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李吉吉jjj
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胃食眉眉

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金仁桃 章孝荣( 安徽农业大学畜牧水产学院 合肥230036 ) �� 自Evans和Kaufman(1981)从延迟着床的胚胎中分离出小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells, ES细胞)以来,ES细胞一直备受人们的关注��〔1〕�。1998年,由基隆公司资助的汤姆森研究小组在《科学》杂志上发表了关于人的ES细胞建立等一系列工作之后,基隆公司的股票更是狂升了6倍;1999年、2000年,干细胞研究两度被美国《科学》杂志推举为21世纪最重要的研究领域;1999年,美国《科学》杂志还将干细胞研究评为当年世界十大科学成就之首。由此足以显示干细胞的魅力,而干细胞之所以如此吸引人们的注意,主要是因为干细胞是一种全能性的细胞,可以自发分化形成多细胞结构,即胚胎小体(embryonic body,EB)。EB含外胚层、内胚层、中胚层三个胚层,胚胎小体继续分化可以形成多种细胞类型,包括血细胞、内皮细胞、肌细胞及神经元等。另外ES细胞在动物克隆生产、转基因动物生产、疾病研究模型及药物生产等诸多方面有着诱人的前景。本文主要就ES细胞在克隆动物生产的应用加以阐述。 �1 ES细胞克隆的理论依据 � ES细胞是从早期胚胎内细胞团(inner cell mass, ICM)和附植后原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)分离出来的一种细胞,它具有全能性(totipotenty)或多能性(pluripotency),可以发育为任何一种组织或器官的前体细胞,再由该前体细胞发育成功能细胞。正常的ES细胞可分化为两个子代干细胞,也可以分化一个子代干细胞和一个功能细胞。 这种分化是由干细胞内源性调控(主要是受干细胞内结构蛋白和多肽因子调控)和外源性调控(主要是由周围组织细胞及细胞外基质等调控)所影响。而最近Amato Giaccia 发现氧含量操纵干细胞的分化,为人们进一步利用干细胞提供了有益的提示。另一个重要发现就是Andrew E Wurmser等发现成熟组织的干细胞仅仅是通过与现存细胞融合而形成其他组织,而非制造新细胞,那么对成熟组织的干细胞利用,将趋于更加谨慎��〔2〕�。这也更加提升了ES细胞的作用。 �ES细胞另外一个特点是它像正常的体细胞一样可以在体外进行增殖、克隆、冷冻、保存而保持不分化。这样就可以为人们提供大量的可利用的ES细胞。如每只实验动物一次可提供5000~6500个PGCs,然后在体外可培养成类ES细胞。现在人们可将ES细胞体外培养传至40~60代而不分化,而这样大量的细胞就为我们利用它奠定了基础。 �ES细胞具有可操作性。在体外人们可以对其进行遗传操作选择,如转基因、基因打靶、配合基因诱捕等一系列技术,再结合核移植技术,生产出人们所希望的动物。 �2 ES细胞克隆的可行性 � 克隆技术的原理是将供体细胞核移入去核的卵母细胞中,通过激活使其重新编程发育,从而产生新个体。目前体细胞克隆相对于ES细胞来说,存在有两个问题:一是体细胞在体外培养易变异。为避免这一缺点,目前较多使用新分离或传代较少的细胞。二是关于选用何部位的细胞。目前人们已使用了乳腺细胞、卵丘细胞、输卵管细胞、皮肤成纤维细胞、子宫上皮细胞、肌肉细胞、支持细胞、肝脏细胞、耳成纤维细胞、初乳中乳腺上皮细胞等。但到目前为止,还没有发现何种体细胞是最适合于核移植的,所用作核移植的细胞有的来自于胎儿,一般是成纤维细胞,也有来源于成体动物的。这主要是因为虽然从理论上讲,机体中的每一个细胞都是从受精卵分裂分化而来,而在机体内通过半保留复制方式,DNA信息被完整的传递下来,但从一个受精卵到机体的亿万个细胞,有些细胞的个别基因可能发生不可逆的丢失或重排,使用这样的细胞作核供体,就无法保证信息的完整性,这也可能是目前细胞克隆中普遍存在的克隆效率低,出生后的死亡或异常的原因之一。ES细胞的核移植虽然也同样需要在去核的卵细胞内重新编程,但是相对于体细胞克隆效率低、妊娠期间易流产来说,ES细胞的克隆效率要高得多,而且ES细胞的重新编程要容易得多。这也正如人们所假设的目前存活的克隆个体所用的供体核大多是源于动物组织的成体干细胞的核而非最终分化的细胞的核〔3〕�。 �随着对ES细胞研究的深入,人们已经在多种动物得到了ES细胞核移植的后代。Teruhiko Wakayama等采用长期传代(30代以上)的小鼠ES细胞克隆出了31只小鼠,其中14只存活〔4〕�; Campbell (1996、1995)分别将绵羊、山羊的类ES注射入去核卵母细胞,获重构胚,经核移植有活羊出生��〔5〕�。Michelle Sims和N.L First(1993)将培养6~101d牛的ICM细胞核移植到去核卵母细胞,卵裂率为70%,囊胚率为24%,经胚胎移植有13头妊娠,出生了4头牛犊��〔6〕�; Stice(1996)将牛的类ES细胞进行核移植,得到重构胚并移入受体牛子宫,发育至45天��〔7〕�;Cibelli利用转基因技术得到生殖系嵌合的牛;Shim(1997)和Piedrahita(1998),利用猪的PGCs建立多能干细胞系,并得到嵌合体猪。 �3 ES细胞克隆的意义 � ES细胞的核移植最基本的意义就在于,如果通过核移植能够产生完整的后代,而且具有和亲代一样的遗传特性,那么它就恰恰证实了ES细胞是具有全能性的一种细胞。ES细胞克隆和体细胞克隆一样,通过得到的大量具有亲代一样遗传特性的供体细胞,再利用核移植技术,可以提高优秀个体的繁殖效率,迅速扩充优秀个体的种群,为畜牧生产作出极大的贡献。 对于珍稀品种或濒临灭绝的物种来说,该项技术提供了一种可以挽救珍稀或濒危物种的机会。利用ES细胞水平上的基因操作相对于受精卵水平上的转基因更加容易,可以得出人们所需求的转基因动物,然后再运用核移植技术,即可得到大量的具有此基因表达的个体,同时这也是创造新物种的绝好机会。由于ES细胞具有自发融合的性质,由此可在细胞水平上操作, 完成新物种的创造,而这种新物种可能是自然交配无法得到的。人们曾将牛、绵羊及人的GH基因先后导入小鼠基因组,得到的转基因小鼠在快速生长期生长速度为对照组的4倍。另外,利用ES细胞核移植还可以一次得到大量同质的后代,为生物学研究提供了很好的模型。 4 目前存在的问题 � 由于ES细胞的发现至今也只有20多年的历史,因此人们对它的了解有限,限制了对它的利用,目前就干细胞的核移植来说,主要存在以下问题: �1 核移植技术本身还有许多理论有待完善,目前核移植的效率还很低,而对于像重构胚的发育与着床,核质互作与协调等理论还需要人们作进一步的深入研究。 �2 ES细胞建系的技术还不成熟。目前广泛使用的饲养层是小鼠成纤维细胞无限系(STO)或小鼠胚胎成纤维细胞(Primary Mouse Embryo Firbroblasts, PMEF)制备而成,主要是利用其细胞分泌的生长因子FGF和抑制细胞分化的因子LIF共同作用,保持干细胞在体外克隆而不分化,然后加入一些其它的物质。即便如此,目前其建系的效率仍不是很高,特别在国内,能够得到大家畜的类ES的都不是很多,而且得到传代次数较少。人们目前尝试了使用其它的培养基,如大鼠成纤维细胞条件培养基、山羊输卵管上皮培养基、绵羊输卵管上皮培养基、绵羊子宫上皮培养基、山羊子宫上皮培养基、牛的颗粒细胞培养基、牛子宫成纤维细胞培养基、胎牛的睾丸、肾、肝成纤维细胞培养基。Meinecke Tillmann(1996)发现胎牛的成纤维细胞对绵羊的ICM和ES细胞增殖有利。而Piedrahitat等采用猪胎儿成纤维细胞和上皮细胞作为饲养层,结果失败。Strojek等(1990)认为,初步培养囊胚时,使用猪子宫成纤维细胞饲养层可以促进囊胚的贴壁和ICM克隆的形成。此时若用STO作饲养层,尽管猪囊胚可以附着在STO上,但ICM不增殖,但以后的传代只需要STO进行。可见对于饲养层的选择,目前仍有待人们的进一步发现。对于ES细胞的建系,人们还发现,ES细胞必须保持一定的浓度,这是因为ES细胞能够从培养基中摄取营养的同时,也要向培养基中排出自己的分泌和代谢产物和其它一些物质,这些分泌物中,有促进细胞生长的物质,有人就称之为促克隆生长物质。 �ES细胞应用范围是很广的,对于核移植的应用仅是其一部分。例如,利用ES细胞的全能性,进行定向诱导分化,再在细胞水平上进行药物的测试,可以极大提高药物的检测进度;利用ES细胞可建立人类遗传病研究的动物模型等。可以说,对于干细胞的研究方兴未艾。 � 参考文献 �〔1〕Evans M J, Kaufman M H Establishment in Culture of Pluripotential Cells from mouse embryos〔J〕 Nature, 1981, 292(9): 154~156 �〔2〕Andrew E Wurmser, Fred HG Cell fusion causes confusion〔J〕 Nature, 2002,416,485~491 �〔3〕Konrad Hochedlinger, Rudolf J Monoclonal mice generated by nuclear transfer from mature B and T doner cells〔J〕 Nature, 2002,415,1035~1038 �〔4〕Wakayama T, Rodriguez I, Perry AC, et Mice cloned from embryonic stem cells〔J〕 Proc Natl Acad Sci USA, 1990,96(26):14984~14989 �〔5〕CKHS, Mc whiir,J, RWA, et Sheep cloned by nuclear transfer from a cuctured cell line〔J〕 Natrue,1996,38(7):64~66 �〔6〕Sims MM, FirsA NI Production of fetuses from totipotent cultured bovine inner cell mass cells〔J〕 Theriogenology, 1993,39:313 �〔7〕Stice SL, strolchonko NSPluriopotent bovine embryonic cell lines directed embryonic development following nuclear transfer biology of Reproduction〔J〕 Theriogenology, 1996,54:100~110
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穿风衣的猫2012

第1章 生物技术制药总论第1节基因工程与基因工程制药步骤一、基因工程二、基因工程制药的基本步骤三、基因工程制药的具体步骤第2节细胞工程制药一、细胞工程二、细胞工程制药第3节酶工程制药一、酶与酶工程二、酶工程制药第4节发酵工程制药一、发酵与发酵工程二、发酵工程制药第5节蛋白质工程制药一、蛋白质与蛋白质工程二、蛋白质工程制药第6节生物医学工程与生物信息工程一、生物医学工程二、生物信息工程思考题参考文献第2章 基因工程制药第1节基因克隆表达一、大肠杆菌表达系统二、酵母表达系统三、昆虫细胞表达系统第2节各种产物表达形式采用的分离纯化方法一、大肠杆菌细胞内不溶性表达产物二、分泌型的表达产物三、大肠杆菌细胞内可溶性表达产物四、大肠杆菌细胞周质表达蛋白第3节表达产物的活性、安全性评价、稳定性考察一、生物活性(效价)测定二、安全性评价三、稳定性四、产品思考题参考文献第3章 细胞工程制药第1节细胞、细胞工程与细胞工程制药一、细胞二、细胞工程三、细胞工程制药第2节动物细胞工程制药一、动物细胞的全能性二、动物细胞工程制药中的转基因与细胞培养技术第3节植物细胞工程制药一、植物细胞的特点二、植物细胞工程药物研究三、植物细胞融合与核移植技术四、转基因植物药物技术五、植物细胞培养工程六、植物细胞的染色体工程第4节细胞工程制药的应用、前景和存在的问题一、临床用细胞工程药物二、人源化抗体的研制与“分子药田”工程三、细胞工程药物的安全性思考题参考文献第4章 酶工程制药第1节酶工程制药概述一、酶及酶催化特性二、影响酶催化反应的主要因素三、酶的分类四、酶工程和酶工程制药第2节酶工程制药技术一、药用酶的生产技术二、药物的酶法生产技术第3节酶工程制药的现状与前景思考题参考文献第5章 发酵工程制药第1节发酵工程制药基础一、微生物发酵生产的药物二、发酵制药工业中的微生物第2节微生物制药发酵工艺第3节微生物发酵工艺过程的控制思考题参考文献第6章 蛋白质工程制药第1节蛋白质工程制药的概念一、蛋白质工程制药研究的核心内容和基本概念及方法二、改造蛋白质的一些方法第2节蛋白质工程制药方法一、随机诱变二、体外重组三、蛋白质工程制药方法的常用目的第3节蛋白质工程制药现状一、蛋白质定点突变改造思考题参考文献第7章 核酸类药物第1节反义核酸药物一、反义药物的作用机制二、反义药物的设计策略三、反义药物的作用特点四、反义核酸药物的合成与纯化第2节短小干扰RNA(siRNA)一、RNAi的作用机制二、RNAi的特点三、siRNA的制备方法第3节miRNA一、miRNA的基本特征二、miRNA的作用机制三、siRNA和miRNA的异同第4节核酸类药物的临床试验现状与前景一、反义核酸类药物的临床试验现状与前景二、RNAi的临床试验现状与前景思考题参考文献第8章 多肽类药物第1节多肽类药物的概念和优点一、多肽、多肽药物的概念二、多肽药物的优点第2节多肽药物的制备一、固相合成法二、液相合成法三、多肽合成仪法四、酶解法制备多肽第3节多肽药物的稳定性、检测、制剂与给药途径一、多肽药物的稳定性二、多肽类药物制剂的分析方法三、多肽类药物的缓释制剂研究四、多肽药物的给药途径第4节多肽药物的应用一、多肽疫苗二、抗肿瘤多肽三、抗病毒多肽四、多肽导向药物五、抗菌性活性肽六、细胞因子模拟肽七、用于心血管疾病的多肽八、其他药用小肽九、诊断用多肽思考题参考文献第9章 治疗性抗体药物第1节抗体概述一、抗体的基本结构二、抗体的基因组成三、抗原识别特异性的产生四、亲和力与结合力五、类别转换六、药物代谢动力学七、效应功能第2节治疗性小型化抗体第3节单链抗体(ScFv)、单域抗体第4节重组人鼠嵌合单克隆抗体第5节重组人源化单克隆抗体一、人单克隆抗体第6节抗体药物与化疗药物的联合应用思考题参考文献Ⅸ……………………Ⅹ第10章 治疗性细胞株第1节治疗性细胞株——干细胞疗法第2节树突状细胞共培养的细胞因子第3节治疗性克隆第4节核移植与重编程参考文献第11章 细胞因子类药物第1节重组人干扰素一、概述二、IFN的性质、结构和功能三、IFN的生物学活性和作用机制四、IFN的基因工程制备五、IFN的临床应用及不良反应第2节重组人白细胞介素一、概述二、各类IL第3节粒细胞集落刺激因子一、结构与性质二、G?CSF、GM?CSF的临床应用三、G?CSF、GM?CSF的不良反应四、基因重组人G?CSF和GM?CSF第4节促红细胞生成素一、EPO基因和分子结构二、EPO的产生及性质三、重组人EPO的制备四、临床应用五、EPO的不良反应第5节组织型纤溶酶原激活剂一、概述二、性质、结构和功能三、生物学活性及作用机制四、基因工程制备t?PA五、重组t?PA的临床应用第6节肿瘤坏死因子一、概述二、TNF的分子结构与功能三、TNF的生物活性和临床应用四、TNF的制备思考题参考文献第12章 基因治疗第1节基因治疗研究现状一、基因治疗的现状二、目前基因治疗存在的问题第2节基因转移的方法一、基因治疗的概念及步骤二、基因转移方法第3节基因治疗的应用与安全性一、基因治疗的应用二、基因治疗的安全性思考题参考文献第13章 动物基因工程药物第1节动物细胞培养一、动物细胞培养的几个基本概念二、动物细胞培养的基本条件三、动物细胞形态四、哺乳动物细胞冷冻保存五、动物细胞的解冻复苏六、动物细胞的传代培养第2节动物转基因技术一、动物细胞转基因技术二、转基因动物制备技术第3节动物反应器与动物基因工程药物一、转基因动物细胞生物反应器二、乳腺生物反应器思考题参考文献第14章 植物基因工程药物第1节植物基因工程一、植物表达载体的构建二、植物转化第2节植物基因工程药物一、植物基因工程重组蛋白药物二、植物次生代谢工程思考题参考文献第15章 分子靶向药物第1节概述第2节细胞信号转导通路分子靶向药物一、Ras/MAPK通道抑制剂二、蛋白激酶C抑制剂三、环氧合酶?2选择性抑制剂四、端粒酶抑制因子五、法基尼转移酶抑制剂第3节原癌基因和抑癌基因的分子靶向药物一、原癌基因表达的特点二、原癌基因的结构改变形式及其表达激活第4节细胞因子受体分子靶向药物第5节抗肿瘤血管形成分子靶向药物第6节小型化抗体靶向药物第7节自杀基因参考文献第16章 融合蛋白药物第1节重组人肿瘤坏死因子受体—Fc融合蛋白一、肿瘤坏死因子第2节重组抗肿瘤融合蛋白一、融合蛋白与肿瘤二、融合蛋白与恶性肿瘤的演进三、融合蛋白在肿瘤治疗、预防研究中的应用第3节重组人血清清蛋白?干扰素一、干扰素的产生及其结构特点二、干扰素的治病原理三、已上市的衍生干扰素产品第4节重组人成纤维细胞生长因子一、αFGF及FGFR的结构和功能二、生物学功能三、基因工程表达αFGF现状四、αFGF用于临床应注意的问题第5节重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子一、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的分子生物学特征二、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的临床应用三、人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子转基因表达研究第6节白细胞介素一、种类和结构二、生物学活性三、IL的功能思考题参考文献Ⅺ……………………Ⅻ第17章 治疗性激素第1节胰岛素一、胰岛素分子二、胰岛素受体与信号转导三、重组DNA技术制备胰岛素产品四、用胰岛素合成细胞治疗糖尿病第2节人生长激素一、生长激素释放因子与抑制因子二、GH受体、GH的生理作用与GH的治疗作用三、重组huGH与垂体性矮小四、huGH的代谢作用五、GH、泌乳与排卵第3节促性腺激素一、重组促性腺激素二、促性腺激素在兽医学中的应用三、促性腺激素释放激素第4节其他批准用于临床的重组激素一、重组人甲状旁腺激素二、重组降钙素三、重组促甲状腺素思考题参考文献第18章 血液制品和治疗性酶第1节血液代用品一、右旋糖酐二、清蛋白三、明胶蛋白四、携氧血液替代品第2节凝血因子和血友病一、凝血因子Ⅷ二、凝血因子Ⅸ、Ⅶa第3节治疗用酶一、抗凝血酶(AT)二、溶栓剂三、超氧化物歧化酶四、其他治疗用酶思考题参考文献第19章 疫苗技术和分子诊断技术第1节疫苗技术一、传统疫苗制剂二、基因工程疫苗技术与DNA疫苗三、艾滋病疫苗四、肿瘤疫苗五、佐剂技术及作用模式第2节分子诊断技术一、分子诊断的概念及原理二、分子诊断的常用技术方法第3节分子诊断的临床应用一、分子诊断与遗传疾病二、分子诊断与传染性疾病三、分子诊断与肿瘤四、分子诊断与个性化治疗思考题参考文献

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乐乐captain

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小小小小野

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