分子生物学论文2000字

复旦大学社会科学基础部政治学原理1996——2007（注：2007为回忆版）中国古代文学研究中心文史知识1996——1997语言学基础知识1996——1999，2005语言学基础知识1996——1999古代汉语和现代汉语基础1996——1999汉语1994——1999理论语言学1996——1999古籍校读1996——1997美学与文艺学1996——1999中外文学及文艺理论 1995——2000，2003，2005（注：2005年为回忆版）古代文学与现代文学、写作2005（注：为回忆版）中国古代文学史1996——1999中国古代与现代文学1996——1999中国现当代文学1997——1999，2001中文系文艺学专业复试题目 2003写作1996——2001，2005语文与写作1997评论写作1996——2001中国文学批评史1995——1997中国语言文学系语言学基础知识1996——1999，2005古代汉语和现代汉语基础1996——1999汉语1994——1999文史知识1996——1997理论语言学1996——1999古籍校读1996——1997美学与文艺学1996——1999中外文学及文艺理论 1995——2000，2003，2005（注：2005年为回忆版）古代文学与现代文学、写作2005（注：为回忆版）中国古代文学史1996——1999中国古代与现代文学1996——1999中国现当代文学1997——1999，2001中文系文艺学专业复试题目 2003写作1996——2001，2005语文与写作1997评论写作1996——2001中国文学批评史1995——1997外国语言文学学院二外日语1995——1996，1998二外德语1994——1995二外法语1994——1996基础英语1999专业英语1995——1998英美文学史 1996——1998语言学理论（英语专业）1995——1998新闻学院传播实务2004，2007（2004有答案）（注：2007年为回忆版）新闻传播学基础2003——2005（注：2003，2005为回忆版）新闻传播学实务2003（注：为回忆版）新闻理论与中国新闻史1997新闻传播理论1999——2004，2006——2007（注：均为回忆版）中外新闻事业史1998——2000，2002新闻实务2004，2007（注：2007为回忆版）新闻业务（含采访与写作、编辑评论）1996——1998（注：均为回忆版）新闻传播业务1999，2002（注：均为回忆版）历史学系史学概论1996——2000中国近现代史1999中国古代史1995——1997，1999世界上古史中古史1999世界近现代史1999西方经济学（史）1998哲学系外国哲学史2000，2005西方哲学史（含现代西方哲学）1996——1998马克思主义哲学原理2000哲学综合知识2004，2005（注：2005年试卷为回忆版）国际关系与公共事务学院政治学原理1996——2007（注：2007为回忆版）西方政治思想史1999——2005，2007（注：2007为回忆版）国际关系1996——2007（注：2006为回忆版）行政管理学1996——2005（2002——2005有答案）当代中国政治制度1996——2005数学科学学院高等代数1996——2001数学分析1997——2001（1999有答案）常微分方程1995——2001线性代数1998，2000抽象代数2001概率统计1998微分几何1996数学物理方程1999——2001物理学系量子力学1996，1998——2006普通物理1996——2006理论力学1995——1999，2002——2004（2002有答案）固体物理1996——2001电动力学2000——2001现代物理研究所量子力学1996，1998——2006普通物理1996——2006理论力学1995——1999，2002——2004（2002有答案）固体物理1996——2001电动力学2000——2001化学系物理化学（含结构化学）1994——2006（1994——2006有答案）有机化学1992——2006（1992——1995，1997——2006有答案）无机化学与分析化学1994——2006（1994——1996，2000——2006有答案）高分子化学与物理1994——1998细胞生物学1996——2002生物化学1996——2005量子力学1996，1998——2006普通物理1996——2006理论力学1995——1999，2002——2004（2002有答案）固体物理1996——2001电动力学2000——2001法学院法理学2003，2005法学概论1995——2005国际法及冲突法1999——2000，2002——2005国际法（含国际私法） 1995——1998民法学1995——2002，2005商法1999——2000，2002，2005 行政法2002中国法制史1999——2000外国法制史1996——1999，2001外国宪法1995——1998经济法原理1997——1998力学与工程科学系量子力学1996，1998——2006普通物理1996——2006理论力学1995——1999，2002——2004（2002有答案）固体物理1996——2001电动力学2000——2001材料力学1999，2002电子线路(模拟和数字)1996——2003（其中2003年只有模拟部分）电子线路（数字）答案1996——2001电子线路（模拟）答案1999——2001高等代数1996——2001数学分析1997——2001（1999有答案）常微分方程1995——2001抽象代数2001概率统计1998微分几何1996电磁场和电磁波1999电路和信号理论1999材料科学系普通物理1996——2006理论力学1995——1999，2002——2004（2002有答案）固体物理1996——2001电动力学2000——2001电磁场和电磁波1999电路和信号理论1999光源与照明工程系量子力学1996，1998——2006普通物理1996——2006理论力学1995——1999，2002——2004（2002有答案）固体物理1996——2001电动力学2000——2001电磁场和电磁波1999电路和信号理论1999分析测试中心物理化学（含结构化学）1994——2006（1994——2006有答案）有机化学1992——2006（1992——1995，1997——2006有答案）无机化学与分析化学1994——2006（1994——1996，2000——2006有答案）高分子化学与物理1994——1998高分子科学系物理化学（含结构化学）1994——2006（1994——2006有答案）有机化学1992——2006（1992——1995，1997——2006有答案）无机化学与分析化学1994——2006（1994——1996，2000——2006有答案）高分子化学与物理1994——1998细胞生物学1996——2002生物化学1996——2005高等教育研究所管理学（高等教育学专业）2001——2003教育学1999——2004（2003有答案）中国教育史 1999——2004教育经济学2004旅游学系（无此试卷）文物与博物馆学系（无此试卷）经济学院经济学1993——2002（1993——2002有答案）经济学综合基础2003——2008（2003——2008有答案）微观经济学1996——2002（2001有答案）当代中国经济1999——2000世界经济与政治1996——2002国际经济1999世界经济1999——2000，2002（2002有答案）世界经济概论1996——1998（1996——1998有答案）政治经济学1998货币银行学与国际金融 1998金融学1999——2000，2002——2005应用概率统计1998——2000管理学院会计学1995——2004微观经济学1996——2002（2001有答案）企业经营管理1995——2002（2002有答案）（注：2002为回忆版）企业管理综合理论与知识 2003——2007（2003——2005有答案）经济学1993——2002（1993——2002有答案）经济学综合基础2003——2008（2003——2008有答案）政治经济学1998管理科学导论（运筹学）1994——2002（注：2000年试卷名称为“运筹学”）线性规划1995——1998应用概率统计1998——2000线性代数1998，2000生命科学学院物理化学（含结构化学）1994——2006（1994——2006有答案）有机化学1992——2006（1992——1995，1997——2006有答案）无机化学与分析化学1994——2006（1994——1996，2000——2006有答案）高分子化学与物理1994——1998生物综合2001细胞生物学1996——2002生物化学1996——2005微生物学1998——2000微生物（专基）1995遗传学1998——2000遗传学与细胞生物学2003——2005动物学1997——1998生态学1995——1998信息科学与工程学院量子力学1996，1998——2006理论力学1995——1999，2002——2004（2002有答案）普通物理1996——2006固体物理1996——2001电动力学2000——2001电磁场理论和微波技术1995，1997——1999电子线路(模拟和数字)1996——2003（其中2003年只有模拟部分）电子线路（数字）答案1996——2001电子线路（模拟）答案1999——2001半导体器件原理1994——1997，1999数据结构与操作系统1990——2006数学分析与线性代数1990——2005计算机组织与结构1990——2002编译原理1999——2002计算机图示学1999——2002计算机原理1999离散数学1999离散数学与算法2000——2002电磁场和电磁波1999电路和信号理论1999社会发展与公共政策学院经济学1993——2002（1993——2002有答案）经济学综合基础2003——2008（2003——2008有答案）社会学概论 1995——1998，2000社会统计学 1995——1998社会研究方法1995——1998文化人类学2005环境科学与工程系城市规划综合知识2007环境管理2006——2007环境化学1999——2001（1999——2001有答案）基础环境学1995——1999（1998有答案）环境生物学2000——2001（2000——2001有答案）环境科学综合知识2003——2007环境工程综合知识2004生态学1995——1998历史地理研究中心中国历史地理1996——1997文献信息中心（无此试卷）上海医学院(基础)诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004人体解剖学2005生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）公共卫生学院诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）药学院诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）中山医院诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001人体解剖学2005病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）华山医院诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001人体解剖学2005病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）肿瘤医院诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）儿科医院诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）妇产科医院诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）眼耳鼻喉科医院诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）金山医院诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）实验动物部诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）上海市肿瘤研究所诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）放射医学研究所诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）上海市计划生育研究所诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）上海市第一妇婴保健院诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）护理学院诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）华东医院诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）上海市第五人民医院诊断学1997——1998，2001——2002生物化学2000——2001，2003内科学2001——2002病理生理学 1999——2000遗传学1999微生物 2000细胞生物学 2000——2001病理学1995，1998，2000，2001，2004生物综合 2001生理学 2003——2004（注：2004为回忆版）软件学院数据结构与操作系统1990——2006数学分析与线性代数1990——2005计算机组织与结构1990——2002编译原理1999——2002计算机图示学1999——2002计算机原理1999离散数学1999离散数学与算法2000——2002微电子研究院电子线路(模拟和数字)1996——2003（其中2003年只有模拟部分）电子线路（数字）答案1996——2001电子线路（模拟）答案1999——2001半导体器件原理1994——1997，1999电磁场和电磁波1999电路和信号理论1999先进材料实验室量子力学1996，1998——2006普通物理1996——2006理论力学1995——1999，2002——2004（2002有答案）固体物理1996——2001电动力学2000——2001物理化学（含结构化学）1994——2006（1994——2006有答案）有机化学1992——2006（1992——1995，1997——2006有答案）无机化学与分析化学1994——2006（1994——1996，2000——2006有答案）高分子化学与物理1994——1998半导体器件原理1994——1997，1999电磁场和电磁波1999电路和信号理论1999

【综述】几种用于发现未知病毒核酸序列的技术及其应用翁康生 病毒是引发人类传染性疾病的主要病原体之一, 它们极大地威胁着人类健康。目前还存在人类尚未认知或新出现的病毒, 随时可能严重危害人类健康安全〔1 - 3〕。及早地发现,鉴别未知的或新出现的病毒, 是有效的预防和控制的先决条件之一。因此, 建立、储备、改良、发展、乃至创新应用于发现、鉴别未知或新出现病毒的技术方法是十分必要的。近20 多年来, 常采用传统的微生物学技术方法和现代分子生物学技术方法相结合的途径, 发现和鉴别未知病毒。通过细胞培养的方法分离病毒、电镜观察、用已知病毒的抗血清建立的免疫学方法作排他性检测、用已知病毒核酸序列建立的PCR、杂交等方法, 作特异核酸序列的检测、用分子生物学技术获得未知病毒核酸序列, 查询基因数据库, 检出并确定未知病毒基因组序列, 最终发现鉴别出未知病毒。对于无法用细胞分离培养的未知病毒, 有的采用免疫学与分子生物学技术相结合, 筛选获取病毒特异抗原编码基因的克隆, 进而发现鉴别出该病毒。更多的则是采用相应的分子生物学技术, 从被检样品中发现获取未知病毒的核酸序列,进而发现鉴别未知病毒。无论未知病毒是否可以用细胞培养分离, 最终对其基因组序列的测定分析, 是鉴别和判断的决定性依据之一, 而获取未知病毒的核酸序列是前提条件。从少量样品中, 从高度复杂的宿主细胞核酸物质中, 分离、扩增、获取足够量的无基因序列资料的未知病毒的核酸片段, 供进一步克隆、测序、生物信息学分析, 是用分子生物学技术发现、鉴别未知和新出现病毒的关键之一〔4〕, 也是最终测定分析, 拼接出未知和新出现病毒基因组序列的瓶颈步骤。病毒所携核酸物质有DNA 和RNA 之分, 可采用的技术方法也有所不同, 现将有关技术与其应用作一简介, 以供参考。1 代表性差异分析法代表性差异分析法是为寻找分析两个生物样品复杂的基因组间有何差异而发展建立起来的分子生物学技术方法, 并不断得到演化, 发展和应用。病毒感染宿主细胞后, 与未感染的同类细胞相比, 二者核酸物质间的差异主要在于是否存在病毒核酸。消减去二者核酸间相同序列的背景部分, 扩增、比较、选取余下可能存在差异的部分, 进一步分析以发现未知病毒的核酸序列。病毒的核酸结构各有不同, 可选用相应的代表性差异分析法, 见表1 。111 DNA 代表性差异分析法(DNA Representation differenceanalysis , DNA RDA)此方法是Lisitsyn 等〔5〕利用核酸消减杂交技术〔6〕、PCR 方法和双链DNA 热变性后互补链退火复性的二级动力学原理〔7 - 8〕作者单位:上海市疾病预防控制中心 200336表1 病毒核酸类型与各代表性差异分析法的选用病毒核酸类型DNA RDA c DNA RDA非rRNA 序列6 核苷酸引导c DNA RDAds DNA 线状√ds DNA 环状√ss RNA polyA( + ) √ss RNA polyA( - ) 3 √ds RNA polyA( - ) √ 3 负链ss RNA polyA( - ) 视病毒在宿主细胞的转录机制而定。而建立的。方法中将需分析的样品DNA(Test DNA ,T- DNA) 和对照DNA(Driver DNA ,D - DNA) 设为二组,分别用同一种限制性内切酶酶切处理,并接上5′端去磷酸化的人工接头,补齐接头后,加入与接头序列互补的引物作PCR 扩增。切除扩增产物上的人工接头后,切出的T - DNA 连上第二种人工接头,变性后与过量的变性D - DNA 杂交。通过杂交,消减去T- DNA 中与D - DNA 中同源的核酸序列,而只存在于T - DNA 中的靶序列DNA(Target DNA) 则自我退火复性,其两端连有第二种人工接头。加入与第二种接头互补的引物作PCR ,只有靶序列DNA呈指数扩增,因而得到进一步富集。进过如此重复的几个轮回后,以电泳检测比较T- DNA 和D - DNA ,将T- DNA 中呈现的差异部分作分离,克隆,序列分析。Lisitsyn 等以10μg 人淋巴细胞基因组DNA 作为D - DNA ,在相同的人DNA 中加入相当于单拷贝量的120 pg 腺病毒DNA作T- DNA。以此作为实验模型,用DNA 代表性差异分析法成功的寻找、鉴定出外加入的腺病毒DNA 序列。应用此技术,Chang 等〔9〕在艾滋病相关的卡波西肉瘤(Kaposis Sarcoma) 中发现一段类似人类疱疹病毒的基因, 并由此发现一种新的病毒HPV8。以后人们又以此技术发现鉴定了HPV6、TTV 病毒、黄热病毒样基因组、MDV 等〔10 - 13〕DNA 病毒。112 cDNA 代表性差异分析法(cDNA Representation differenceanalysis , cDNA RDA)Hubank 等〔14〕针对mRNA 所含序列相对简单的特点,提出了cDNA 代表性差异分析法。它的基本原理与DNA RDA 相同,主要不同在于,采用识别4 核苷酸序列的限制性内切酶,它的识别位点在mRNA 反转录成的cDNA 中出现的频率更高,平均酶切片段长度约256 bp ,保证了cDNA 序列群中绝大多数序列,至少被切出一个片段可扩增,供差异分析,分离鉴定。cDNA RDA 技术相对经济,可高效灵敏地用于非常少的起始材料而获得结果〔15〕。具有polyA( + ) - RNA 病毒,其核酸可类似于mRNA 分离纯化,因此可应用此技术。利用cDNA RDA技术,发现鉴定了TiV、MenV ,等〔16 ,17〕RNA 病毒。113 非rRNA 序列6 聚核苷酸引导反转录的cDNA RDA中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13 ·317 ·© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing H All rights ( - ) - RNA 病毒,其核酸物质不似于mRNA ,需和宿主细胞总RNA 同时分离,并用随机引物作反转录。因为宿主细胞总RNA 中rRNA 约占80 % ,由于竞争反应、靶序列信号被湮灭等原因,从这样的总RNA 抽提物中,用随机6 聚核苷酸引物引导反转录的cDNA RDA 技术,发现鉴别polyA( - ) - RNA 病毒核酸序列是困难的。Endoh 等〔18〕罗列了6 聚核苷酸所有可能的排列组合,共计4 096 个序列模式,以大鼠18S、518S、28S 等rRNA、微卫星重复序列、SARS - CoV、BI - 3 病毒等的序列数据为模型,筛选出在rRNA 序列中出现频率极低或不出现的6 聚核苷酸序列模式共96 种。将这些序列分别合成并混合后,称之为非rRNA 序列6 聚核苷酸引物。生物信息学分析96 种序列模式在哺乳动物病毒科具代表性的1 791 个病毒基因组序列中出现的频率,数据表明,非rRNA 序列6 核苷酸引物可引导绝大多数病毒的cDNA 合成。分别用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物和随机6 核苷酸引物作cDNA 反转录效率、cDNA RDA 试验,结果表明,二类引物对人工合成的RNA (二类引物在其序列中出现的频率相似) 反转录效率几乎相等,而前者对细胞总RNA反转录效率远低于随机引物。用二类引物作cDNA RDA ,检测人工合成的RNA ,前者灵敏度是用随机引物的30 倍。在模拟实验中用非rRNA 序列6 聚核苷酸引物引导反转录,串联cDNARDA 技术,检测鉴别出感染细胞的BI - 3 和SRAS - Cov 核酸序列片段。此方法能从1μg 总RNA 中检测出3 ng 的外来RNA ,其检测灵敏度不及普通的PCR 检测方法,但对于检测鉴别在宿主细胞中复制,但不知其基因序列的poly A( - ) - RNA 病毒而言,也是一个可选择的方法。114 抑制消减杂交cDNA RDA 技术结合消减杂交和PCR 抑制作用〔19〕的技术原理,Diatchenks 等〔20〕等发展出了抑制消减杂交技术( suppressionsubtractive hybridization ,SSH) 。与前两种RDA 技术不同点在于,SSH 技术将内切酶酶切处理的T - cDNA 分为两份,分别接上不同序列的去磷酸化的接头1 和2 ,分别于过量的D - cDNA作第一轮杂交。杂交过程中两组中的单链T - cDNA 浓度趋同,T- cDNA 中的非靶序列单链cDNA 与D - cDNA 中相应序列形成杂交双链而被消减, T - cDNA 中差异表达的单链cDNA被显著富集。合并一轮杂交物,加入过量变性D - cDNA ,作第二轮杂交。合并的二组份一轮杂交物中剩下的趋同化、经消减杂交后的单链T - cDNA 能互补杂交, 可以形成: 原组内T- cDNA 单链间的杂交、T - cDNA 与D - cDNA 单链间的杂交、二组间T- cDNA 单链间的杂交。补齐杂交反应后双链cD2NA 末端,用分别与接头1 和2 的外侧部分序列互补的寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。二组份间T- cDNA 互补单链杂交物,因两端分别具有接头1 和2 ,可被指数扩增;T - cDNA 与D -cDNA 杂交物和剩余单链T- cDNA ,因一端具接头序列,被线性扩增;而同组间T- cDNA 杂交物两端具反转重复长序列,因抑制性PCR 效应,在PCR 反应循环中分子内退火形成稳定的“锅柄结构”〔19〕而不被扩增。因此,SSH 技术通过二轮消减杂交和抑制性PCR 特异扩增,使假阳性大大降低,提高了检出低丰度靶mRNA 的灵敏度。Hu 等〔21〕应用SSH 技术,结合反转录酶的模板切换(tem2plate - switching) 功能, 以HCV RNA 阳性血清体外感染的人MOLT- 4 急性淋巴母细胞白血病T 细胞系为模型,通过反转录合成全长cDNA、抑制性消减杂交、消减的cDNA 文库构建、反相斑点杂交筛选,在被筛的96 个克隆里,T- cDNA 探针杂交呈特异阳性的16 克隆中,序列分析后得到4 个插入HCV 序列的克隆。2 非特异多重引导滚环式扩增法乳头瘤病毒、痘病毒等,其基因物质为环状DNA 分子。在事前未知基因序列的情况下,发现和鉴别这类病毒核酸序列还可选择非特异多重引导滚环式扩增法(multiply primed rolling -circle amplification ,RCA) ,扩增、分离、获取其基因片段供进一步分析。自然状况下,环状DNA 经常以滚环方式进行复制。Dean等〔22〕应用随机6 聚核苷酸作引物,加入φ29 DNA 聚合酶,以质粒DNA 和噬菌体DNA 为模型,建立了多重引物引导的滚环式扩增法。φ29 DNA 聚合酶可长距离( > 70 000 nt) 地结合于DNA模板,进行链置换DNA 合成。而随机6 聚核苷酸引物可多位点的与单链环状DNA 互补复性。在φ29 DNA 聚合酶作用下,以随机引物引导,合成与模板互补的DNA 链。当合成链延伸到与模板结合的随机引物5′端时,在φ29 DNA 聚合酶的链置换活性作用下,下游被延伸的随机引物链被“甩”出模板。而上游的延伸链继续在环状模板上复制合成。同时,被从单链环状模板上“甩”出的互补链,又成为新的模板,随机引物与之结合,在φ29 DNA 聚合酶作用下,继续以枝杈的形式进行链延伸和链置换,最后以双链DNA 串联体形式释放。用此法可使1 ng 纯pCU18 环状DNA 模板延展式地扩增至107倍。Rector 等〔23〕以此原理建立了不依赖已知的特定基因序列(非序列依赖性) 的多重引导滚环式扩增环状DNA 病毒基因组方法,并应用其扩增获取了HPV 16 的基因组DNA。在接近实样的试验样品中,由于稀释倍数和环状DNA 分子较大等原因,将HPV 16 基因组DNA 扩增了214 ×104 倍。3 病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增病毒核酸可包裹于病毒外壳内,病毒的蛋白外壳或脂膜对病毒核酸具有保护作用。而病毒颗粒具有不同于细菌或其他真核细胞的理化特性。利用这样的特点Allender 等〔24〕和Stang等〔25〕各自建立了病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增方法(sequence - independent amplification) 。两种方法的共同点在于,依据病毒颗粒小、具一定密度,用0122μm 滤器过滤、或再串上超速密度梯度离心,从样品中分离出病毒颗粒,DNA 酶酶解游离的DNA ,裂解病毒颗粒,抽提获取较纯的病毒颗粒相关核酸。Allender 等〔24〕借鉴RDA 原理,对病毒颗粒相关核酸用限制性内切酶酶切后,作非序列依赖性单引物PCR 扩增( sequence -independent single primer amplification ,SISPA) :将抽提获取的DNA或RNA 分别补齐,合成第二链DNA ,或反转录,合成双链cDNA。限制性内切酶酶切后,酶切片段两端连接一种接头,并以与接头同序列的单一寡核苷酸为引物,作PCR 扩增。扩增产物进一步克隆与序列分析。用此法检验HBV 阳性血清和GBV - B 阳性血清样品,结果在相当于106/ ml 个基因组拷贝浓度的50μl样品中,可重复试验检出相应的病毒基因片段。Stang 等〔25〕则在得到双链DNA 或双链cDNA 后加入k - 随机引物,此种引物5′端含有20 个固定序列的核苷酸,3′端则有·318 · 中国预防医学杂志2007 年6 月第8 卷第3 期 Chin Prev Med , June 2007 , Vol18 No13© 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing H All rights 核苷酸随机简并序列。与变性模板退火时,6 核苷酸随机简并序列随机地与模板相应序列互补退火,在T4 DNA聚合酶作用下作链延伸。然后在延伸产物中加入k - 随机引物中固定序列部分的20 寡核苷酸作引物,进行PCR 扩增。扩增产物电泳分析、克隆、测序。用此方法检验由实时- PCR 定量,包括病毒颗粒相关核酸及游离核酸在内的病毒基因组拷贝数为109/ ml 的Cox - 3 和MAV - 1 培养物。前者的12 克隆中,9 个克隆插入有肠道病毒的四个不同区域的同源基因片段;而6 个MAV - 1 中分离的克隆内,5 个含有99 % 同源MAV - 1 基因片段。基于病毒颗粒分离纯化、DNase 处理、病毒颗粒相关核酸的非序列依赖性PCR 扩增,获取、鉴定未知病毒的基因片段,尽管灵敏度不够高,但其实验时间较短,步骤相对简单,对于病毒拷贝数高,时间紧急的样品鉴别,是较适宜的一套方法。病毒的种类、结构、特性多种多样,感染病毒后需要检验的样品又各不相同,因此用于发现鉴别未知病毒的核酸序列的技术,也不是固定不变和完全通用的。以上的技术方法各有优缺点和适用范围。而针对扩增获取未知病毒基因组序列片断,这一发现鉴定未知病毒的分子生物学技术的要点或瓶颈,必然还会有新的改进、创新技术出现,将会更快、更灵敏、更简便、更准确的发现鉴别未知病毒。参 考 文 献〔1〕 Drosten C , Gunther S , Preiser W, et al1 Identification of novel corona2virus in patients with severe acute respiratory syndrome1 N Engl J Med ,2003 , 348 : 1967 - 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