DBA/2J小鼠耳蜗毛细胞静纤毛早期的形态结构变化*

年龄相关性听力损失(age-related hearing loss,AHL)即增龄性聋,是听觉器官随着年龄的增加而退变,出现双耳对称性、渐进性听力减退,是由环境因素和基因变异导致的复杂的病理学改变[1]。AHL是人群中最为常见的听觉系统疾病之一,影响着全球数千万人的生活[2]。DBA/2J小鼠是研究AHL常用的动物模型,其听力受损发生较早且呈渐进性。扫描电镜在DBA/2J小鼠成年周龄之前毛细胞静纤毛的研究中应用相对较少。Shin等[3]报道了DBA/2J小鼠1月龄到6月龄的扫描电镜低倍镜下可见底回毛细胞静纤毛出现渐进性丢失,但并未报道高倍镜下单个毛细胞静纤毛的病变过程;Perrin等[4]报道了DBA/2J小鼠5周龄时耳蜗底回到顶回外毛细胞静纤毛长度的改变,但并未详细观察其他周龄的底回外毛细胞静纤毛的变化情况。本研究通过扫描电镜观察低周龄DBA/2J小鼠耳蜗毛细胞顶端的纤毛的超微形态结构变化,旨在探讨早发性听力受损的病因及其机制。

湖北省复杂多变的地形地貌和热带季风性湿润气候的特征为苔藓的生长创造了良好的自然条件，蕴育着丰富的苔藓植物资源。

1 材料和方法

1.1 动物及试剂

选购DBA/2J小鼠15只(南京大学—南京生物医药研究院),将雌雄小鼠按照2∶1比例合笼。待新生小鼠周龄达到2、4周龄和8周龄时,每个周龄随机取6只小鼠并使用1%戊巴比妥钠(0.25ml/kg)腹腔注射麻醉后进行听力测试及内耳耳蜗取材。1%戊巴比妥钠(北京普博斯生物);2.5%戊二醛及1%锇酸(滨州医学院医药研究中心电镜室提供);EDTA Na2(北京索莱宝)。

1.2 脑干诱发电位(auditory brainstem response,ABR)测试小鼠听力

将小鼠麻醉后置于隔音室(可屏蔽电场和磁场),并置于加热垫上(维持体温在37℃～38℃),使用脑干诱发电位仪(Miami,美国)测试小鼠听力。信号采集细针电极分别插到小鼠头顶、右耳腹侧和左耳腹侧的皮下。检测刺激频率分别为click(复合音)、8、16kHz以及32kHz时的ABR阈值。

1.3 内耳-耳蜗标本处理

小鼠麻醉后在立体显微镜(S6D型,莱卡,德国)下解剖颞骨,取出完整的内耳。参照 Men等[5]及孙建和等[6]的耳蜗扫描电镜样本制作方法,将取出的内耳用2.5%戊二醛中4℃固定并过夜后用10% EDTA-Na2于室温下脱钙16h。修剪内耳耳蜗基底膜使毛细胞暴露完全并置于0.1mol/L PBS中清洗过夜。第3天,1%锇酸后固定40min再进行梯度乙醇脱水。CO2临界点干燥后在真空离子喷溅仪中(Q 150R S型,Quorum,英国)喷金镀膜15～20nm。最后将样品放入扫描电镜高真空观察舱内等待观察。

1.4 扫描电镜观察

结果显示,DBA/2J小鼠听力阈值呈现渐进性升高,表明其听力受损逐渐加重(图1)。ABR阈值水平高于55(click)、40(8kHz)、35(16kHz) 或60(32kHz) dB SPL时认为有听力受损。早在4周龄,DBA/2J小鼠在各个音频刺激下均出现听力受损;8周龄时,无论click(复合音)刺激还是短纯音刺激下其ABR阈值均高于60dB SPL(60～80dB SPL为中级听力受损)。

1.5 统计学处理

作为听觉感受器细胞的内耳耳蜗毛细胞及其纤毛的渐进性丢失是增龄性聋的主要病理过程之一[7]。毛细胞顶端的静纤毛在声音传导过程中起到了不可缺失的作用。静纤毛能感受声波刺激引起毛细胞的信号转换作用,将机械信号转换成电信号,产生听觉。如果纤毛出现病变将导致听力受损。Shin等[3]研究认为,DBA/2J小鼠2周龄耳蜗底回毛细胞静纤毛没有缺失,1月龄到6月龄的低倍镜下可见纤毛束出现渐进性丢失。本研究结果显示,在扫描电镜600倍镜下DBA/2J小鼠2周龄耳蜗底回毛细胞静纤毛排列规则,未见缺失。OHC静纤毛呈倒“V”型多行排列,IHC静纤毛呈单行“一”字型排列。2周龄时,在扫描电镜2000倍镜下小鼠毛细胞纤毛束顶端可见散在点状高亮影,扫描电镜10000倍镜下可见高亮影为几根纤毛束的融合。

3)试算结果表明，在同等高度情况下，斜放四角锥网架受力性能和刚度优于正方四角网架，并且焊接球节点数量较少，因此本工程阀厅屋盖采用斜放四角锥三层网架。整体模型计算表明，优化设计后的网架屋盖用钢量仅为57 kg/m2，具有良好的经济性。

2 结果

2.1 ABR测试

将制备好的耳蜗样品在扫描电镜(EVO MA 15/LS型,卡尔蔡司,德国)下观察。分别采集连续3个视野下的×600、×2000以及×10000镜下放大的扫描电镜图片。

动物模型通常作为研究年龄相关的遗传和生理基础疾病的重要工具[7]。DBA/2J小鼠是被公认的AHL动物模型,该小鼠模型不仅表现为年龄相关性、渐进性听力受损,而且之前的报道其伴有较为严重的早发性听力受损。DBA/2J小鼠在3周龄时已表现出听力损失,其听力阈值上升15～20dB SPL,在14周龄时接近全聋[8]。DBA/2J小鼠在2个月就有严重的听力损失,16kHZ的纯音刺激下其ABR阈值高于60dB SPL[9]。本研究ABR测试结果也证实了DBA/2J小鼠确实存在渐进性听力受损,尤其是4周龄以后(小鼠可以测听最小周龄为3周)。因此,研究该模型小鼠的早发性听力损失的原因对于其治疗和改善听力损失有着重要作用。

2.2 扫描电镜观察

2.2.1 2周龄时静纤毛总体排列尚且规则 2周龄小鼠静纤毛排列规则,没有出现纤毛束的缺失。在600倍镜下,2整个耳蜗底回静纤毛排列规则,可见外毛细胞(out hair cells,OHC)静纤毛呈倒“V”型3行或者4行排列,内毛细胞(inner hair cells,ZHC)静纤毛呈单行排列(图2A)。

2.2.2 纤毛束出现融合变化 在2000倍镜下,2周龄的DBA/2J小鼠OHC静纤毛已出现部分纤毛束的融合病变,单根纤毛束之间的界限变模糊,甚至有的数根纤毛融合成团块状或者球状,在扫描电镜下为高亮的点状(图2B)。纤毛束在4周龄时融合更为严重,电镜下可见大面积的纤毛束呈团块状高亮区(图2C)。同样IHC静纤毛也表现出类似的变化,纤毛束出现球状融合(气球样变)(图2B、C)。

  

图1 听觉脑干反应平均阈值的时间变化曲线(n=6)Fig 1 Time curves of mean ABR thresholds (n=6)

2.2.3 纤毛束出现软化 2周龄的DBA/2J小鼠OHC静纤毛已出现纤毛束的软化,但未见纤毛束的倒伏。在10000倍镜下显示小鼠OHC静纤毛上端软化,部分纤毛束出现弯曲,但未出现整体纤毛束的倒伏;IHC静纤毛除了纤毛束的无规律排布和部分融合外未见明显软化弯曲(图2E)。

2.2.4 纤毛束出现严重倒伏 4周龄的DBA/2J小鼠静纤毛出现严重的倒伏。无论OHC静纤毛还是IHC静纤毛均呈倾倒的“C”型,纤毛束严重弯曲倒伏贴于毛细胞上端的顶盘上(图2C、F)。4周龄时即使纤毛束出现严重倒伏但并未出现倒“V”型纤毛束的大面积缺失(偶有缺失)。

2.2.5 纤毛束出现严重缺失 8周龄的DBA/2J小鼠倒“V”型纤毛束出现较为严重缺失(区域性),且纤毛束融合更为严重(图2D),尤其OHC静纤毛束融合更为明显,已无法辨别单根纤毛(图2G)。

3 讨论

He could say things like, “Let’s go to the car” or “Let us go for a walk” in French.他能用法语说“我们去开车吧”或“我们去散步吧”之类的话。

  

图2 DBA/2J 小鼠耳蜗毛细胞静纤毛超微形态,扫描电镜。A：×600; B～D：×2000; E～G：×5000Fig 2 Ultramicroscopic morphology of cochlea hair cell stereocilia of DBA/2J mice,scanning electron microscopeA：×600; B-D：×2000; E-G：×10000.A-D：HCs; E-G：OHCs.A,B,E: 2 weeks; C,F: 4 weeks; D,G: 8 weeks.HCs: Hair cells; OHCs: Out hair cells

3.1 纤毛的渐进性丢失是增龄性聋的主要病理过程之一

实验数据用SPSS 18.0进行统计分析,所有数据以表示,误差线表示标准偏差(SD)。

Perrin等[4]的研究认为,DBA/2J小鼠5周龄时耳蜗底回OHC静纤毛长度变短,但并未报道5周龄之前的纤毛变化情况。本研究结果显示,早在2周龄时的扫描电镜10000倍镜下可见DBA/2J小鼠耳蜗底回静纤毛不仅有融合变化而且出现软化,4周龄时虽然未见倒“V”型纤毛束整体缺失但纤毛束整体倒伏较为严重,并且出现单根或者几根的纤毛丢失,无论OHC静纤毛还是IHC静纤毛均如此。

反思性教学的反思对象主要是教学内容与方法，为了揭示反思过程中的问题，可以设计一份调查问卷，用以获得第一手的数据和资料。教育实践中，可以从以下两个方面设计问卷的内容：第一，设计一份面向教师的问卷。在教学活动中，可以针对教学实际设计一份针对老师的教学内容，用作评估其教学内容充足性、教学方法合理性、学生学习需求满足性的依据。第二，设计一份面向学生的问卷，通过问卷，了解学生的学习诉求，并从侧面反映出教师的授课情况。基于问卷调查，能够发现平时无法发现的教学问题，为教师和学生进行改进提供参考和依据。

本研究结果显示DBA/2J小鼠4周龄时未见倒“V”型纤毛束明显缺失,但纤毛束整体倒伏较为严重;8周龄时出现大面积的倒“V”型纤毛束的丢失。笔者认为,早期毛细胞纤毛束的融合和软化最终导致其严重倒伏,进而出现纤毛束的渐进性缺失。这些结果导致毛细胞静纤毛对声波刺激的反应减弱,进而影响听觉的产生,随着年龄的增加表现为严重的听力受损。

3.2 基因缺陷是导致DBA/2J小鼠毛细胞纤毛束损害主要因素

在基因水平上,DBA/2J小鼠出现早期听力受损的原因除了Ahl基因位座上被命名为Cdh23 (钙黏蛋白CDH23)等位基因的突变外,还有位于Ahl 8基因位座上被确认的fascin-2(交联蛋白FSCN-2)基因的突变[10]。CDH23是钙黏蛋白超家族的成员之一,它表达于感觉神经上皮细胞表面,被认为与耳蜗毛细胞静纤毛的结构和毛细胞束的形成有关[11-13]。fascin-2基因表达肌动蛋白交联蛋白(FSCN-2),FSCN-2 蛋白大量存在于毛细胞静纤毛,集中分布于纤毛束的顶端,维持静纤毛的长度和硬度[14]。

本研究结果显示,早在2周龄的DBA/2J小鼠就出现纤毛束软化,4周龄出现纤毛束倒伏,推测其早发性听力受损可能是fascin-2基因的突变所产生的贡献更多。因此,笔者认为,DBA/2J小鼠由于fascin-2基因和Cdh23基因功能降低,导致其出现渐进性的纤毛束的软化和倒伏以及缺失,造成了小鼠听力的早期受损。

综上所述,本研究通过观察2、4周龄及8周龄时DBA/2J小鼠毛细胞静纤毛的超微形态结构改变,观察到纤毛束融合、软化以及严重的倒伏甚至缺失等现象,笔者认为这些形态学的改变是造成了DBA/2J小鼠的早发性听力损害的重要因素。

参 考 文 献

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