一株APMV-4毒株的分离鉴定及其PCR检测方法的建立*

副黏病毒科腮腺炎病毒属的APMVs分为9个血清型(APMV 1～9)。在所有血清型当中，最为熟悉的是新城疫病毒，它是禽副黏病毒1型的代表毒株；但是针对APMV 2～9的研究非常少[1,2]。APMV-4的基因组全长是15054个核苷酸，并与副黏病毒的“六规则”一致。和NDV相同，APMV-4基因组也包含6个非重叠的基因：NP（核蛋白）、P（磷酸化蛋白）、M（膜蛋白）、F（融合蛋白）、HN（血凝素-神经氨酸酶蛋白）和L（RNA依赖性聚合酶）。本研究对分离鉴定的APMV-4型毒株进行PCR检测，建立的检测方法可有效地区分APMV-1型和APMV-4型毒株，为APMV-4的研究提供重要的基础。

在医院中,产科是高风险的科室,同时也是投诉率最高的科室。在我国的医疗纠纷案中,产科医疗纠纷案是占比比较高的类别,也是被所赔率比较高的一种。在我国二胎政策正式开始实施后,好多家庭都选择了要二胎,其中有很多的大龄产妇,有剖宫产史的孕妇的比例有所增加,已经做过剖宫产手术的产妇再次怀孕后孕妇子宫破裂的危险增加了3-7倍,生产过程中的风险也要大很多。因此,妊娠合并症增加,从一定程度上导致产科护理风险加剧。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株及其背景资料、试验动物 APMV-1所用毒株为NDV的GM强毒株、APMV-4 QY毒株均由山东省SPF鸡研究中心分离鉴定保存。NDV抗原和血清、SPF鸡胚均来自山东省SPF鸡研究中心。

1.1.2 试剂 RNA提取试剂盒购自百泰克生物公司、One step RT-PCR试剂盒购自大连宝生物公司。

在大连、山东一带，许多人刚过秋天就开始囤购海参，因为海参中富含的氨基酸、海藻素等有助于人们提高抵御疾病的能力，减少病毒性感冒的患病几率，也能减少陈年疾病的复发。就病理生理学方面而言，首先，冬天气温低，毛细管收缩，外周阻力增大，高血压，脑溢血的风险有所增加，而研究表明海参有明显的舒展血管的功效；其次，冬天人们的运动量明显减少，寒冷还容易使人内分泌失调，诱发支气管炎、肺炎等，海参的粘多糖有提高人体免疫力的作用。在滋补养生方面，海参更具有“八珍之首”之称，可以养血润燥、补肾固本。

1.2.1 毒株分离鉴定 病鸭的组织 （气管、肝脏等）按1：2体积加入灭菌生理盐水，研磨、无菌处理、离心后取上清，按0.1ml/枚的接种量接种9日龄SPF鸡胚3个，弃去24h内的死胚，每6h照蛋一次。收集尿囊液，按常规方法进行血凝和血凝交叉抑制试验。

2018年5月17日俄罗斯国家杜马立法工作委员会正式审议通过了将数字经济的基本条例添加到俄罗斯联邦民法典中的提案。

1.2.2.1 引物设计 参照GenBank中APMV-4的全基因组序列 （No：KC439346）设计 1对引物APMV4-F/R。引物由华大基因公司合成，PAGE plus级别纯化。

1.2.2.3 一步法RT-PCR检测和敏感性试验

APMV4-R：5′-TCAATTTCGAGGTCGGCACA-3′。预计扩增约800bp。

注重工程施工技术的质量监管，对工程整体周期涉及到的技术方案、工序流程、组织结构等内容进行严格的把控。依照安全施工及规范化操作的标准，提升施工技术方案拟定质量，在确保工程质量的前提下，提高工程施工效率。不仅如此，在施工技术质量管理过程中，也需提升施工技术交底工作的有效性，确保施工技术的先进性及适用性。

保全营养不流失，海参做法有讲究。

APMV4-F：5′-TCACAAGGACTCGAGGCAAC-3′

50μl的 RT-PCR 体系如下：RNA 模板 10μl、2×PCR Buffer（含 dNTP） 25μl、混合酶（RTase、HS-taq、RNase inhibitor）2μl、Primer-F/R (20μm) 各1μl、RNase-free H2O 补充至 50μl，设 NDV GM 的RNA和水作为对照。RT-PCR反应条件经优化确定为：RT 42min 30℃，94℃ 3min；随后进行 PCR扩增 94℃ 20s、50℃ 30s、72℃ 30s 进行 35 个 循环，最后72℃延伸4min。取5μl反应产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，紫外观察条带。将分离毒株原液进行10倍的倍比稀释，随后同样进行上述RTPCR操作，确定该方法的敏感性。

针对APMV-4的研究较少，国内只检索到其荧光定量检测方法的文章[3]。近几年来从香港、韩国、南非等地陆续有家养禽、野禽等分离到毒株的报道[4,5]。APMV 2～9诱导NDV感染的机体产生的免疫保护能力也不尽相同 [6]。SH Kim等构建了APMV-4的反向遗传系统，证实F蛋白裂解位点的氨基酸序列并不是病毒感染力的决定因素[7]。

2 结果

2.1 毒株分离 HA检测证实分离毒具有血凝性，效价为4～51og2。HI交叉抑制试验表明其与AIV、NDV、IBV、EDS均无交叉反应。经随机引物扩增，序列测定、blast比对确定其为APMV-4病毒。

学校里有一个小女孩性格腼腆、不善言辞，但是特别喜欢扇子。为了给大家讲好扇子，她认真备课、反复琢磨，还专门跑到扇子店向老师傅请教学习。试讲之后，她认真听取其他“小主讲”的意见与建议。进行自我评价时，她说：“我做‘小老师’的法宝是，我用我的微笑面对每一个同学，让大家愿意跟我互动，同时让微笑成为我内心强大的支撑。每次备课、试讲看似很麻烦，但在这个过程中，我体会到了‘教学相长’。”从浅显的喜欢到认识上的提升，这样一个小小的改变也许会对孩子的未来产生不可估量的影响。

2.2 RT-PCR 扩增 APMV-4分离毒株PCR扩增得到预期大小的扩增片段，约0.8kb。对照组GM NDV（即APMV-1病毒）在此处未出现扩增条带，见图1。

2.3 敏感性试验 将分离毒株原液进行10倍的倍比稀释，随后同样进行RT-PCR操作。扩增结果显示本方法的检测最小量可为102EID50，说明建立的检测方法灵敏性较好。

  

图1 一步法RT-PCR检测结果

2.4 临床应用 选取14份动物攻毒试验后的组织样品进行上述One-step RT-PCR方法的检测。结果检测出了11株阳性样品，经序列比对证实为APMV-4病毒。

3 讨论

综上所述，常规潜艇环境对艇员肾结石和高尿酸血症的患病率及尿酸水平无明显影响，该结论尚需前瞻性研究进一步验证。

本文建立了可用于检测APMV-4的一步法RT-PCR方法，该方法能克隆微量mRNA而不需构建cDNA文库，即cDNA合成与PCR反应在同一Buffer及酶中进行，减少了反应时间。特异性试验表明本方法特异性强，与新城疫病毒(NDV)无交叉反应；灵敏度高，检测最小量可为102EID50。因此，本文所建立的一步法的RT-PCR技术具有快速、准确、灵敏等优点，可用于APMV-4样品的检测，非常适合基层实验室的应用。

参考文献：

[1] Alexander D J.Newcastle disease and other avian paramyxoviruses[J].Revue Scientifique Et Technique,2000,19(2):443-62.

[2] Swayne D E.Newcastle Disease,Other Avian Paramyxoviruses,and Avian Metapneumovirus Infections[M].Diseases of Poultry,2013:87-138.

[3] 王静静,刘华雷,王英丽,等.禽副黏病毒4型荧光RT-PCR检测方法的建立 [J].中国动物检疫,2014(3):68-71.

[4] Abolnik C,De C M,Rees J.Full genomic sequence of an African avian paramyxovirus type 4 strain isolated from a wild duck[J].Virus Genes,2012,45(3):537-541.

[5] Nayak B,Kumar S,Collins P L,et al.Molecular characterization and complete genome sequence of avian paramyxovirus type 4 prototype strain duck/Hong Kong/D3/75[J].Virology Journal,2008,5(1):124-124.

[6] Nayak B,Dias F M,Kumar S,et al.Avian paramyxovirus serotypes 2-9(APMV-2-9)vary in the ability to induce protective immunity in chickens against challenge with virulent Newcastle disease virus (APMV-1)[J].Vaccine,2012,30(12):2220-2227.

[7] Kim S H,Xiao S,Shive H,et al.Mutations in the Fusion Protein Cleavage Site of Avian Paramyxovirus Serotype 4 Confer Increased Replication and Syncytium Formation In Vitro but Not Increased Replication and Pathogenicity in Chickens and Ducks[J].Plos One,2013,8(1):e50598.□

食尚资讯 冬季食疗养生首选海参，海参哪些吃法最受欢迎

冬季滋补吃什么？大雪掀起海参热。

1.2.2 PCR方法的建立

1.2 方法

1.2.2.2 RNA提取 取GM和QY毒株各200μl的尿囊液来提取病毒RNA，提取过程按照百泰克生物公司的RNA提取操作进行，最后用25μl DEPC水来溶解RNA，提取后立即进行后续的RT-PCR。

7.2.12根腐病①加强管理，保持树体生长健壮。多施有机肥，病树可施入赛众28微肥2～3公斤，使土壤透气性良好，根系在生长良好的条件下抗病力强。尽量不用山洪等污水灌溉。②加强早期落叶病、腐烂病的防治，避免引起树体衰弱，诱发根腐病。③对发病树及周围可被侵染的植株，用甲基硫菌灵800倍，硫酸铜300～400倍液灌根。连片发病时有必要挖深60厘米、宽20～30厘米的隔离沟，防止传播蔓延。

实习后，很多护生开始对当前高风险、高奉献、低收获的职业困境产生思虑。由于个体间差异及实习经历不同，实习护生对护理行业的情感体验不尽相同。部分护生虽有心理落差，但对护士角色存在认同(“感觉和未来又接近了一步……无愧于‘白衣天使’的称号”[1])；部分护生对护理职业前景产生动摇(“希望能考取公务员，或者做护理教师”[7]，“我要开始做两手准备……有合适岗位，我肯定会转行”[8])。

海参是一种低胆固醇、低脂肪、高蛋白的食物，营养价值丰富，为了在食用过程中营养成分最大吸收，海参的做法也很有讲究。宫品海参相关负责人向我们介绍了海参的常见做法：

RLS算法采用滑动窗形式的数据观察区间，每接收一个新采样的信号向量，Rxx和rxd的估计值都更新一次，对于第n个采样时刻，其数学表达式如下:

一、炖是海参最正确、最健康的做法。海参与瘦猪肉、鸡肉、羊肉一起小火炖煮或煲汤，肉质鲜嫩，汤汁鲜美，能缓解肠燥便秘、小便频数。切记高温，容易导致营养成分的分解流失。

二、熬粥也是冬季海参的最佳食用方法之一。配上枸杞、胡萝卜等熬粥，味道鲜美，有利于海参自身营养的释放，并且容易操作。

三、水煮海参的营养价值虽不及前两种，但寒冬腊月，水煮海参确也不失为一种家常的做法，方便快捷，先武火烧沸，在文火煮上半小时即可。

四、海参的错误打开方式，海参最忌讳红烧，因为红烧会使营养成分大量流失，滋补效果大大降低。另外，做海参时切忌使用高压锅，锅内过高的温度也会造成营养物质的流失。