贵州苗药头花蓼的rbcL序列分析

头花蓼(Polygonum capitatum Buch.-Han.ex D.Don)为贵州道地苗药，别名石莽草、满地红等，属多年生匍匐草本植物，具有清热利湿、解毒止痛、活血散瘀及利尿通淋等功效，主要用于治疗泌尿系统感染、肾盂肾炎、膀胱炎、尿路结石、风湿痛及跌打损伤等[1-2]。头花蓼是贵州省近10年中药现代化重点发展的六大苗药和“十五”期间重点培育的七大中药产业链之一，贵州省已建立了多个通过国家认证的头花蓼GAP的种植基地。头花蓼具有广泛临床应用价值，全草入药，以头花蓼为独有成分的热淋清胶囊更是常用处方药[3]。以头花蓼为主要成分的其他的制剂也在不断研发中，有较大的商品开发价值。近年来对头花蓼的研究主要在化学成分、药理作用、临床应用、显微鉴别和栽培技术等方面[4-6]。随着头花蓼市场价值的提高，对其分子生物学方面的研究也逐渐进入热点。杜明凤[7]等用RAPD法分析了贵州和四川头花蓼居群的遗传多样性；周涛[8]等建立了头花蓼重复片段多态性分析-多聚酶链式反应体系和正交优化。

利用现代分子生物学DNA条形码技术对药材进行鉴定和分析，能克服传统分析法的周期长，引物不具有标准性等不足。叶绿体基因组参与光合作用光系统的基因如rbcL基因和ndh基因为绿色植物特有。由于Rbc在光合作用及光呼吸中所起的关键作用，rbcL基因的进化明显受到功能的限制，其编码序列高度保守[9-10]。rbcL基因目前是研究物种间系统学关系比较恰当的指示基因，已广泛用于被子植物从科内、亚科内甚至整个种子植物各主要类群之间的系统发育分析及遗传多样性方面[11-14]。基于此，笔者等进行贵州不同来源苗药头花蓼rbcL基因序列扩增及序列分析，为rbcL基因序列作为中草药鉴定的分子标记奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 头花蓼样品 样品分别收集于贵州省贵阳市、黔南州和六盘水等地的GAP药用植物基地和野外(表1)，形态学鉴定由广东省珠海市食品药品监督管理局药检所完成。

1.1.2 试剂与仪器

试剂：CTAB、EDTA-Na2.H2O、Tris购于深圳宝生物公司，有机溶剂氯仿、苯酚、异戊醇购于成都科龙化工试剂公司。

表1 头花蓼样品的采集地点及海拔

Table 1 Collecting location and elevation of P. capitatum samples

  

样品Sample采集地点Collectinglocation海拔(m)ElevationMPC1贵阳市药用植物园568MPC2贵阳市息烽县野外采集730MPC3黔南州头花蓼药植基地1134MPC4黔南州榕江县栽麻乡山坡1634MPC5六盘水GAP药植基地1763MPC6六盘新场村野外采集1680

仪器：UV-2550型紫外分光光度计岛津(日本岛津公司)、Hema-8000型PCR仪(珠海黑马仪器厂)、DYC型电泳仪(北京六一仪器厂)和5810R型冷冻高速离心机(Eppendorf)。

1.2 基因组DNA提取及纯度检测

分别采用DNA提取试剂盒、SDS法[15]、CTAB法[16]、改良的CTAB[17-19]法等4种方法反复提取头花蓼基因组DNA，从而获得纯度最高的DNA。DNA样品100倍稀释后，在紫外分光光度计UV-2550上测定其在260nm、280nm处吸光度值，根据吸光度OD260、OD260/OD280的值测定所获DNA的浓度和纯度。再进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA片段长度。

该工厂于3月份投产，目前生产板材厚度为2～35 mm。其日产量为650 m3，由此Action Tesa公司成为印度最大的MDF生产商，年产能 51.1 万 m3。

将已达到PCR扩增标准的6个不同来源头花蓼DNA样品，用rbcL序列通用引物进行PCR扩增，对所获得的扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测结果(图1)表明，rbcL序列长度与marker条带相比在900～1 000 bp。条带无拖尾，单一清晰，符合测序要求。

1.3 rbcL序列的PCR扩增和测序

rbcL序列的通用引物序列：H：5′-ACA TCK ART ACK GGA CCA GTA A-3′)，L：(5′-AAC ACC AGC TTT GAA TCC AA-3)(引物由上海生工生物工程有限公司合成)。

rbcL序列PCR扩增反应在50 μL的反应体系中进行，含10×PCR buffer 5 μL，25 mmol/L Mgcl 5 μL，2 mmol/L dNTPmix 5 μL，10 pmol/μL primer11 μL，10 pmol/μprimer 2 1 μL，5 U/μL pfuDNA polymerase 5 μL，模板DNA约80～150 ng， 加无菌水补充共50 μL反应体系。

PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，56℃退火2 min，72℃延伸3 min，共30个循环；72℃延伸5 min。PCR产物通过1.0%琼脂糖凝胶电泳，初步鉴定筛选后，分别送深圳华大基因科技有限公司测序。

针对上述高层次人才政治价值取向及原因分析，高校基层党组织要站在新时代的背景下，深入贯彻习近平总书记关于“聚天下英才而用之”等重要论述，充分遵循教育发展规律及人才成长规律，坚持党管人才原则，完善人才工作机制，严把政治标准，严把政治方向，通过创新工作方式、形成工作合力、做好党员发展工作、树立典型等方面提升高校高层次人才党建工作的科学化水平，为提升高校创新能力、推动高等教育事业发展提供坚实的人才支撑。

1.4 序列的测定与对比分析

运用Clustal X2.0软件和DNAMAN软件对测序所得12个不同来源头花蓼碱基序列进行分析，比较各样品2个序列碱基差异，用NJ(neighbour-2-joiningmethod，NJ)邻接法构建系统发育树。将不同来源头花蓼的rbcL序列经对比分析后，申请并提交于GenBank中。

2 结果与分析

2.1 头花蓼基因组DNA的纯度

从表2看出，DNA浓度最高为440 μg/mL,最低为80 μg/mL，A260最高值为0.048，最低值为0.01。

表2 不同来源头花蓼的DNA浓度

Table 2 DNA concentration of different P. capitatum samples

  

样品SampleA260A280A260/A280DNA浓度(μg/mL)DNAconcentrationMPC10．0080．0071．14380MPC20．0480．0281．714480MPC30．0340．0211．619340MPC40．0100．0052．000100MPC50．0460．0311．484460MPC60．0450．0351．285440

A280最高值为0.035，最低值为0.005。A260/A280比值在1.1～2.0，所有样品达到PCR扩增标准。

2.2 PCR扩增产物电泳图谱

DNA浓度(μg/mL)=OD260×稀释倍数×200

 

注：M为DNA标准参照物(DL1000)，1～6为MPC1～6样品:

Note: M, DNA standard reference (DL1000). 1～6, MPC1～6 samples.

图1 rbcL序列PCR扩增产物电泳图谱

Fig.1 Electrophoretogram of PCR amplified products of rbcL sequence

2.3 头花蓼的rbcL序列

今天，甲洛洛这么对小丁一说，下午领工钱时小丁就开口了：你们谁不愿意来卸货都可以，这年头想干这事的人多着呢！米九狠狠地瞪了甲洛洛一眼，甲洛洛假装看货物没有理会，可心里还是有些发毛：可别招惹上了这个穷光蛋。他赶忙走过去，对小丁笑笑：丁主任，他们三个卸货还是很认真的。小丁哦了一声，有些不明就里。米九的眼睛却笑了，看着甲洛洛，甲洛洛心里暗暗骂着：老子找到你是小偷的证据，看你还得意不得意。嘴上却笑开了：今天大家辛苦了。

表3 不同来源头花蓼的rbcL序列

Table 3 rbcL sequence of different P. capitatum samples

  

样品Sample长度(bp)LengthGC(%)GCskewGpC(%)MPC197951．130．06674．04MPC298152．340．13464．23MPC398052．290．12584．47MPC498352．540．13964．49MPC598152．320．13504．24MPC698553．460．15324．65

2.4 构建系统进化树

由图2看出，不同来源头花蓼具有高度亲缘关系。采自贵阳和黔南州的头花蓼资源形成一独立的分支，两地头花蓼资源与六盘水的同源性超过95%。

  

图2 不同来源头花蓼rbcL 序列的系统进化树

Fig.2 Phylogenetic tree of rbcL sequence of different P. capitatum samples

2.5 申请GenBank数据库登录号

试验所得rbcL序列通过NCBI BankIt自带软件向GenBank提交申请后获得的GenBank登录号为GP215865-870。

3 结论与讨论

由于rbcL序列主要存在叶绿体中，获得高纯度的基因组DNA是整个试验的关键。采用试剂盒、SDS、CTAB和改良的CTAB等DNA提取方法对样品进行DNA提取，试剂盒法提取过程简单易行，但提取效果相对较差，提取后琼脂糖凝胶电泳检测显示条带模糊；SDS法含有高浓度的SDS提取缓冲液，可裂解植物细胞从而提取DNA，但头花蓼中含有较多多糖类物质，采用该方法提取的基因组DNA呈白色透明状，且溶解后成粘稠状，故该方法不适用；CTAB法是提取植物DNA的经典方法，可以与DNA形成高盐溶液复合物，该复合物在高盐溶液(0.7 mol/L NaCL)中可以溶解，但在低盐溶液(0.3 mol/L NaCL)中会沉淀析出，由于要同时获得叶绿体基因组和核糖体基因组，传统的CTAB法提取的总DNA沉淀呈棕色，酚类化合物含量较多，经琼脂糖凝胶电泳分析表明，以上2种方法对提取的DNA纯度均达不到试验要求。因此，改良的CTAB法在原CTAB法的基础上增加反复抽提的步骤，加入苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)、β-巯基乙醇、PVP(可以有效防止酚类化合物氧化)，抽提次数对DNA纯度呈明显正相关。

通过rbcL序列比对分析，黔南州以及六盘水3个地区6个头花蓼栽培品和野生品样品中，MPC2、MPC3、MPC1和MPC4聚为一类，MPC5和MPC6聚为一类，MPC6样品与其他样品间差异最大。说明，黔南州地区野生种较栽培种变异大。六盘水基地位于贵州省西北部，纬度较高，地域环境对头花蓼遗传变异有明显改变。试验结果表明，rbcL序列均可以有效区分不同来源的头花蓼，rbcL序列分析技术可为建立头花蓼真品鉴定的分子水平标记及其DNA条形码的建立奠定初步基础。

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长期以来，牛超干事创业踏踏实实，对植保业务勤勤恳恳，为农民打药服务任劳任怨。牛超有一个心愿就是做一名农民最喜欢的“植保达人”。

经琼脂糖凝胶电泳检测，rbcL序列PCR扩增产物12个样品符合测序标准，各样品进行双向测序。从表3看出，排列后的rbcL序列总长在979～985 bp，有种间差异。对其中560个位点进行分析，变异位点为20个；GC含量为51.13%～53.46%；GCskew值为0.066 7～0.153 2，GpC含量为4.04%～4.65%。头花蓼的rbcL序列在自然进化中变异性较低。

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其实，他哪里知道我的心意。我是他想象中的那种狗男人吗？他错了，确确实实错了。我是喜欢他母亲那样的女人，但仅仅是尊重，却绝没有要欺辱他们母子的丝毫恶意。他一定是听信了某些人的闲言碎语。这世界的人真是都他妈的把眼装在了屁股上了。他们压根就不喜欢你去做一丁点儿有利于别人的好事。我想帮助小六子母子做点事，这难道有什么不对吗？去他妈的那些狗日的烂舌头！

[9] 王庆彪，王 莉，周任超.用叶绿体和核糖体DNA序列探讨中国特有植物斑子麻黄的系统位置[J].2006,51(1)：32-36.

[参 考 文 献]

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气相色谱条件：色谱柱为Agilent SP-2560毛细管柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm），升温程序起始70 ℃，以50 ℃/min升至140 ℃保持1 min，4 ℃/min升至180 ℃，保持1 min，3 ℃/min升至225 ℃，保持30 min；进样口温度260 ℃；进样量1 μL，分流比45：1，柱流量1 mL/min，载气为氮气。

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