UPLC-ESI-Q-TOF-MSE快速鉴定钩藤中吲哚类生物碱*

钩藤是茜草科植物钩藤Uncaria rhynchophylla（Miq.）Miq.ex Havil、大叶钩藤 U.macrophylla Wall.毛钩藤 U.hirsuta Havil、华钩藤 U.sinensis（Oliv.）Havil.或无柄果钩藤U.sessilifructus Roxb.的干燥带钩茎。钩藤药材主要产于广西、广东、云南、贵州等地区；分布范围广，常生于山谷溪边的疏林或灌丛中。在国外主要分布于日本[1]。钩藤有活血通经、清热平肝、息风定惊之功效，性微寒，味甘，归肝，心包经，用于惊痫抽搐、高热惊厥、感冒夹惊、肝风内动、头痛眩晕等症[2]。

信号幅度及相位值的解算需通过开平方及反正切运算获得，而这两种运算在FPGA内部无法直接实现.CORDIC算法是在硬件FPGA中求解该问题的通用方法，通过移位和加减等运算，即可完成矢量的旋转，从而获得其幅度及相位值[10].

钩藤的钩茎中的化学成分主要为吲哚类生物碱，其中钩藤碱和异钩藤碱含量分别高达28.9%和14.7%，另外还有三萜类、皂苷类、酚类和黄酮类等成分[3]。随着钩藤中吲哚类生物碱的深入研究，生物碱的全面快速鉴定就显得尤为重要。超高效液相-四级杆串联飞行时间质谱仪（UPLC-ESI-Q-TOF-MS）结合了超高效液相的速度快、效率高、分离能力强和ESI-Q-TOF-MS用时短、扫描范围广、分辨率高、选择性强等优点，是中药有效成分定性分析中最有效的手段之一。本实验采用UPLC-ESI-Q-TOF-MSE技术对钩藤提取物中吲哚类生物碱进行分析鉴定，根据钩藤中吲哚生物碱的质谱信息、对照品数据对照以及与相关文献进行比对，鉴定其中9个吲哚类生物碱，为钩藤饮片的真伪鉴别和质量控制提供简单快速的鉴定方案，并对其药效物质基础的深入研究提供了科学依据。

1 实验部分

1.1 仪器与试药

ACQUITYTMUPLC超高效液相色谱系统，二元高压泵、在线脱气装置、自动进样器、柱温箱；Xevo QTof MS质谱系统（美国Waters公司），采用电喷雾离子源（ESI）；KQ-500DB型（数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司）；电子分析天平［METTLER TOLEDO，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；Milli-Q型自动双重纯水蒸馏器（上海密理博公司）。

初中数学，我们对单动点的问题研究得比较深刻，例如探究其轨迹路径，从而为解决后续问题(最值，路径长等)提供依据.可是在复习阶段，笔者遇到了一类比较有意思的问题，在2018年中考中也有现身——双动点下的第三动点问题，笔者痴迷其中，并做了相关研究，请教了物理老师，对“杠杆原理”和“速度的分解与合成”作重新认知，却又兜兜转转，一晌顿悟，借高中的向量原理和法则可解决该类问题，与读者分享.

使用MassLynx4.1TM软件对正离子模式总离子流图进行处理，结合精确m·z-1、对照品质谱数据、碎片离子特征、相对保留时间、相关参考文献和元素组成分析软件Elemental compositionTM，化合物结构匹配软件Mass FragmentTM对钩藤中9种吲哚类生物碱化合物进行了鉴定，分别为a.卡丹宾碱、b.二氢卡丹宾碱、c.异去氢钩藤碱、d.柯诺辛碱、e.去氢钩藤碱、f.钩藤碱、g.缝籽嗪甲醚、h.去氢毛钩藤碱、i.毛钩藤碱[4-6]。结果见表1。

1.2.3 UPLC色谱条件 采用色谱柱：HSS T3（100mm×2.1mm，1.8μm，Waters）；柱温箱温度：40℃；流动相流速：0.4mL·min-1；样品进样量：4μL；流动相A：0.1%甲酸水溶液，流动相B：乙腈；随时间变化梯度洗脱，洗脱条件：0～2min，98%～80%A；2～5min，80% ～ 78%A；5 ～ 10min，78% ～ 75%A；10～20min，75%～70%A。

1.2 方法与检测条件

五环单萜吲哚类生物碱（卡丹宾碱）可能的裂解规律分析：正离子模式下首先形成准分子离子m/z 545.2133［M+H］+，然后脱去一分子葡萄糖形成m/z 383.1874［M+H-Glc］+碎片，进一步脱去一分子水形成 m/z 365.1769［M+H-Glc-H20］+碎片，最后 C环开环断裂，形成吲哚母核特征碎片m/z 144.0815［C10H10N］+。

通过UPLC-ESI-Q-TOF-MSE技术对钩藤吲哚生物碱类成分进行定性分析，（+）ESI-MSE的质谱总离子流图（TIC）见图1。

钩藤中所含化学成分主要为吲哚类生物碱，我们所鉴定的吲哚类生物碱分为3类：a.卡丹宾碱、b.二氢卡丹宾碱为五环单萜吲哚生物碱；c.异去氢钩藤碱、d.柯诺辛碱、e.去氢钩藤碱、f.钩藤碱为四环单萜羟吲哚生物碱；g.缝籽嗪甲醚、h.去氢毛钩藤碱、i.毛钩藤碱为四环单萜吲哚生物碱，见图2。同种类型的生物碱结构相似，仅在侧链取代基和氢的数量上有所差别，故同种类型生物碱裂解规律相似，我们以五环单萜吲哚生物碱卡丹宾碱、四环单萜羟吲哚生物碱柯诺辛碱和四环单萜吲哚生物碱去氢毛钩藤碱为例，分析其可能的裂解规律，见图3。

对照品钩藤碱（MUST-16121210）（成都曼斯特生物科技有限公司）；去氢钩藤碱（D17032105）、异去氢钩藤碱（D17011002）南京狄尔格医药科技有限公司；钩藤药材购自哈尔滨北国药材站，经黑龙江中医药大学药学院中药鉴定教研室王振月教授鉴定为茜草科植物钩藤 U.rhynchophylla（Miq.）Miq.ex Havil的干燥带钩茎。

1.2.4 质谱条件 Xevo QTof MS质谱系统（美国Waters公司），采用电喷雾离子源（ESI）。正离子扫描模式，雾化气（N2）流量为：650L·h-1，气帘气流量为：50L·h-1；毛细管电压：3.0kV；样品锥孔（sample cone）电压：40V；萃取锥孔（extraction cone）电压：4V；脱溶剂气温度为150℃，离子源温度120℃；采用MSE扫描模式检测，数据采集形式（Data format）：MSEcentroid；低能量扫描时（Low Energy）传输碰撞能量（Expression Collision Energy）为10V，高能量扫描时（High Energy）传输碰撞能量（Expression Collision Energy）为 20～40V。扫描范围（m·z-1）：100～1500Da；扫描时间（Scan time）0.2s。外标（Lock SprayTM）使用亮氨酸脑啡肽（m·z-1556.2771）进行质量实时校正，体积流量为 10μL·min-1。

2 结果与讨论

2.1 UPLC-ESI-Q-TOF-MSE成分鉴定

大赛的题目都是面对当前的实际问题，结合最前沿的技术和主流技术的发展趋势，对软件进行设计和开发，学生在实际参赛过程中，会通过各种手段去学习最新最前沿的技术方法，对问题进行解决，从而进一步提升了学生学习新技术的能力[4]。

乙腈、甲醇（色谱纯 美国Fisher公司）；甲酸（色谱纯 美国TEDIA公司）；水为Milli-Q纯水器（密理博上海贸易有限公司）。

  

图1 钩藤化学成分总离子流图Fig.1 TICof U.rhynchophylla chemical composition

 

表1 正离子模式下钩藤吲哚类生物碱UPLC-ESI-Q-TOF-MSE鉴定结果Tab.1 Identification of indole alkaloids in U.rhynchophylla by UPLC-ESI-Q-TOF-MSE under positive ion mode

  

峰号 t R/min 理论质荷比m/z 实测质荷比m/z 特征碎片 化合物（分子式）a 3.34 545.2135 545.2133 ［M+H］+卡丹宾碱383.1877 383.1874 ［M+H-C6H10O5］+ （C27H32N2O10）365.1771 365.1769 ［M+H-C6H10O5-H20］+144.0813 144.0815 ［C10H10N］+b 3.62 547.2292 547.2295 ［M+H］+ 二氢卡丹宾碱385.2034 385.2036 ［M+H-C6H10O5］+ （C27H34N2O10）367.1928 367.1922 ［M+H-C6H10O5-H20］+144.0813 144.0809 ［C10H10N］+c 4.45 383.1971 383.1969 ［M+H］+ 异去氢钩藤碱351.1709 351.1706 ［M+H-CH3OH］+ （C22H26N2O4）267.1498 267.1493 ［M+H-C5H8O3］+160.0762 160.0758 ［C10H10NO］+d 4.91 385.2127 385.2129 ［M+H］+柯诺辛碱353.1865 353.1861 ［M+H-CH3OH］+ （C22H28N2O4）267.1497 267.1499 ［M+H-C5H10O3］+241.1341 241.1343 ［M+H-C7H12O3］+160.0762 160.0766 ［C10H10NO］+e 5.00 383.1971 383.1964 ［M+H］+ 去氢钩藤碱351.1709 351.1704 ［M+H-CH3OH］+ （C22H26N2O4）267.1497 267.1496 ［M+H-C5H8O3］+241.1341 241.1347 ［M+H-C7H10O3］+160.0762 160.0767 ［C10H10NO］+f 5.80 385.2127 385.2121 ［M+H］+钩藤碱353.1865 353.1867 ［M+H-CH3OH］+ （C22H28N2O4）269.1654 269.1648 ［M+H-C5H8O3］+160.0762 160.0769 ［C10H10NO］+g 10.20 367.2022 367.2017 ［M+H］+ 缝籽嗪甲醚249.1392 249.1394 ［M+H-C5H10O3］+ （C22H26N2O3）224.1287 224.1284 ［M+H-C10H9N］+144.0813 144.0809 ［C10H10N］+h 11.33 367.2022 367.2028 ［M+H］+ 去氢毛钩藤碱335.1760 335.1762 ［M+H-CH3OH］+ （C22H26N2O3）249.1392 249.1399 ［M+H-C5H10O3］+224.1287 224.1287 ［M+H-C10H9N］+144.0813 144.0811 ［C10H10N］+i 13.08 369.2178 369.2166 ［M+H］+ 毛钩藤碱337.1916 337.1919 ［M+H-CH3OH］+ （C22H28N2O3）226.1443 226.1440 ［M+H-C10H9N］+144.0813 144.0808 ［C10H10N］+

2.2 钩藤中吲哚类生物碱化合物的质谱裂解特征推断

1.2.2 对照品溶液的制备 分别精密称取5mg钩藤碱、去氢钩藤碱、异去氢钩藤碱对照品，加甲醇溶解，配置成质量浓度为0.1mg·mL-1的对照品溶液。

  

图2 钩藤中鉴定的9种吲哚类生物碱结构Fig.2 Structure of 9 indole alkaloids identified in U.rhynchophylla（a.Cadambine，b.Dihydrocadambine，c.Isocorynoxeine，d.Corynoxine，e.Corynoxeine，f.Rhynchophylline，g.Geissoschizine methyl ether，h.Hirsuteine，i.Hirsutine.）

1.2.1 钩藤样品制备 取钩藤药材粉末过20目筛，精密称取0.2g，置于棕色瓶中，精密加入50mL甲醇，置4℃冰箱中冷浸24h，低温超声45min（功率250W，频率30kHz），甲醇补足重量，过滤并记录滤液体积。精密量取续滤液2.5mL，置10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

四环单萜羟吲哚类生物碱（柯诺辛碱）可能的裂解规律分析：正离子模式下形成准分子离子m/z 385.2129［M+H］+，然后从丙烯酸酯侧链脱去一分子羟甲基形成m/z353.1861［M+H-CH3OH］+碎片，进一步丙烯酸酯侧链完全脱去形成m/z 267.1499［M+H-C5H10O3］+碎片，然后乙基侧链脱去形成m/z 241.1343［M+H-C7H12O3］+碎片，最后C环开环断裂，形成羟吲哚母核特征碎片m/z 160.0766［C10H10NO］+。

本研究共纳入6项随机对照试验，研究质量等级均为“B”。随机方法上郭友华等[16]使用电脑分层随机，张裴景等[20]使用随机数字表法，均评定为低风险；包艳等[18]提及按入院顺序随机分组，但未对具体随机过程进行描述，评为不清楚；其余试验均只提及随机字样。6项研究均未提及使用分配隐藏和盲法，评定为不清楚。6篇研究数据均完整，评定为低风险。选择性报道中，刘惠惠[17]的研究存在结果报告不全的情况，评为高风险。纳入研究的方法学质量评价详见表2。

四环单萜吲哚类生物碱（去氢毛钩藤碱）可能的裂解规律分析：正离子模式下形成准分子离子m/z 367.2028［M+H］+，同四环单萜羟吲哚生物碱一样从丙烯酸酯侧链脱去一分子羟甲基形成m/z 335.1762［M+H-CH3OH］+碎片，进一步丙烯酸酯侧链完全脱去形成 m/z 249.1399［M+H-C5H10O3］+碎片，最后 C环开环断裂，形成吲哚母核特征碎片m/z144.0811［C10H10N］+和 m/z224.1287［M+H-C10H9N］+碎片。

(ⅱ) 对任意F∈CIrr(X),若Fδ∩f-1(U)≠Ø,f(Fδ)∩U≠Ø,由f(Fδ)⊆(f(F))δ,(f(F))δ∩U≠Ø。注意到U∈σCSI及f(F)∈CIrr(Y),于是f(F)∩U≠Ø,F∩f-1(U)≠Ø,从而f-1(U)∈τCSI。

  

图3 吲哚类生物碱可能的裂解规律Fig.3 Possible fragmentation pathways of indole alkaloids in U.rhynchophylla

3 结论

钩藤是我国常用中药，药用资源丰富，其主要有效成分为吲哚类生物碱，本实验利用UPLC-ESI-Q-TOF-MSE分辨率高，速度快，分离能力强等优势，有针对性地对钩藤中吲哚类生物碱进行了较好的分离和鉴定分析，得到其准确的分子离子和碎片离子的结构信息，并结合对照品数据对照和相关文献报道确定了其中含量较高的9种吲哚类生物碱，并且对钩藤中吲哚类生物碱质谱裂解规律进行总结，发现五环单萜吲哚生物碱形成吲哚母核特征离子碎片；四环单萜羟吲哚生物碱形成羟吲哚母核特征离子碎片。四环吲哚生物碱形成吲哚母核特征离子碎片的基础上还形成与之对应的萜类离子碎片，这能帮助我们进一步通过质谱信息区分和辨别不同类型的生物碱。为钩藤饮片的质量控制，研究其吲哚类生物碱成分，以及阐明其药效物质基础提供了理论依据。

参考文献

［1］ 中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志［M］.北京：科学出版社，1999.255.

［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国药-典1部［M］.中国医药科技出版社，2015.257.

［3］ 叶齐，齐荔红.钩藤的主要成分及生物活性研究进展［J］.西北药学杂志，2012，27（5）：508-508.

［4］ 辛文波，俞桂新，王峥涛.钩藤生物碱类成分研究［J］.中草药，2009，40（2）：204-207.

［5］ Xie S，Shi Y，Wang Y，et al.Systematic identification and quantification of tetracyclic monoterpenoid oxindole alkaloids in Uncaria rhynchophylla and their fragmentations in Q-TOF-MSspectra［J］.Journal of pharmaceutical and biomedical analysis，2013，81：56-64.

［6］ 王定勇.大叶钩藤生物碱类化学成分研究［J］.中医药导报，2009，15（1）：80-81.