基于综合生物标志物响应评价苯并芘对脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)的毒性效应*

苯并[a]芘(benzo[a]pyrene,BaP)是一种具有很强的致畸、致突变等毒性效应的多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)类污染物,主要来源于有机物质的高温分解和不完全燃烧,在人类活动的影响下,已经广泛存在于海洋环境中(Ren et al,2015)。BaP在水体中以溶解态、吸附于悬浮颗粒物或者与其他物质结合的状态存在,海洋生物鳃的呼吸作用,即水体暴露是海洋生物吸收BaP的主要途径,也可以通过生物体的表皮渗透或者摄食活动进入生物体内,由于BaP易溶于脂肪,BaP能快速进入生物体组织,并且不易排出生物体外(Wang et al,2005)。BaP本身毒性不大,化学性质活性较弱,但在生物体内各种新陈代谢酶的作用活化后,代谢产物会对生物体产生各种毒害作用(Haasch et al,1993)。生物标志物是反映污染物对生物体早期影响的灵敏性分子生态毒理学指标,环境中污染物的毒性效应可以通过生物标志物的变化进行评价(Lam et al,2003)。Da Silva Rocha等(2012)利用 7-乙氧基异吩噁唑酮-脱乙基酶(EROD)作为生物标志物评价了不同浓度BaP暴露对大西洋虾(Xiphopenaeus kroyeri)肌肉组织的毒性效应;Banni等(2009)利用一相代谢酶EROD、二相代谢酶谷胱甘肽硫转移酶(GST)活性变化研究了BaP暴露对金头鲷肝脏的毒性效应;任加云等(2006)利用超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)等抗氧化酶的活性、脂质过氧化(LPO)含量的变化研究了栉孔扇贝(Chlamys farreri)消化盲囊和鳃丝对 BaP暴露的响应。但不同生物标志物对污染物的敏感程度存在差异,且随时间变化而变化,孤立分析某一种生物标志物对污染物暴露的响应并不能有效地评估其对生物的毒性效应,综合生物标志物响应(Integrated Biomarker Response,IBR)指数能够评价多种生物标志物的综合响应,避免各类生物标志物响应不同步引起的评估结果的偏差与不准确性,更全面的评价污染物对生物的潜在影响。Kim等(2016)通过 IBR定量评价了虾类(Cyprinus carpio)中多种生物标志物对多环芳烃短时间暴露的响应;Hou等(2016)应用IBR评价了ZnO 纳米颗粒对生物膜的抗氧化酶的生态毒性;蒋玫等(2015)应用IBR评价了0号柴油对黑鲷(Sparus macrocephalus)的毒性效应。脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)是一种重要的养殖经济虾类,但目前国内外研究未见基于 IBR评价BaP对脊尾白虾的毒性效应。

本研究通过BaP暴露下脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织生物标志物(EROD、GST、SOD、CAT、MDA)的变化情况,运用IBR定量评价BaP胁迫对脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织的毒性效应差异,分析探讨脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织对BaP胁迫的响应并探讨其致毒机理,为脊尾白虾的健康养殖,生物质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

海水取自启东市自然海区,经过沉淀、砂滤、消毒后使用(盐度 21,pH 8.1);脊尾白虾由江苏省金海岸水产研究所提供,平均质量为(2.71±0.43)g,实验前驯养 15d;实验容器为 150L的玻璃缸;BaP购自Sigma公司(USA),使用丙酮作为助溶剂配置成母液。

1.2 实验方法

通过预实验确定 BaP暴露下脊尾白虾全部死亡和全部存活的浓度,以此为依据,设置2组实验浓度(0.45μg/L,0.05μg/L),另外设置1组海水对照组,1组丙酮对照组(丙酮体积比＜0.01%),每组设 3个重复;分别放置 70尾脊尾白虾,24h充氧(溶解氧含量＞5mg/L),实验期间水温保持为(21±0.5)℃,每组加入100L海水,每 24h时 100%换水一次,注意观察,及时将行为异常或者死亡的受试生物捞出,每天定时定量喂食配合饲料;分别于第0、1、5、10、15天采集 10尾样品,取肝胰脏、肌肉组织并迅速保存在液氮中。

1.3 样品制备与毒理学指标的测定

1.3.1 样品制备 将样品置于匀浆缓冲液中(0.15mol/L KCl,20%(体积分数)甘油,pH 为 7.4的0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液),于冰浴中充分匀浆,然后将匀浆液在4℃、10000r/min条件下离心20min,取上清液分别测定酶活性。

实习后期的主要压力源来自就业。实习后期，实习护生在应对日益繁重的实习任务之余，还需为未来做准备。当前就业的供需矛盾及部分护生过高的就业期望，使许多实习护生精疲力竭(“才发现护理专业也不是我们想象中那样好就业”[2]，“竞争那么激烈，找个编内工作实在太难了”[6])。

1.4 数据的处理和分析

0.45μg/L、0.05μg/L实验组脊尾白虾肝胰脏组织的SOD活性均呈现逐渐上升的趋势,0.45μg/L实验组SOD活性从第 5天开始显著高于对照组(P＜0.05),0.05μg/L实验组SOD活性从第10天开始显著高于对照组(P＜0.05),在第 15天达到峰值时两个实验组SOD活性分别为第0天的3.04倍、2.38倍(图3a)。0.45μg/L、0.05μg/L实验组脊尾白虾肌肉组织的SOD活性均呈现先上升后下降的趋势,0.45μg/L实验组SOD活性在第 5天时显达到峰值并著高于对照组(P＜0.05),为第 0天的2.37倍,0.05μg/L实验组SOD活性在第 5天时显达到峰值但与对照组并无显著性差异(P＞0.05),为第0天的1.72倍(图3b)。

IBR方法参照Kim等(2016)进行,首先计算其在每个取样时间点测定结果的平均值(xi)以及在所有取样时间点测定结果的总平均值()和标准差(s),按下式对每个取样点的xi进行均一化处理:

 

各实验组脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织IBR值随暴露时间的变化如图8所示,1—10d各实验组脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织IBR值均呈现先上升后下降的趋势,其中肝胰脏组织 IBR值在第 10天到达峰值,为23.43(图8a);肌肉组织IBR值在第5天到达峰值,为15.44(图8b)。各实验组脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织IBR值随暴露浓度的变化如图9所示,0.45μg/L、0.05μg/L、对照组实验组肝胰脏IBR值分别为44.23、29.01、1.85(图9a);0.45μg/L、0.05μg/L 实验组肝胰脏组织 IBR 值分别为 32.07、17.51、1.28(图9b)。0.45μg/L实验组IBR值显著高于0.05μg/L和对照组,相同BaP暴露浓度下,肝胰脏组织IBR值则显著高于肌肉组织。

每个取样时间点上该生物标志物的得分 Bi值计算公式为

图1为薏米添加量对产品品质的影响。根据图1所示薏米的添加量不能过多也不能过少，添加量过少会使薏米鸡肉饼色泽较浅没有薏米香味；而添加量过多会使薏米鸡肉饼的颜色深且薏米的味道过重，掩盖肉香味。所以可以确定薏米的添加量在20%左右适宜。

 

在企业中的会计基本可以分为管理会计、财务会计，而税务会计是近年来企业中新增的一个会计类型。税务会计又可分为纳税筹划会计和调整核算税务会计两个类型。纳税规划会计是指在不违反国家相关税务法律法规的前提下，通过专业的学术知识来帮助企业减少或者拖延企业纳税。而另一种是调整核算税务会计。调整核算税务会计的主要职能是将企业的收入、利润以及应交税费核算为应纳税所得、应税收入、应纳税额。

 

式(3)—(5)中,n为所选用的生物标志物个数;α为相邻2条辐射线的夹角,α=2π/n;Bn+1=B1。当n=4时,α=π/2, 相应的Ai计算公式可简化为Ai=BiBi+1/2。

1.3.2 毒理学指标的测定 采用 Pohl等(1980)快速终止荧光法测定 EROD活性,Habig等(1974)的方法测定 GST活性,黄嘌呤氧化酶法测定 SOD活性,紫外分光光度法测定CAT活性(李康等,2006),MDA含量采用硫代巴比妥法测定(任加云等,2006)。

2 结果

2.1 BaP对脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织生物标志物的诱导

在本实验中,丙酮处理组的各毒理指标与对照组相比变化不显著(P＞0.05)(图1—图5),因此用丙酮作为助溶剂是可行的。

式(2)中,|xmin|为所有每个取样点中该生物标志物均一化数据最小值的绝对值。某取样时间点上每种生物标志物的 Bi值大小以星状图中辐射线的长度来表示。某取样时间点的 IBR值通过计算星状图面积(即图中由相邻生物标志物的辐射线围成的三角形面积 Ai之和得到:

0.45μg/L实验组脊尾白虾肝胰脏组织的 EROD活性呈现先上升后下降的趋势,在第 10天时达到峰值,为第0天的5.62倍,在第15天时EROD活性依然显著高于对照组水平(P＜0.05);0.05μg/L实验组脊尾白虾肝胰脏组织的 EROD活性则呈现逐渐上升的趋势,第15天时的峰值为第0天的3.45倍,并且显著高 于 对照组水平(P＜0.05)(图1a)。0.45μg/L、0.05μg/L实验组脊尾白虾肌肉组织的 EROD活性均呈现先上升后下降的趋势,且均在第1天时达到峰值,分别为第 0天的 4.95倍、3.08倍,0.45μg/L实验组EROD活性在第 15天时依然显著高于对照组水平(P＜0.05),而 0.05μg/L实验组 EROD活性在第 10天时开始与对照组无显著性差异(P＞0.05)(图1b)。

  

图1 BaP对肝胰脏(a)、肌肉组织(b)EROD活性的影响Fig.1 Effects of BaP on EROD activities of hepatopancreas (a)and muscle (b)

 

注:*表示与对照组相比差异显著(P＜0.05),下同

0.45μg/L、0.05μg/L实验组脊尾白虾肝胰脏组织的 GST活性均呈现先上升后下降的趋势,且均在第10天时达到峰值,分别为第0天的3.15倍、2.28倍,且在第15天时两个实验组GST活性依然显著高于对照组水平(P＜0.05)(图2a)。0.45μg/L、0.05μg/L 实验组脊尾白虾肌肉组织的 GST活性也均呈现先上升后下降的趋势,且均在第1天时达到峰值,分别为第0天的2.74倍、2.04倍,0.45μg/L实验组GST活性在第10天开始与对照组无显著性差异(P＞0.05),而0.05μg/L实验组GST活性在第5天开始与对照组无显著性差异(P＞0.05)(图2b)。

一、(满分25分)超市里的商品都有一个识别的号码，这个号码用可由光学扫描仪读出的条形来编码，通常称为条码．例如下图所示.图中给出的识别号码是0 8 9 6 0 0 1 2 4 5 6 9．这个号码称为通用产品码(UPC)，广泛用于商品编码.在大多数情况下，分配给产品的号码是一个12位数字，前11位的数字是商品项目代码，最后1位是校验码．校验码用于检验前11位商品编码的正确性．检验的原理是要保证同类商品的所有12位编码数字的和(或加权和)被某个整数整除．

  

图2 BaP对肝胰脏(a)、肌肉组织(b)GST活性的影响Fig.2 Effects of BaP on GST activities of hepatopancreas (a)and muscle (b)

数据以平均值±标准差(Means±SD)表示,并采用t检验法统计分析实验组与对照组间的数据差异,显著性水平设为0.05。

0.45μg/L、0.05μg/L实验组脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织的MDA含量均呈现逐渐上升的趋势,且各实验组 MDA含量从第 1天开始即显著高于对照组(P＜0.05),在第15天达到峰值时两个实验组肝胰脏组织的MDA含量分别为第0天的19.39倍、10.90倍(图5a);两个实验组肌肉组织的MDA含量分别为第0天的16.18倍、9.10倍(图5b)。

  

图3 BaP对肝胰脏(a)、肌肉组织(b)SOD活性的影响Fig.3 Effects of BaP on SOD activities of hepatopancreas (a)and muscle (b)

0.45μg/L、0.05μg/L实验组脊尾白虾肝胰脏组织的CAT活性均呈现先上升后下降的趋势,且均在第1天即达到峰值且均显著高于对照组水平(P＜0.05),分别为第0天的2.97倍、2.25倍,随后逐渐下降,第15天时0.45μg/L实验组CAT活性显著低于对照组水平(P＜0.05),0.05μg/L实验组CAT活性与对照组之间则无显著性差异(P＞0.05)(图4a)。0.45μg/L、0.05μg/L 实验组脊尾白虾肌肉组织的 CAT活性也均呈现先上升后下降的趋势,且均在第1天即达到峰值且均显著高于对照组水平(P＜0.05),分别为第0天的3.02倍、1.97倍,随后逐渐下降,第 15天时 0.45μg/L实验组 CAT活性显著低于对照组水平(P＜0.05),0.05μg/L实验组CAT活性与对照组之间则无显著性差异(P＞0.05)(图4b)。

盖梁是桥梁结构下部的主要受力构件。为了保证盖梁的受力情况，应该采用支护构架。对其进行混凝浇筑，之后再铺设模板。在建立支护构架浇筑混凝土之前，要对支架周围做防护网，提早预防施工过程中的安全事故。

  

图4 BaP对肝胰脏(a)、肌肉组织(b)CAT活性的影响Fig.4 Effects of BaP on CAT activities of hepatopancreas (a)and muscle (b)

  

图5 BaP对肝胰脏(a)、肌肉组织(b)MDA含量的影响Fig.5 Effects of BaP on MDA content of hepatopancreas (a)and muscle (b)

2.2 综合生物标志物分析

不同浓度BaP暴露条件下IBR值以星状图的形式表示(图6,图7),星状图中的多边形面积即为IBR值。可以看出,在不同实验时间点,0.45μg/L、0.05μg/L实验组脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织各生物标志物均受到了诱导或者抑制,与 0.05μg/L实验组和对照组相比,0.45μg/L实验组星状图覆盖面积较大,其IBR值也相应较大,同时,各实验组覆盖面积,即 IBR值也随时间变化。

PBL教学法于20世纪80年代引入我国医学教育。其强调运用科学方法发现问题，寻找信息和知识的空白点，达到加强自学、相互协作、解决问题的目的，是一个综合的、动态的、不断拓展的过程，要求学生运用现有的主题内容和方法来探究问题的解决答案[8]。目前在基础、临床和实验等课程中部分试行了PBL教学法，在中专、高职高专、本科及研究生等不同层次护理学课程教学中广泛开展，取得了一定成效。许多高职医学院校虽然采用了PBL教学法，但未全面实施。

  

图6 不同时间BaP胁迫下肝胰脏组织IBR星状图Fig.6 Star plots for biomarker responses in hepatopancreas

  

图7 不同时间BaP胁迫下肌肉组织IBR星状图Fig.7 Star plots for biomarker responses in muscle

式(1)中,xi′为 xi均一化后的值。

  

图8 IBR值(肝胰脏(a),肌肉组织(b))随时间的变化Fig.8 IBR values of hepatopancreas (a) and muscle (b) changes vs time

  

图9 IBR值(肝胰脏(a)、肌肉组织(b))随浓度的变化Fig.9 IBR values of hepatopancreas (a) and muscle (b) changes vs concentrations

3 讨论

BaP的生物转化可以分成Ⅰ相和Ⅱ相反应,EROD属于混合功能氧化酶系(mixed function oxidase,MFO)中细胞色素P450依赖的典型Ⅰ相代谢酶,能够被BaP诱导,催化生物体中BaP的降解过程(Gagnon et al,2000),随后,在Ⅱ相反应中,GST催化谷胱苷肽等生物内源性的水溶性分子与Ⅰ相代谢产物结合,形成更为亲水的物质排出体外,从而起到代谢解毒作用(Gadagbui et al,2000)。在本研究中,0.45μg/L实验组脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织对EROD、GST的诱导效应均高于 0.05μg/L实验组,表现出一定的剂量-效应关系。同时,0.45μg/L、0.05μg/L实验组脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织的EROD、GST活性随时间的变化均表现为先上升后下降,但肌肉组织的 EROD、GST活性被诱导的峰值均低于肝胰脏组织,这表明,相比较肌肉组织,BaP对肝胰脏的诱导更强。这是因为肝胰脏是生物体主要的内源性、外源性污染物的解毒代谢组织,其解毒代谢功能相比较肌肉能力更强(Santos et al,2004)。在第15天,暴露实验结束时,两个浓度实验组的肝胰脏组织EROD、GST活性依然显著高于对照组水平(P＜0.05),而肌肉组织则仅有0.45μg/L实验组 EROD活性依然显著高于对照组水平(P＜0.05)也证明了脊尾白虾的肝胰脏组织具有更强的解毒代谢功能。

EROD、GST的解毒代谢过程伴随着大量活性氧自由基(O2–,·OH,H2O2 等)的产生,活性氧自由基能够引起酶失活、脂质过氧化、DNA断裂等机体损伤。生物体内的抗氧化酶防御系统则能够清除活性氧,其中SOD能将O2–转化成H2O2,CAT能进一步将H2O2转化成水(Solé et al,1995;Solé,2000)。在本研究中,脊尾白虾的肝胰脏、肌肉组织 SOD、CAT也表现出一定的剂量-效应关系,0.45μg/L实验组脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织对 SOD、CAT的诱导效应均高于0.05μg/L实验组。在BaP的暴露初期,应激反应促使生物机体组织提高 SOD、CAT活性清除过量的活性氧自由基,但随着曝露时间增加,活性氧自由基的产生超过了SOD、CAT的清除能力,过量的活性氧自由基对脊尾白虾的机体组织造成了损伤,抑制了SOD、CAT酶的活性,肝胰脏的 SOD活性尽管表现为持续增加,但其增加幅度却逐渐减少。

当活性氧自由基在生物机体内累积到一定程度时,会导致机体的脂质氧化作用,脂质氧化作用可以用丙二醛(MDA)的含量代表(Thomas et al,1990)。在本研究中,0.45μg/L、0.05μg/L实验组脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织的MDA含量在第1天即开始显著升高(P＜0.05)并持续上升,表明此时已经开始产生脂质氧化作用并随暴露时间延长趋于严重;同时,肝胰脏组织MDA含量高于肌肉组织,表明作为解毒代谢主要器官的的肝胰脏组织受到的脂质氧化作用更加严重。

脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织的 EROD、GST、SOD、CAT、MDA对 BaP暴露的响应并不一致,单独使用某一个指标不能较为全面评价 BaP对脊尾白虾的毒性效应。IBR可以通过量化的数值直观反映BaP的暴露毒性,从而有效比较不同暴露浓度下的BaP毒性差异。在本研究中,脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织IBR值表现出了显著的剂量-毒性效应以及组织特异性,对相同组织,高浓度实验组的IBR值高于低浓度实验组,而对相同实验浓度,肝胰脏组织的 IBR值高于肌肉组织。这个结果不但验证了肝胰脏的主要解毒代谢功能,更量化了其与肌肉组织的差异,表明IBR可以作为一种定量评价污染物毒性效应的有效工具。

4 结论

(1) 不同浓度的BaP暴露对脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织的 EROD、GST、SOD、CAT、MDA 毒性效应指标均有不同程度的诱导作用,剂量效应关系与时间效应关系明显,暴露过程中各毒性效应指标整体呈现出先诱导后抑制的规律性变化。

(2) 脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织IBR值均呈现先上升后下降的趋势,IBR值与BaP暴露浓度及时间存在剂量效应关系与时间效应关系,脊尾白虾肝胰脏、肌肉组织对BaP的暴露响应存在差异性,肝胰脏生物标志物综合应激活性高于肌肉组织。

分时度假不同于共时度假，要求更长时间的度假体验，时间成本较高。基于其“分时”的属性，分时度假一般以时间段为单位，这就要求消费者在享有不定期的至少三天以上的时间的基础上才有进行分时度假的可能性。而纵观我国现有的115天的节假日，其中80%的假期集中在周末双休，不具备分时度假的条件，剩余的23天休假时间中，除春节和国庆节放假7天以外，元旦、清明节、劳动节、端午节、中秋节的休假均不超过三天，集中的假期制度就导致了分时度假对国人来说成为“奢侈品”。

参 考 文 献

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李 康,周忠良,陈立侨等,2006.苯并[a]芘对鲫鱼生物标志物的影响研究.环境科学研究,19(1):91—95

蒋 玫,李 磊,沈新强等,2015.基于整合生物标志物响应指数评价0号柴油对黑鲷(Sparus macrocephalus)的毒性效应.生态与农村环境学报,31(2):230—237

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