=8)糖水偏好率(%,n=4)爬行总路程(m,n=8)平均速度(m/s,n=8)穿越象限次数(n=8)站立次数(n=8)Control74.49±17.0092.49±1.8316.64±4.740.09±0.02697.14±28.2237.57±7.14CPS153.56±27.00*83.87±1.41*9.07±1.89*0.05±0.010*55.57±15.77*27.71±5.77*CPS+ANT46.95±21.67#90.49±2.74#14.43±2.62#0.08±0.015#81.86±19.23#39.71±10.32#F值43.24819.0219.6489.5266.5624.509P值<0.0010.0010.0010.0020.0070.026

与Control组比较: *P<0.05;与CPS组比较:#P<0.05

图1 CRHR1拮抗剂改善妊娠期慢性应激所致的子代雄鼠海马CA3区神经元 HE×40

A:Control组；B:CPS组；C:CPS+ANT组

图2 CRHR1拮抗剂上调妊娠期慢性应激子代雄鼠海马下降的mTOR的表达量

与Control组比较:*P<0.05;与CPS组比较:#P<0.05

图3 妊娠期慢性应激致子代雄鼠海马CRH水平升高

与Control组比较:*P<0.05;与CPS组比较:#P<0.05

强迫游泳实验、糖水偏好实验和旷场实验是目前测量小鼠抑郁程度的常用实验。实验很好的分析了小鼠的无助程度、对快感缺乏的程度和在新环境中的探索行为。本研究行为学实验显示CPS组子代雄鼠较Control组小鼠静止漂浮时间增多；糖水偏好实验中糖水偏好率下降；旷场实验中鼠爬行总路程、平均速度、穿越象限次数、站立次数减少。CPS+ANT组较CPS组小鼠静止漂浮时间减少，糖水偏好率上升，旷场实验中鼠爬行总路程、平均速度、穿越象限次数、站立次数增多。说明妊娠期慢性应激导致子代雄鼠行为学改变，使子代雄鼠产生抑郁样行为，CRHR1拮抗剂可逆转妊娠期慢性应激致子代雄鼠抑郁，提示CRH介导了妊娠期慢性应激致子代雄鼠抑郁。

实验研究[8-9]显示，海马部位异常与抑郁的发病有关，其中CA3区与抑郁的形成密切相关。因此该区神经元数目、形态结构和功能的改变必然会导致行为学的改变。本实验的海马CA3区HE染色结果显示，CPS组较Control组海马CA3区神经元数量明显减少，并且排列疏松紊乱，异常神经元明显增多，部分细胞核浓染、固缩，而CPS+ANT组较CPS组海马CA3区神经元染色清晰，数量较多，核浓染、固缩减少。说明CRHR1拮抗剂逆转妊娠期慢性应激致子代雄鼠海马CA3区神经元损伤，提示CRH致海马CA3区神经元损伤可能是妊娠期慢性应激致子代雄鼠抑郁的原因。

mTOR信号通路是调控细胞生长与增殖的一个关键通路，该通路将从营养分子、能量状态以及生长因子传来的信号整合在一起，从而调控生命过程。mTOR分为mTORC1 和mTORC2，mTORC1信号在调节神经元的存活和分化、树突的长度和分支、轴突的生长和突触的可塑性中发挥重要作用，同时也介导抑郁的发病[10-11]。本研究显示，CPS组较Control组海马mTOR明显下降，CPS+ANT组较CPS组海马mTOR明显上升并接近Control组水平。说明CRH受体拮抗剂可上调mTOR水平。提示妊娠期慢性应激通过升高的CRH下调mTOR的表达进而致子代雄鼠抑郁。

本研究结果还显示， CPS+ANT组较CPS组海马组织CRH浓度下降，提示CRHR1拮抗剂可以降低海马CRH水平，其机制是否与CRHR1拮抗剂下调糖皮质激素浓度有关尚不清楚，有待于进一步研究。

综上所述，CRH介导了妊娠期慢性应激致子代抑郁[12-13]，其机制可能与妊娠期慢性应激致子代海马CRH升高，下调mTOR蛋白表达，进而引起海马 CA3 区神经元损伤有关。

（六）基本建设投资预算执行进度慢。地方普遍反映，切块管理的基本建设投资单独安排、财政部门不参与，导致有限的财政资金常处于等计划、无法及时下达预算的状态，财政资金的运作效率受到很大影响。具体来说，省级切块管理的基本建设投资主要来自两部分：一部分是中央基本建设投资的转移支付，这部分资金往往在预算年度中间甚至年底才追加下达，严重影响了预算执行。另一部分是省级预算中切块管理的基本建设投资，由于本省人民代表大会年初批准预算时并无具体项目，项目投资在预算执行过程中，预算无法及时下达。

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