病理英文文献

1 精神障碍患者的病耻感 作者：郑维瑾，宋立升 文献出处：国际精神病学杂志 年代：2007 期号：第3期 2 精神疾病患者病耻感的研究进展 作者：徐晖，李峥 文献出处：中华护理杂志 年代：2007 期号：第5期 3 病耻感让一切变得复杂 文献出处：中国新闻周刊 年代：2006 期号：第10期 4 精神疾病病耻感的精神动力学分析及对策 作者：俞峻瀚 肖泽萍 文献出处：上海精神医学 年代：2006 期号：第1期 5 精神疾病病耻感形成的相关因素及对策 作者：蒋锋，汤宜朗，侯也之 文献出处：中国心理卫生杂志 年代：2002 期号：第10期 6 精神病患者家属病耻感调查及相关因素分析 作者：陈熠，岳英，宋立升 文献出处：上海精神医学 年代：2000 期号：第3期 7 消除偏见去掉病耻感--让更多的精神病患者得到治疗 作者：项铮 张明园 文献出处：科技文萃 年代：2001 期号：第8期 8 消除偏见去掉病耻感——让更多的精神疾病患者得到治疗 作者：项铮，张明园 文献出处：科技文萃 年代：2001 期号：第8期 9 精神病患者的家属病耻感调查及相关因素分析 作者：陈熠 岳英 宋立升 文献出处：上海精神医学 年代：2000 期号：第12第1-4期 10 抛弃病耻感抑郁可治愈 文献出处：科学大观园 年代：2003 期号：第12期

骨关节炎滑液中肿瘤坏死因子α活性检测及滑膜组织超微结构观察中华外科杂志 1998年第2期第36卷 骨科基础研究作者：邓廉夫 柴本甫 李慧 齐进单位：200025 上海市伤骨科研究所关键词：骨关节炎；滑液；肿瘤坏死因子；显微镜检查，电子 【摘要】 目的 进一步探讨滑膜参与骨关节炎病理进程的机理。方法 采用L929细胞毒活性法检测了24例急、慢性关节内损伤及晚期骨关节炎（OA）患者关节滑液中肿瘤坏死因子(TNF-α)生物活性，并用光镜和电镜观察比较三者滑膜组织间的形态学差异。结果 OA滑液中所含TNF-α水平较高；OA滑膜细胞性内膜，细胞增殖与脱落同时发生，内膜下层呈现明显的纤维增生性变、滑膜增厚；B型和A型滑膜细胞的超微结构变化分别呈现旺盛的蛋白分泌相和活跃的吞噬功能。结论 OA滑膜细胞的功能改变是其滑液中TNF-α升高的原因之一；滑膜的变性既可受变性软骨产物的介导，又可导致OA的进展。 Bioassay of TNF-α in synovial fluid and ultrastructural observation of synovium from patients with osteoarthritis Deng Lianfu,Chai Benfu,Li Hui,et Shanghai Institute of Traumatology and Orthopaedics, Shanghai 【Abstract】 Objective To better define the role of synovium in the pathogenesis of osteoarthritis (OA)Methods We measured the bioactivity of tumor necrosis factor-α(TNF-α) in synovial fluid (SF) and exammined the histologic and ultrastructural features of the synovium from patients with OA and from patients with acute and chronic traumatologic Results The results showed that the levels of TNF-α in SF from OA were significantly Marked fibrosis and thickened intima were found in OA synovium, with much dense collagen,which,in some cases, was banded,but no specific inflammtory changes were Type B cells in OA synovium had the characteristics of organelles of cells active in synthesizing and secreting Type A cells in OA synovium had the features of the Conclusion Evident fibrosis in synovium may be either mediated by the cartilage degradation product or by the enchanced joint damage process in OA 【Key words】 Osteoarthritis Synovial fluid Tumor necrosis factor Microscopy,elec- tron 近年来，在关节疾病发生、发展机理的研究中，细胞因子的介导作用日益受到重视〔1,2〕。本研究通过检测及观察比较不同形式关节内损伤和骨关节炎（OA）滑液中肿瘤坏死因子(TNF-α)含量和滑膜超微结构的变化，旨在进一步探讨滑膜参与OA病理进程的机理。资料和方法 滑液标本：本组24例患者，其中OA行全髋、全膝关节置换术者9例（男5例、女4例，年龄62±4岁）；股骨颈囊内骨折行股骨头置换术者6例(男2例、女4例，年龄67±6岁)；股骨头无菌性坏死行股骨头置换术者5例(男4例、女1例，年龄57±6岁)；胫骨平台骨折、半月板损伤行关节镜清创术者4例(男3例、女1例，年龄5±1岁)。 术前抽取每一患者关节滑液2～5ml，4 000r/min离心30分钟，置1ml离心管分装，-50℃冷藏、待测。 滑液中TNF样物质生物活性检测：用L929细胞毒活性测定法〔3,4〕。重组人TNF-α标准品由上海生物化学研究所华新公司提供。测定结果以L929细胞杀伤率(KR)表示。 KR（％）＝〔阴性对照(OD)－标本(OD)〕÷〔阴性对照(OD)－阳性对照(OD)〕×100％ 阴性对照为L929细胞＋更生霉素D；阳性对照为L929细胞＋重组人TNF-α＋更生霉素D。 滑液中TNF-α特异性检测：将TNF-α单克隆抗体（军事医学科学院基础医学研究所）1∶10稀释后加入重组人TNF-α和待测滑液标本中，37℃作用1小时、4℃作用30分钟，2 000r／min离心10分钟，取上清，检测其L929细胞毒活性。 滑膜标本及处理：患者滑膜标本取材同滑液标本。无明显关节疾病的尸检滑膜标本2例，作对照。分不同部位，取滑膜组织2块(约1cm×1cm)，近内膜处取滑膜约5mm2，PBS漂洗，常规电镜制片，铅、铀双重染色，日立H-500型透射电镜观察；余下标本，常规电镜制片，HE和AS染色，光镜观察。结 果 一、滑液中TNF样物质的生物活性 在所有被检测的滑液标本中，均呈现L929细胞毒作用，但不同来源的标本，对L929细胞杀伤率不同（KR值为66％～84％）。以KR=90％为界，KR＞90％者：OA组7例（7/9）；股骨头无菌性坏死患者和股骨颈囊内骨折患者作为老年性慢性关节内损伤组（CAT）2例（2/11）；胫骨平台骨折和半月板损伤作为急性关节内损伤组（AAT）2例（2/4）（图1）。图1 三组患者关节滑液中TNF-α的KR值及发生频数示意图 采用四格表确切概率法（x2）进行组间统计学处理，OA组患者滑液所含TNF-α水平较高，对L929细胞毒作用的发生率明显高于CAT组及AAT组（P≤0215）。 二、滑液中TNF-α的特异性 滑液标本中加入1∶10稀释的TNF-α单克隆抗体后，其L929细胞毒活性物质可被完全或大部分中和，从而使KR值接近于阴性对照。 三、滑膜的形态学观察 滑膜组织学结构： (1)正常滑膜：滑膜层细胞性内膜由2～3层滑膜细胞组成，较疏松地平行排列，包埋在基质中；基质内的纤维成份由内向外逐渐增多，至内膜下层胶原纤维呈波浪状；细胞性内膜无明显基膜，因此与内膜下层分界不明显。滑膜下层结构疏松，含有较多的脂肪组织及纤维网状组织。 (2)急性胫骨平台骨折及半月板损伤滑膜：与正常滑膜比较，有较多血细胞为主要表现，血细胞多分布于内膜下层，但无多核性巨噬细胞。 (3)股骨颈囊内骨折滑膜和股骨头无菌性坏死滑膜：两者组织学特征呈现相似的变化，细胞性内膜细胞狭长，1～3层平行排列，其间基质成份稀少；内膜下层较薄，极少有细胞成分。 (4)OA滑膜：细胞性内膜细胞较大、变圆，平行排列；有的部位细胞层缺失，使内膜下层纤维呈绒毛状突出于滑膜内表面，而有的部位细胞层增多，可达6层，细胞间质成分较多(图2)；内膜下层增厚，以波浪状胶原纤维成分为主，有的部位呈束状(图3)；滑膜层（细胞性内膜至滑膜下层脂肪组织）可达50～55mm，纤维间缺乏细胞成分。 滑膜超微结构： (1)正常滑膜：正常滑膜细胞性内膜可分为A、B型细胞。A型细胞较多、形似巨噬细胞，细胞器以吞噬相为主要特征，包括发达的高尔基体，分散于胞质内的多种形式的小泡或囊泡和溶酶体；胞膜有较多细长的突起伸向间质；B型细胞形似成纤维细胞，细胞器以蛋白分泌相为主要特征，包括丰富的成层排列的粗面内质网，较多的高尔基体和线粒体。细胞间质为颗粒状或细丝状不定形纤丝，逐渐向内膜下层过渡为有周期性横纹的胶原纤丝。 (2)急性胫骨平台骨折和半月板损伤性滑膜：滑膜细胞以B型细胞为主，呈三角形或柱状；B型细胞蛋白分泌相旺盛，粗面内质网呈池状扩张，胞质内可见有脂滴及小泡；细胞膜较少突起；细胞周围有纵横排列的具周期性横纹的胶原纤丝；内膜下层胶原纤丝束状排列(图4)。 (3)股骨颈囊内骨折滑膜：滑膜细胞以A型滑膜细胞为主，细胞膜有不规则突起，细胞质内含有大量的溶酶体、丰富的高尔基体、囊泡及脂滴(图5)；B型细胞狭长，胞质内细胞器较少；细胞周围胶原纤丝稀疏(图6)。 (4)股骨头无菌性坏死滑膜：A型滑膜细胞体积较大，形态不规则，胞膜具有绒毛状或指状突起，胞质内含大量的溶酶体、吞噬物及囊泡(图7)；B型细胞形态不规则，胞膜突起较长，胞突内及细胞周围可见胶原纤丝。 (5)OA滑膜：滑膜细胞体积较大，A、B型细胞都呈现功能活跃相。A型细胞呈三角形，胞膜有微绒毛样突起，胞核染色质常凝集成团块状，细胞质内含大量的溶酶体及小泡(图8)；B型细胞呈极度活跃的蛋白分泌相，并含有较多的囊泡(图9)。细胞间常呈斑点和缝隙样连接。在滑膜细胞层内，尚可见三角形具较长突起的细胞，细胞质内较少细胞器，但含有丰富的中丝分布于核的周围。A、B型细胞周围具周期性横纹的胶原纤丝丰富。讨 论 在已知的细胞因子中，IL-1、TNF-α和IL-6是参与OA发病进程的重要介质。实验性OA的早期，TNF-α是滑液中最先出现的细胞因子，并与关节软骨的降解相关〔5〕。TNF-α既协同IL-1的作用，又可激活IL-6基因、诱导IL-6的生成，在OA的发生、发展中有可能起着决定性作用〔6〕。一般认为TNF-α可来源于由单核细胞等浸润的炎性滑膜组织及变性软骨细胞。然而，本研究发现，除变性的软骨细胞等因素外，晚期OA与其滑液中TNF-α含量增加相关的滑膜组织并非表现为明显的炎性病变，而以A、B型滑膜细胞功能异常活跃为主。因此，可以认为滑液中TNF-α的异常升高主要归因于滑膜A、B型细胞的功能异常。 OA通常被分为原发性和继发性，但两者并无明显的病理学差异。继发性OA可由多种原因所诱发，关节创伤几乎不可避免地引起OA〔7〕。既往的动物实验表明，单一的急性滑膜炎症并不能诱发OA，只有对滑膜炎性病变的关节施加可致关节不稳定性因素时，才能导致OA的发生〔8〕。本研究发现，因胫骨平台骨折和半月板损伤所造成的关节内创伤，B型滑膜细胞数量增加、功能旺盛，从而使内膜下层胶原纤维含量丰富。这种现象在晚期OA滑膜组织同样发生，并且滑膜组织的纤维化程度及厚度增加更为明显。提示其间可能存在的某些因果关系。关节创伤后，一方面机体对损伤后的保护性限动，加速关节软骨的退变〔7〕；另一方面滑膜组织细胞因对创伤的反应性而出现异常增殖和功能改变，使关节滑液出现异常蛋白分子（包括细胞因子等），进而刺激滑膜细胞的增殖〔9〕，使关节力学特征因滑膜纤维化(甚至瘢痕化)而改变，关节软骨细胞生活微环境进一步向非生理方向变化，形成恶性循环，结果导致关节软骨细胞变性，呈现OA的病理特征。这其间更复杂的机理有待进一步阐明。 关节软骨的退变及变性软骨细胞的产物，可促进滑膜细胞的增殖和功能。股骨颈囊内骨折和股骨头无菌性坏死，作为关节内亚急性及慢性创伤的病因，本研究未发现滑膜组织明显的纤维性增生现象，坏死组织主要刺激A型滑膜细胞，使其数量增加、吞噬功能活跃。而在关节软骨并不坏死的情况下，关节内损伤早期及晚期OA，B型滑膜细胞功能异常旺盛、蛋白分泌相活跃；在OA，因脱落关节软骨碎片等异物刺激，A型滑膜细胞同时亦呈现功能活跃相。提示滑膜细胞，尤其是B型滑膜细胞的生物学活性提高，可能由变性软骨细胞的分泌物所介导。这种介导作用还表现为，OA滑膜组织内，有些A型滑膜细胞质内含有丰富的中丝，这可能与细胞的迁移、转化有关〔10〕。图2 骨关节炎滑膜组织，细胞性内膜厚薄不均，内膜下层细胞成分极少(HE×5) 图3 骨关节炎滑膜组织，内膜下层胶原纤维呈波浪状或束状排列(AS×130) 图4 急性胫骨平台骨折滑膜B型细胞，呈三角形、蛋白分泌相旺盛(TEM×5000) 图5 股骨颈囊内骨折，A型滑膜细胞含大量吞噬囊泡及高尔基体，细胞膜呈指状突起(TEM×5000) 图6 股骨颈囊内骨折，B型滑膜细胞狭长，细胞质内细胞器较少(TEM×5000) 图7 股骨头无菌性坏死，A型滑膜细胞含大量的吞噬异物(TEM×5000) 图8 骨关节炎，A型滑膜细胞膜微绒毛状突起，细胞质内含大量溶酶体及小泡(TEM×4000) 图9 骨关节炎，B型滑膜细胞，呈蛋白分泌旺盛相，细胞周围有大量的胶原纤丝(TEM×4000)参 考 文 献 1 Pelletier JP, Di Battista JA, Roughleg P, et Cytokines and inflammation in cartilage Rheum Dis Clin North Am,1993,19:545- 2 Arend WP, Dayer JM Inhibition of the production and effects of interleukin-1 and tumor necrosis factor-α in rheumatoid Arthitis Rheum, 1995,38:151- 3 Flick DA, Gifford GE Comparison of in vitro cell cytotoxic assays for tumor necrosis J Immun Method, 1984,68:167- 4 郑永唐,贲昆龙 测定细胞存活和增殖的MTT方法的建立 免疫学杂志,1992,8:266-269． 5 Venn G, Nietfeld JJ, Duits AJ, et Elevated synovial fluid levels of interleukin-6 and tumor necrosis factor associated with early expermental canine Arthritis Rheum, 1993,36:819- 6 邓廉夫,柴本甫 IL-1、TNF和IL-6与骨关节炎 国外医学创伤与外科基本问题分册,1996,17:102- 7 Howell DS Pathogensis of Am J Med, 1986,80:24- 8 Walker ER, Boyd RD, Wu DD, et Morphologic and morphometric changes in synovial membrane associated with mechanically induced Arthitis Rheum, 1991,34:515- 9 Gitter BD, Labus JM,Lees SL,et Charateristics of human synovial fibroblast activation by IL-1β and TNF-α Immunology, 1989,66:196-200． 10 Meek WD, Raber BT, McClain OM, et Fine structure of the human synovial lining cell in osteoarthritis:its prominent Anat Record, 1991,231:145-

★植物组织培养（PlantTissueCulture）：是指通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照、湿度）进行培养，使其产生完整植株的过程。（主要有原生质体（Protoplast），悬浮细胞，组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织），器官（胚，花药，子房，根和茎）的培养。其中最常见的是愈伤组织培养。） ★愈伤组织（Callus）：原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组培中则指人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。 ★植物细胞全能性（Cellulartotipotency）：任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。（Haberlandt,1902） ★微（快）繁步骤（micropropagation）： 母株（完整）→外植体（母株的一小部分，种子亦可）→接种到培养基上→长芽（继代增殖）→长根（试管外生根亦可）→练苗，驯化→完整植株 ★组培发展简史：细胞学说：Schleiden和Schwann。探索：20世纪初，Haberlandt提出“细胞全能性”（1902）；1904年，Hanning培养萝卜和辣根菜的胚成功；Laibach（1925,1929）亚麻种间杂种胚培养成功，证明胚培养在植物远缘杂交上可利用；1922年，Robiins（美）和Kotte（德）离体根尖培养成功。奠基：Gautheret，White和Nobecourt，组培奠基人。White和Gautheret发现了B族维生素和生长素；Skoog（1944）和Skoog和崔（1951）等发现腺嘌呤和生长素的比例控制芽和根的形成，Overbeek等（1941）首次将椰子汁（CM）作为添加剂，Steward等在胡萝卜组培也使用CM；1952年，Morel和Martin首次证实通过茎尖离体培养可获无病毒植株；1953-1954年，Muir单倍体培养获得成功；1955年，Miller分离出激动素（KT）；1957年，Skoog和Miller提出植物激素控制器官形成的概念；1958年，Steward首次证实Haberlandt的细胞全能性设想；Wickson和Thimann指出CTK打破腋芽休眠；Murashige发展快繁技术；1958-1959年，Reinert和Steward胡萝卜愈伤组培中形成体细胞胚。迅速发展：1971年，Takebe首次由烟草原生质体获得再生植株；1972年，Carlson获得烟草的第一个体细胞杂种；1964年，Guha和Maheshwari由毛曼佗罗离体花药培养胚；1960年，Morel提出离体无性繁殖兰花。……（具体seesee书本或课件） ★组培意义：1、基础理论研究（试验体系的准确性和可重复性，广泛用于细胞、组织的代谢生理及其它生化等方面的研究（如分化问题））。2、应用研究（无性繁殖系快速繁殖的生产、试管苗的商品化，遗传育种，种质保存，克服远缘杂交，种质资源创新，获得转基因植株）。 ★组培应用前景：1、作物育种上的应用（1、花药和花粉培养2、胚胎培养3、细胞融合4、基因工程5、培养细胞突变体6、种质保存）2、作物脱毒和快繁上的应用（马铃薯，兰花）3、在植物有用产物生产上的应用4、在遗传、生理、生化和病理研究上的应用。 ★植物激素调控：auxin/CTK>1(促进生根)；=1(愈伤组织)；<1(促进发芽) ★脱分化（dedifferentiation）：在组织培养中，不分裂的静止细胞，放在一定的培养基上后，细胞重新进入分裂状态。一个成熟的细胞转变为分生状态的过程叫脱分化。 ★再分化（redifferentiation）：一个成熟的植物细胞经历了脱分化后，能再分化而形成完整植株的过程。 ★再分化途径：1、器官发生方式（是指在外植体或愈伤组织的不同部位分别独立形成茎、芽和根，它们为单极性结构，各有维管束与外植体或愈伤组织相连，但在不定芽和不定根之间没有共同的维管束将两者连在一起。）2、胚胎发生方式（外植体直接或通过愈伤组织或悬浮培养产生胚状体。） ★胚状体（embryoid）：是指在组织培养中起源于一个非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育过程形成的具有双极性的胚状结构。其特点有：1、不同于合子胚，因为它不是两性细胞融合产生。2、不同于孤雌/雄胚，因为它不是无融合生殖的产物。3、不同于器官发生方式形成的茎芽和根，因为它经历了与合子胚相似的发育过程且成熟的胚状体是双极性结构。 ★器官发生途径：1、茎尖或茎段培养产生腋芽。2、直接不定芽发生：器官的小块组织在培养基上培养直接诱导产生不定芽。3、间接不定芽发生：器官的小块组织在培养基上培养后先去分化形成愈伤组织，再经分化诱导产生不定芽或不定根。 ★胚胎发生方式：1、直接胚胎发生（从培养物中的器官组织，细胞或原生质体直接分化成胚，中间不经过愈伤组织）2、间接胚胎发生（外植体先愈伤化，然后由愈伤组织细胞分化成熟） 球型胚（globalembryo）→心型胚（heart-stageembryo）→鱼雷型胚（torpedo-stageembryo）→子叶型胚（cytoledon-stageembryo） ★人工种子：是指利用细胞的全能性将离体培养所产生的体细胞或具有发育成完整植株能力的分生组织（胚状体，茎和茎段）包裹在一层含有营养物质并具有保护功能的外膜内形成在适宜条件下能够发育成完整植株的小颗粒。 结构包括人工种皮，胚状体（分生组织），人工胚乳。 ★植物组织培养应用步骤：1、获得无菌外植体，建立起无菌培养体系。2、进行增殖，不断产生不定芽或胚状体。3、生根培养。4、试管苗移栽。 ★外植体选择的原则：1、必须含有活细胞。2、幼嫩组织所含活跃分裂的细胞比例高。3、母珠必须健康并且无任何腐烂或生病的迹象。4、母珠必须活跃生长并且不会立即进入休眠。 ★外植体的确定选择：1、茎尖（园艺植物组织培养中应用最多，繁殖率高，不易发生遗传变异，但取材有限）；2、茎段（采用嫩茎的切段促进腋芽萌发，取材容易）；3、叶（幼嫩叶片组织通过愈伤组织或不定芽分化产生植株，取材容易，操作方便，但易发生变异）；4、花球和花蕾；5、种子、根、块根、块茎、花瓣等。 ★消毒的原则：消毒剂与外植体应接触足够长的时间以除去外植体表面的微生物，但应尽量减少对外植体细胞的破坏。 ★消毒方法：冲洗植物材料除去泥土等大的颗粒→浸入70-75％乙醇，有利于植物表面的浸湿→用5-20％NaClO溶液（加1滴表面活性剂）表面消毒5-10min→用无菌水冲洗至少3遍→与消毒剂接触过的切面在转移到无菌培养基前应切去，因为消毒剂会杀死外露的细胞从而影响营养吸收→切取外植体，通常为10mm的茎段和直径10mm的叶片部分（太大激素作用减弱，太小则不易成活）。 ★消毒注意事项：1、表面消毒剂对植物组织是有害的，应正确选择消毒剂的浓度和处理时间，以减少组织的死亡。2、在表面消毒后，必须用无菌水漂洗材料3次以上以除去残留杀菌剂，但若用酒精消毒，则不必漂洗。3、与消毒剂接触过的切面在转移到无菌基质前需将其切除，因为消毒剂会阻碍植物细胞对基质中营养物质的吸收。4、若外植体污染严重则应先用流水漂洗1小时以上或先种子培养得到无菌种苗，然后用其各个部分建立组织培养。5、HgCl2效果最好，但对人的危害最大，用后要用水冲洗至少5次。 ★茎尖培养：切取茎的先端部分或茎的分生组织部分进行无菌培养。 步骤：无菌培养的建立→芽的诱导→生根培养→试管苗的移栽（遗传变异） 注意点：试管苗移栽过程中，由异养→自养，恒温→温差，无菌→有菌，光弱→光强，湿度高→湿度低，应该保持苗的水分平衡（加塑料薄膜和使用喷雾机），选择适当的基质，注意光、温的条件。 ★安祖花：叶片→诱导愈伤组织→诱导芽→诱导根生根 ↓↑ 增殖→切根→芽的增殖→再培养→壮苗→生根之前 不定胚的诱导：组织片→含有2,4-D的培养基上→产生不定胚→去除2,4-D的培养基上→球型胚→心型胚→鱼雷型胚→植物体。 不定芽的诱导：用BA诱导，在球、心、鱼雷时要去除BA。 ★胚胎培养的意义：1、对于胚乳发育不良或胚与胚乳间不亲和的材料进行离体胚培养，有助于远缘杂交获得成功。2、为研究胚在各个发育时期的营养需要提供了一个很好的机会。3、能对整个胚及其各部分的再生潜力进行研究。 ★胚培养中的两个重要问题：1、胚剥离的方法：剥离的最佳时间是授粉后13-15天。2、培养基的成分：找到合适的培养基，在胚培养中加入蔗糖（能源、保持适当渗透压）。 ★花药培养方法： 取材地点：大田和温室 取材：大多采用单核期的花粉培养，因诱导产生愈伤组织或胚状体的频率较高。 花粉时期的确定：常采用醋酸洋红-碘化钾染色，再压片镜检。实际操作中常根据花蕾长度、大小与花粉年龄的相关性确定。 预处理：低温、高温或交叉处理 培养基：有MS，Nitsch，Miller，B5和N6。低浓度的生长素和细胞分裂素相结合，高浓度的蔗糖对花粉的诱导生长有一定作用。培养基中加入活性炭对提高诱导频率也有一定效果。 消毒、接种和培养：花药→在烧杯中研碎（有溶剂）→过滤→浓度梯度离心→收集中间层→离心 单倍体的鉴定和加倍处理：单倍体用2％秋水仙素处理24小时，愈伤组织细胞自然加倍。 ★花粉花药培养的意义：1、在单倍体细胞中只有一个染色体组，表现型和基因型一致，一旦发生突变，无论是显性还是隐性，在当代就可表现出来，因此单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料。2、在品种间杂交育种过程中，通过F1代花药培养得到单倍体后，经染色体加倍立即成为纯合二倍体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株只需要2个世代和常规育种相比，显著缩短了育种年限。 ★花药培养步骤（用改良的NLN培养基）： F1代花药→形成小孢子→分离小孢子→形成愈伤组织→形成胚→单倍体植株→纯合二倍体 ↓ 形成胚→单倍体植株→染色体加倍形成纯合二倍体 ★原生质分离：酶（纤维素酶，离析酶） 步骤：叶片表面消毒→去除表皮→叶碎片漂浮在含有酶和渗透压稳定剂的溶液中→培育→原生质体沉到培养皿底部→除去酶溶液→将原生质体移入CPW清洗→离心→清洗基质两次→重悬浮于培养基→除去小的个体，用血球计计数→调整到合适的密度重悬浮于培养基。 ★原生质体的培养： 培养基：MS＋NAA0ppm＋BA5ppm＋3％蔗糖＋9％甘露醇 注意：1、原生质体分离后，非常脆弱，需要渗透压保护剂的保护直到细胞壁形成。 2、针对不同的研究对象，培养基中生长素和细胞分裂素的水平要做适当调整。 影响原生质体培养的因素：营养需求（NH4＋不能过多），渗压剂，培养密度（105/mL）， 贮藏条件（通常在黑暗处）。 培养方法：液体基质培养法，半液体基质培养法，固体基质培养法，看护培养。 固体培养的步骤：原生质体移入培养基→1体积含原生质体的培养基与1体积含琼脂糖（40℃）的培养基混和→倒转培养皿在25℃下培养→原生质体重新产生细胞壁并分裂成细 胞团→细胞团于琼脂糖基质中传代培养，培养基中应减少渗压剂以利于愈伤组织的形成→诱导分化成植物的根，茎。 ★原生质体分离培养的意义：1、除去了细胞壁为植物细胞之间的融合扫平了障碍，同时叶为制造新杂种开辟了道路。2、原生质体可摄入外源DNA，细胞器、细菌或病毒颗粒，这些特性与植物全能性相结合为高等植物的遗传饰变打下基础。3、获得细胞无性系和选育突变体的优良起始材料。 ★原生质的融合概念：从同一个种或不同种分离得到的原生质体在适当的条件下融合得到细胞核物质和细胞质物质的混和。 ★体细胞杂交：完全不经过有性过程，只通过体细胞融合制造杂种的方法称为体细胞杂交。 ★原生质体融合方法：自发融合，诱发融合（NaNO3处理，高PH-高浓度钙离子处理，PEG处理，电融合） PEG法： 取材（1、从绿色叶片上分离得到的原生质体。2、来源于同种或不同种的细胞悬浮培养物上分离出的无色原生质体）－这样异核体和母体就可分辨开。 →分别取在含有13％甘露醇的CPW上悬浮培养的原生质体（密度2×105）4mL，混和在100g的转速下离心10min，将原生质体放入5％基质→加入30％（w/v）PEG2mL，使原生质体的外膜不稳定，放置10min→每隔5min加入原生质体培养基稀释PEG以促进原生质体融合。每次稀释后轻微摇动原生质体就会重悬浮→混和物在100g下离心10min，离心后在不含PEG的培养基中清洗→离心，在相同的培养基上重悬浮。 PEG法的缺点：有毒，融合率低：不超过1％ 对称融合：父母均未处理，对后代贡献一样。 不对称融合：父母本在后代中贡献不同，射线处理，化学处理 IOA（不影响核的分裂而影响细胞质分裂） ★胞质杂种：利用原生质体融合技术，使两种不同来源的核外遗传成分（细胞器）与一个特定的核基因组结合在一起，就形成胞质杂种。 体细胞杂种和胞质杂种的鉴定方法：形态学，细胞学，分子遗传学。 ★园艺植物脱毒： 热处理脱毒： 原理：在高于正常温度下，植物组织中的很多病毒可被部分或完全钝化，而很 少伤害甚至不伤害寄主组织。 方法：热水处理（对休眠芽效果好），热空气处理（对活跃生长的茎尖效果好） 热空气处理方法：空气温度35-40℃，持续时间：随处理对象不同而变化，几分钟-几星期。 注意点：不能一下子放入高温中，要逐步加温使之适应。并保持湿度和光照。 局限性：1、并不是所有的病毒都对热处理敏感 2、对等径和线状的病毒及类菌质体引起的病害是有效的。 3、热处理后只有一小部分植株能够存活 ★茎尖分生组织：指茎的最幼龄叶原基上方的一部分，最大直径约100μm，最大长度为 250μm。 ★茎尖：由顶端分生组织及其下方的1-3个叶原基一起构成的。 ★茎尖培养脱毒： 原理：病毒在植物体内的分布是不均匀的，在受感染的植物中顶端分生组织通常不含或仅含低浓度的病毒，其它的植物组织离茎尖的距离越远则病毒含量越高。 影响茎尖培养脱毒效果的因素：培养基，外植体大小（脱毒效果跟外植体大小呈负相关，茎尖的成活率与茎尖大小呈正相关），贮存条件（光照培养优于暗培养），外植体的生理状态（活跃生长的芽，顶芽的效果比腋芽好，切割芽的时间） ★通过愈伤组织培养脱毒： 原理：在由受感染的组织形成的愈伤组织中，并非所有的细胞都均匀一致地带有该种病原体。 产生原因：1、病毒的复制速度跟不上细胞的增殖速度 2、有些细胞通过突变获得了抗病毒的特征。 ★脱毒植物的鉴定：外观判断法，指示植物法（接种鉴定法），抗血清鉴定法，电镜检查法， 分光光度法，酶联血清免疫吸附反应鉴定法。 指示植物法：利用病毒在其它植物上产生的枯斑作为鉴别病毒的标准。 指示植物：专门选用以产生局部病斑的寄主称为指示植物。 ★无毒原种的保存：种在温室或防虫罩内灭过菌的土壤中，隔离区内，通过组织培养繁殖。 组培常见英汉对照 abortion（败育）adenine（腺嘌呤）agar（琼脂）anther（花粉）apical（顶端的）aseptic(无菌的)auxin（生长素）axillarybud（腋芽）callus，calli（愈伤组织）cellulartotipotency（细胞全能性）cellulase（纤维素酶）cellulose（纤维素）centrifuge（离心）chloroplast（叶绿体）chromosomedoubling（染色体加倍）colony（细胞团，菌落）cybrid（cytoplasmichybrid,胞质杂种）cytokinin（细胞分裂素）cytoplasm（细胞质）degeneration（败育）dedifferentiation（脱分化）redifferentiation（再分化）dicotyledonous（双子叶的）dihaploid（二单倍体）diploid（二倍体）dissect（剥离）dormancy（休眠）eliminate（除去）embryo（胚胎）embryoid（胚状体）embryogenesis（胚胎发生方式）epidermis（表皮，上表皮）excise（切除）explant（外植体）filterpaper（滤纸）gelose（琼脂糖）genetype（基因型）germplasm（种质）globalembryo（球型胚）haploid（单倍体）heterokaryon（异核体）homozygous（纯合的）hormone（激素）interspecific（种间的）intraspecific（种内的）invitro（体外）invivo（活体）kinetin（激动素）macerozyme（离析酶）malesterile（雄性不育）medium（培养基）membrane（膜）meristem（分生组织）meristemculture（茎尖培养）micropropagation（微繁）microspore（小孢子）monocotyledon/moncots（单子叶植物）nodculture（茎段培养）organelle（细胞器）organgenesis（器官发生方式）osmotic（渗透的）pith（髓）plantlet（小植株，苗）pollenculture（花粉培养）pollinate（授粉）protocorm（PLB）原球茎protoplastfusion（原生质体融合）rapidpropagation（快繁）regeneration（再生）self-incompatibility（自交不亲和）shoottip（茎尖）sodiumhypochlorite（NaClO）somaticembryo（体细胞胚）somatichybridization（体细胞杂交）somatichybrid（体细胞杂种）stem（茎）stemtipculture（茎尖培养）sterilant（消毒剂）steriledistilledwater（蒸馏水）sterilization（消毒）stockplant（母株）subculture(继代)sucrose（蔗糖）terminalbud（顶芽）transfer（转移）viruseradication（脱毒） 常用缩略语 ABA（脱落酸）CM（椰子汁）CPW（细胞-原生质体清洗液） DMSO（二甲基亚砜）IAA（吲哚乙酸）IBA（吲哚丁酸） KT（激动素）NAA（萘乙酸）PEG（聚乙二醇） LH（液氮）CH（水解酪蛋白）GA3（赤霉素）