顶空气相色谱法同时测定新药CBT108中12种残留溶剂

1 引 言

在药物合成反应中不可避免地会使用有机溶剂[1,2]，但是溶剂副产物残留高于安全值时，会产生毒性和致癌作用[3,4]。国际人用药品注册技术协会(International Conference for Harmonization, ICH)要求所有药品均需经过残留溶剂的检测与控制[1]。各国药典对药品中残留溶剂法规的制定均参考ICH颁布的指导原则，依据PDE将残留溶剂划分为四类总计69种[5～7]，并规定第一、二、三类残留溶剂不得高于药典规定的限量，第四类应根据生产工艺特点制定相应限量以满足GMP要求[8]。基于新的毒理学研究结果，ICH 在2002年修订了四氢呋喃和N-甲基吡咯烷酮的PDE，并将四氢呋喃由三类溶剂改为二类溶剂。2011年BP将环氧乙烷和二氧六烷不再作为残留溶剂项， 而另外作为一个测定项单独列出[9]，即至今各国药典对残留溶剂的限度要求一致[10～12]。在检测方法上，各国药典均推荐采用气相色谱法。BP采用AB双系统进行测定，系统A主要用于定性分析，系统B用于定量分析; 计算方法上，ChP采用内标法和外标法两种方式，USP和BP均只采用外标法[8,11,12]。本研究所涉及残留溶剂均属前三类。

从多年的传统教学结果来看，大多数学生反映通信电子电路课程内容难，学习效果较差。其中最主要的原因是通信电子电路的先修课程较多，需要用到大量的先修课程理论知识。例如，器件的非线性特性涉及半导体物理和模拟电子电路课程的内容，电路的设计和分析涉及电路分析、模拟电子电路、高等数学等课程的内容，信号的处理和传输又涉及信号与系统、微波等课程的内容。对于先修课程基础薄弱的学生，教师在有限的课堂时间里很难做到把整个知识体系梳理一遍，没有足够的时间回顾致使学生跟不上进度。

目前，残留溶剂的检测方法有差示扫描量热法[13]、红外光谱法[14]、核磁共振[15]、气相色谱法[16,17]等，这些方法除气相色谱外，专属性、灵敏度均不能达到ICH及各国药典的要求。气相色谱由于其高灵敏度、高分离能力，被各国推荐用于检测药物中残留溶剂[18～21]。与直接进样和动态顶空气相色谱法相比，静态顶空气相色谱法更具优势[3,18,19]。通过将样品中残留溶剂富集在顶空瓶上层气体中达到气-液或气-固两相平衡，直接定量取上层气体进样的方法，可使进样室在较低温度下操作，避免组分分解,减少难挥发物质对色谱系统与监测系统的干扰和污染，从而使分析过程更加简便、快速、灵敏，提高分析结果的准确度与可重现性，目前已成为残留溶剂检测的首选方法[2,22,23]。新药CBT108为上海华理生物医药有限公司与浙江野风药业有限公司联合开发的肿瘤血管靶向性抗肿瘤药物，目前已启动临床I期研究，其合成涉及到的残留溶剂有12种，分别为甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、庚烷、甲苯、四氯化碳。本研究采用静态顶空气相色谱法， 内标法定量，考察了不同固定相、平衡加热时间、升温程序和制样溶剂的影响，建立了同时测定新药CBT108中12种残留溶剂的新方法。本方法快速、准确，也可作为其它药物检测残留溶剂的方法依据和技术基础。

2 实验部分

2.1 仪器及试剂

Agilent Technology GC7890A system气相色谱仪，配有氢火焰离子化检测器(FID)以及Agilent Technologies G1888型顶空自动进样器(美国Agilent公司); QPH-300II型氢气发生器(上海全浦科学仪器有限公司); SGK-2LB低噪音空气泵(北京东方精华苑科技有限公司); Metller Toledo XS105分析天平(瑞士Metller公司); 20 mL顶空进样瓶。

第一，3月份是猕猴桃伤流高峰期。伤流对嫁接成活率影响主要有3个方面：一是伤流在伤口愈合面形成水膜类似隔离层，不利于伤口愈合；二是伤流将嫁接伤口包裹，伤口处温度难以提升，影响伤口愈合；三是伤流液容易滋生病菌，特别是溃疡病菌，给伤口愈合带来威胁。

6 %氰丙基苯基-94 %二甲基聚硅氧烷毛细管柱(DB624, 30 m×0.53 mm×3.0 μm; Serial No.: US8989746H)。程序升温：初始温度40℃保持5 min，以10℃的速率升温至260℃，保存3 min; 载气为氮气; FID检测器， 温度： 300℃; 进样口温度： 220℃; 分流比：25∶1; 柱流速：3.0 mL/min; 顶空平衡温度85℃，平衡时间40 min;定量环温度100℃; 传输管温度110℃; 进样量：1 mL。

2.2 色谱条件

甲醇(纯度99.9%)、乙醇(纯度99.8%)、乙醚(纯度99.7%)、丙酮(纯度99.5%)、乙腈(纯度99.9%)、二氯甲烷(纯度99.5%)、正己烷(纯度98%)、正丙醇(纯度99.5%)、乙酸乙酯(纯度99.5%)、四氢呋喃(纯度99.9%)、庚烷(纯度99%)、甲苯(纯度99.9%)均购于美国Dedia公司; 四氯化碳(纯度99.5%,天津市四有精细化学品有限公司)。实验样品为上海华理生物医药有限公司生产的CBT108。

将患者术后伤口感染发生为因变量，体重指数、合并糖尿病、术前化疗、手术时间、术前低蛋白、术后引流管放置时间作为自变量给予不同赋值进行logistic非条件回归分析，结果显示：合并糖尿病、术前化疗、术前低蛋白、手术时间是引起患者术后伤口感染发生的独立危险因素(P<0.05)，见表4与表5。

2.3 溶液的配制

2.3.1 溶剂及内标溶液 溶剂为50 % (V/V) N,N-二甲基甲酰胺(DMF)-水， 内标溶液：取正丙醇适量，加溶剂稀释制成50 μg/mL的溶液，作为内标溶液。

2.3.2 对照品溶液 分别精确称取四氯化碳4 mg，用内标溶液溶解并稀释定容至100.0 mL; 使四氯化碳浓度为40 μg/mL; 准确移取甲醇30 mg、乙醇50 mg、乙醚50 mg、丙酮50 mg、乙腈4.1 mg、二氯甲烷6 mg、正己烷2.9 mg、乙酸乙酯50 mg、四氢呋喃7.2 mg、庚烷50 mg、甲苯8.9 mg和上述浓度为40 μg/mL四氯化碳溶液1.00 mL，用内标溶液稀释并定容至100.0 mL; 各有机溶剂的终浓度分别为：甲醇300 μg/mL， 乙醇500 μg/mL， 乙醚500 μg/mL， 丙酮500 μg/mL， 乙腈 41 μg/mL，二氯甲烷60 μg/mL， 正己烷29 μg/mL，乙酸乙酯500 μg/mL，四氢呋喃72 μg/mL，四氯化碳0.4 μg/mL，庚烷的浓度500 μg/mL， 甲苯89 μg/mL，作为对照品溶液。

3 结果与讨论

3.1 系统适应性与方法专属性

取内标溶液10 mL置于20 mL顶空瓶中，密封瓶口，作为空白试验溶液定量进样1 mL; 另取甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、四氯化碳、庚烷、甲苯各l μL置于20 mL顶空瓶中，分别进样，通过测定单一溶剂的保留时间确定混合溶剂样品各个峰的归属。另取对照品溶液10.00 mL至顶空瓶中，按拟定色谱条件连续进样5次，计算出甲醇、乙醇、乙醚、丙酮、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、四氯化碳、庚烷、甲苯的理论塔板数均>5000、分离度均>1.5，各峰面积校正值的RSD在0.3%～3.0%之间，符合药典规定各组分理论塔板数应>5000，分离度不小于1.5，峰面积校正值≤10%的标准[8]，对照品分离色谱图见图1， 系统适应性及专属性良好。

图1 对照品分离色谱图. 1. 甲醇; 2. 乙醇; 3. 乙醚; 4. 丙酮; 5. 乙腈; 6. 二氯甲烷; 7. 正己烷; 8. 正丙醇; 9. 乙酸乙酯; 10. 四氢呋喃; 11. 四氯化碳; 12. 庚烷; 13. 甲苯; 14. N,N-二甲基甲酰胺 Fig.1 Chromatogram of reference materials Peaks:1. Methanol; 2. Ethanol; 3. Ether; 4. Acetone; 5. Acetonitrile; 6. Dichloromethane; 7. N-hexane; 8. n-propanol; 9. Ethyl acetate; 10. Tetrahydrofuran; 11. Carbon tetrachloride; 12. Heptane; 13. Toluene; 14. DMF

3.2 线性关系、定量限及检出限

根据《中华人民共和国药典》2015年版第四部0861残留溶剂测定法中的规定，12种溶剂的残留限度值分别为：甲醇0.3%、乙醇0.5%、乙醚0.5%、丙酮0.5%、乙腈0.041%、二氯甲烷0.06%、正己烷0.029%、乙酸乙酯0.5%、四氢呋喃0.072%、四氯化碳0.0004%、庚烷0.5%、甲苯0.089%[8]。取9个20 mL的顶空瓶，分别加入CBT108样品1.0 g，移取对照品溶液浓度的80%、100%和120%各3份至顶空瓶中，分别进行测定。测定结果如表2所示，药典规定待测物的回收率应在90%～110%之间，样品测定结果均在此范围内，可满足实际分析要求。

3.3 回收率

分别取混合对照品溶液1 mL,用内标溶液稀释定容至100 mL,然后分别稀释成浓度为甲醇0.024～600 μg/mL、乙醇0.1～1000 μg/mL、乙醚0.01～1000 μg/mL、丙酮0.1～1000 μg/mL、乙腈1.025～82 μg/mL、二氯甲烷0.09～120 μg/mL、正己烷0.0174～58 μg/mL、乙酸乙酯0.25～1000 μg/mL、四氢呋喃0.108～144 μg/mL、四氯化碳0.16～0.8 μg/mL、庚烷0.0075～600 μg/mL、甲苯0.0445～178 μg/mL的系列标准工作溶液。按上述色谱条件进样测定，以峰面积校正值(Y)对相应溶剂的质量浓度(X, μg/mL)绘制标准曲线。12种残留溶剂在各自的浓度范围内线性关系良好。以S/N=3计算检出限(LOD)，以S/N=10计算定量限(LOQ)，结果列于表1。

表1 12种残留溶剂的标准曲线方程、线性范围、相关系数、检出限和定量限

Table 1 Regression equation, linear range,correlation coefficient, limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) of 12 kinds of residual solvents

分析物Analyte线性方程Regressionequation线性范围Linearrange(μg/mL)相关系数Correlationcoefficient(R)检出限LOD(μg/mL)定量限LOQ(μg/mL)甲醇Methanoly=0．0014x+0．05010．024～6000．99980．00720．024乙醇Ethanoly=0．0017x+0．04220．1～10000．99980．0120．10乙醚Ethery=0．0331x+0．17750．01～10000．99960．0050．01丙酮Acetoney=0．0043x+0．10150．1～10000．99980．0080．10乙腈Acetonitriley=0．0019x+0．0061．02～820．99970．06151．02二氯甲烷Dichloromethaney=0．0049x+0．04150．09～1200．99950．060．09正己烷N⁃hexaney=0．013x-0．09290．017～580．99690．01450．017乙酸乙酯Ethylacetatey=0．006x+0．06780．25～10000．99980．0080．25四氢呋喃Tetrahydrofurany=0．0074x+0．00980．11～1440．99980．0140．11四氯化碳Carbontetrachloridey=0．0425x-0．03540．16～0．80．99730．00040．16庚烷Heptaney=0．0185x-0．30550．0075～6000．99990．0050．0075甲苯Tolueney=0．0295x+0．12540．044～1780．99970．00140．044

3.4 精密度

3.4.1 重复性 取混合对照品溶液10 mL置于20 mL顶空瓶中，密封瓶口，制备6份。按照上述色谱条件，连续注入气相色谱仪，记录峰面积校正值及相对标准偏差，各组分RSD(n=6)分别为：甲醇0.8%、乙醇0.3%、乙醚2.0%、丙酮0.9%、乙腈0.6%、二氯甲烷1.8%、正己烷2.6%、乙酸乙酯1.1%、四氢呋喃1.0%、庚烷3.0%、甲苯1.4%、四氯化碳2.5%。药典规定待测组分含量0.01%以内的重复性RSD可接受范围为4%，上述检测结果表明各溶剂的检测重复性良好。

3.4.2 重现性 取混合对照品溶液10 mL置于20 mL顶空瓶中，密封瓶口，制备6份。分别按照上述色谱条件，连续注入气相色谱仪，由另一名分析人员在不同实验室进行测定，记录12份样品中的峰面积校正值及相对标准偏差。检测各组分RSD(n=12)分别为：甲醇1.2%、乙醇0.7%、乙醚2.2%、丙酮1.1%、乙腈1.0%、二氯甲烷2.0%、正己烷2.5%、乙酸乙酯1.3%、四氢呋喃1.2%、庚烷2.8%、甲苯1.9%、四氯化碳5.5%。药典规定待测组分含量0.01%以内的重现性RSD可接受范围为8%，检测结果表明各溶剂的检测重现性良好。

表2 加标回收实验结果

Table 2 Recovery of the method at three spiking levels

分析物Analyte加入值Added(μg/mL)回收率Recovery(%)相对标准偏差RSD(%，n=3)甲醇Methano乙醇Ethanol乙醚Ether丙酮Acetone乙腈Acetonitrile二氯甲烷Dichlorometh⁃ane240104．04．130099．70．3360102．70．9400103．75．2500101．01．8600102．91．0400102．70．550099．52．4600105．40．7400104．83．8500102．01．6600104．80．332．8101．25．741．096．00．649．2100．82．248．0103．01．060．0100．22．972．0105．20．8分析物Analyte加入值Added(μg/mL)回收率Recovery(%)相对标准偏差RSD(%，n=3)正己烷N⁃hexane乙酸乙酯Ethylacetate四氢呋喃Tetrahydro⁃furan四氯化碳Carbon⁃tetrachloride庚烷Heptane甲苯Toluene23．291．01．329．091．60．734．890．20．1400104．22．2500102．52．4600105．40．357．6103．92．872102．02．186．4105．20．30．3292．40．90．492．01．40．48100．21．140093．20．750095．20．5600101．91．271．2104．11．189101．82．9106．8108．70．8

3.5 分析条件的优化

3.5.1 色谱柱的选择 不同极性的固定相影响待测组分的保留时间、峰形、对称度等重要色谱参数，待测组分的沸点差异也是选择合适固定相的重要影响因素，待分离的12种组分包括极性与非极性溶剂，其中甲醇、丙酮、乙腈极性较大、沸点相似; 使用极性毛细管柱则易导致强极性组分保留时间短、分离不好，且强极性溶剂N,N-二甲基甲酰胺易干扰极性大的组分出峰; 使用非极性毛细管柱虽可减少极性影响但三者沸点相似易导致分离不好。综合考虑上述因素，选择对12种残留溶剂、内标物与N,N-二甲基甲酰胺均分离较好的中极性色谱柱DB-624作为本研究的分析柱。

3.5.2 顶空平衡温度及时间的选择 顶空平衡温度过低会影响气-液两相的平衡，过高则会导致组分结构被破坏、溶剂大量蒸发，影响结果准确性。待测溶剂的沸点在34.6～154℃之间，药典规定顶空平衡温度一般应低于溶解供试品所用溶剂的沸点10℃以下，且应兼顾待测组分的沸点，避免供试品热分解，故选择顶空平衡温度为85℃; 另外，顶空平衡时间过短会使气-液两相不够达到足够的平衡，反之会影响顶空瓶的气密性、降低定量的准确性，故选择平衡时间为40 min; 为防止高沸点组分在传输过程中冷凝，选择提高定量环温度为100℃,传输管温度为110℃。

3.5.3 程序升温与分流比的选择 由于乙醚、丙酮和三氯甲烷沸点较低，故选择40℃为起始柱温，为了防止过低的温度导致峰形扩张，出现拖尾，选择将最终柱温适当升高以满足分析要求，综合各方面因素，升温程序调整为40℃，保持5 min，以10℃/min升温到260℃，保持3 min，同时为了减轻色谱柱负荷提高检测器灵敏度，将分流比调整为25∶1。

3.5.4 溶剂的选择 DMF、DMSO等有机溶剂沸点较高，用顶空时容易残留，干扰检测，另考虑到减少有机组分在有机溶剂中的溶解度，增加其在顶空气体中的含量，使两相更快平衡，选择DMF和水组成的二元溶剂系统作为溶剂。

3.6 实际样品分析

采用本方法对3批CBT108样品进行了分析。在定量分析时，依据实际峰面积，采用内标法进行分析，结果列于表3。样品中可检出甲醇、乙醇和二氯甲烷，但都低于《中华人民共和国药典》的残留溶剂限度值，其余溶剂均未检出。

表3 实际CBT108样品中残留溶剂的测定结果 (%)

Table 3 Determination result of residual sovents in CBT108 real samples (%)

分析物Analyte样品1Sample1样品2Sample2号样品3Sample3甲醇Methanol0．000033NDND乙醇Ethanol0．000133NDND二氯甲烷Dichloromethane0．0001880．0001650．000191ND：未检出(Notdetectable)。

4 结 论

建立了新药CBT108中12种残留溶剂的分析方法，考察了固定相、平衡时间、升温程序和溶剂对组分的分离影响，并验证了方法的可靠性与准确性。本方法不仅可用于CBT108残留溶剂的检测，也可作为检测其它众多药物残留溶剂的方法依据和技术基础，具有良好的实际应用与参考价值。

References

1 MA Bo-Kai, GAO Xia, LIU Wei-Li, LIN Yu-Qing. Chinese J. Anal. Chem., 2016, 44(10): 1528-1532

马博凯, 高 峡, 刘伟丽, 林雨青. 分析化学, 2016, 44(10): 1528-1532

2 CHENG Hai-Ping. Chnese Journal of New Drugs, 2008, 17(20): 1814-1816

成海平. 中国新药杂志, 2008, 17(20): 1814-1816

3 CHI Shu-Yao, WU Di-Ke, SUN Jin-Hong, YE Ru-Han, WANG Xiao-Yan. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(5): 553-557

池舒耀, 伍迪科, 孙晋红, 叶如汗, 王晓燕. 色谱, 2014, 32(5): 553-557

4 B'Hymer C. Pharm Res., 2003, 20(3): 337-344

5 TENG Huai-Feng, TONG Xiao-Bo, SUN Xiao-Juan. China Pharmacist, 2015, 18(2): 317-319

滕怀凤, 佟晓波, 孙晓娟. 中国药师, 2015, 18(2): 317-319

6 In Q3C(R5) Impurities: Guidelines for Residual Solvents, International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use: Geneva, 2011

7 ZHEN Chao, WANG Bo-Chu, ZHU Lian-Cai. Chinese J. Anal. Chem., 2011, 39(7): 1117-1120

郑 超, 王伯初, 祝连彩. 分析化学, 2011, 39(7): 1117-1120

8 Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of People's Republic of Chian (Part 4). Beijing: China Medical Science Press, 2015: 105-109

国家药典委员会. 中华人民共和国药典(第四部). 北京: 中国医药科技出版社，2015: 105-109

9 British Pharmacopeia Commission. British Pharmacopeia. 2011: Appendix VIII L

10 United States Pharmacopeial Convention. United States Pharmacopeial. 2011: USP34-NF29

11 European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare. European Pharmacopeia. 2011: EP7.0

12 CHEN Su-Wei , PAN Yong-Qing.J. Strait Pharmaceutical., 2006, 18(5): 83-84

陈苏伟, 潘永琴. 海峡药学, 2006, 18(5): 83-84

13 Dubernet C, Rouland J C, Benoit J P. Int. J. Pharm., 1990, 64(2-3): 99-107

14 Osawa Z, Aiba M. Polymer Photochem., 1982, 2(5): 339-348

15 Thomasin C, Johansen P, Adler R. Eur.J. Pharm. Biopharm., 1996, 42(1): 16-24

16 Grodowska K, Parezwski A. Acta. Pol. Pharm., 2010, 67(1): 13-26

17 FANG Qiu-Xue, DIAO Xing-Li, WAN Qian-Hong, CHEN Lei. J. Instrum. Anal., 2013, 32(3): 308-313

方秋雪, 刁兴利, 万谦宏, 陈 磊. 分析测试学报, 2013, 32(3): 308-313

18 Peng M, Liu J, Lu D, Yang Y J. J. Chromatogr.Sci., 2012, 50(8): 727-732

19 Saraji M, Khayamian T, Siahpoosh Z H, Farajmand B. Anal.Methods, 2012, 4(16): 1552-1559

20 LIU Yu-Min, LU Qing-Hua, ZHUANG Ming-Zhu, LAI Yi-Jian, MA Gang, ZHU Xin-Yuan. J. Instrum. Anal., 2007, 26(1): 122-124

刘玉敏, 路庆华, 庄明珠, 赖奕坚, 马 钢, 朱新远. 分析测试学报, 2007, 26(1): 122-124

21 XU Xu.Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(4): 331-333

许 旭. 色谱, 2015, 33(4): 331-333

22 HU Chang-Qin, LIU Ying. Acta Pharmaceutica Sinica, 2007, 42(12): 1237-1242

胡昌勤, 刘 颖. 药学学报, 2007, 42(12): 1237-1242

23 TAN Bi-Qin, LIU Yan-Ming. Central South Pharmacy., 2016, 14(8): 846-850

谭必琴, 刘雁鸣. 中南药学, 2016, 14(8): 846-850