DNA糖基化酶1对幽门螺杆菌致胃上皮细胞DNA损伤的保护作用

幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，HP)感染是慢性胃炎、胃溃疡、甚至胃癌的关键危险因素 [1]。炎症、活性氧(reactive oxygen species，ROS)及DNA损伤在HP感染后胃组织从胃炎向胃癌演变过程中发挥了重要的作用 [2]。HP感染产生的低水平ROS，在感染初期，并不会直接导致DNA链断裂，而是导致DNA碱基氧化性损伤，其中，8羟基脱氧鸟嘌呤(8 h ydroxy d eoxyguanine，8-OHdG)是主要损伤形式[3]。碱基切除修复是DNA碱基损伤的主要修复方式，8-OHdG DNA糖基化酶1(8-oxoguanine DNA glycosylase 1，OGG1)是碱基切除修复过程的限速酶，识别并修复损伤的碱基，防止基因组不稳定和基因突变 [4]。研究表明，胃肿瘤组织的OGG1表达显著低于正常胃组织 [5]，并且，OGG1基因多态性与人群胃癌易感性呈显著正相关 [6]，提示OGG1可能在胃癌发生发展过程中扮演了重要的角色。因此，本研究通过RNA干扰技术沉默OGG1表达，通过检测细胞活力和细胞凋亡及PARP表达等，探讨OGG1在HP感染致胃上皮细胞(GES-1) DNA损伤中的作用。

1　材料与方法

1.1　细胞培养与分组处理

人胃黏膜上皮细胞株GES-1和H.pylori ACTC43504(CagA+，VacA+)标准菌株由贵州省安顺市人民医院提供。细胞培养采用DMEM培养基(Invitrogen公司)添加10%胎牛血清(Hyclone公司)和100 U/mL的青霉素-链霉素双抗(Sigma公司)，于37 ℃、CO2体积分数为5%的恒温培养箱中，传代接种于6孔板或96孔板经培养达对数生长期，在HP感染前，细胞更换不含抗生素的培养基。感染时，将HP接种于含有10%无菌脱脂羊血的空肠弯曲杆菌培养基(西宝生物)中，于37 ℃、N2体积分数为85%、CO2体积分数为10%、O2体积分数为5%的培养箱中培养3 d，刮取HP至含有1.5 mL DMEM培养基的EP管中，4 ℃、12 000 g离心10 min，去上清，经分光光度计检测波长为660 nm时的细菌吸光度D(660)值。实验分组为4组：对照组、干扰组(OGG1 siRNA)、HP感染组、OGG1干扰+HP感染组。在HP(病毒滴度10∶1)感染GES-1细胞24或48 h后检测。

1.2　OGG1 siRNA转染

转染试剂采用脂质体2000(Invitrogen公司)，采用OptiMEM(Invitrogen公司)配制脂质体和siRNA(100 nmol/L)的工作液。于HP感染前12 h，将干扰组细胞转染OGG1特异的siRNA(Invitrogen公司)，正义链为5´-GC UUGAUGAUGUCACUUAUTT-3´，反义链为5´-AUAAG UGACAUCAUCAAGCTG-3´；对照组细胞转染对照序列正义链为5´-GUACUUCCA GCUAGAUGUUUU -3´，反义链为5´-AACAUCUAGCUGGAAGUACUU-3´，OGG1干扰效率采用Western blot检测干扰24 h后OGG1蛋白表达。

与空白组比较，模型组和各给药组大鼠AI均显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）。造模后第28天，阳性组和八角枫水提液各剂量组大鼠AI均较模型组显著降低，且八角枫水提液高剂量组显著低于阳性组，差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）；而其余时间点各给药组大鼠AI与模型组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），详见表2。

1.3　细胞活力检测

采用细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8)(Dojindo公司)检测细胞增殖活力。根据试剂盒说明书，将GES-1细胞接种于96孔板，接种密度为5×105/mL，培养至对数生长期，经siRNA转染和HP感染处理完毕，每孔加入含10% CCK-8原液的DMEM 100 μL继续培养2 h，分别于HP感染后24和48 h后检测细胞活力。每组设3个复孔。

γH2AX是DNA双链断裂的分子标志物，与对照组比较，单纯HP感染组和单纯OGG1感染组细胞核内γH2AX焦点无明显变化，而HP感染+OGG1干扰组细胞核γH2AX焦点明显增多(图3A)，而采用Western blot检测发现，与对照组比较，HP感染+OGG1干扰组γH2AX蛋白表达显著升高(p＜0.01)(图3B和C)。

1.4　细胞毒性检测

采用细胞毒性检测试剂盒(Roche公司)检测细胞乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)释放。各组细胞同1.3处理完毕后，根据试剂盒说明书，分别收集HP感染24和48 h后的细胞上清并加入LDH溶液在25 ℃反应30 min。采用Infinite M200(TECAN公司)读取各孔的D(450)值，每组设置3个复孔，测量值采用对照组标准化百分率表示。

1.5　彗星试验检测DNA损伤

采用Western blot检测经HP感染24 h后OGG1蛋白表达及感染48 h后的γH2AX和PARP蛋白表达。GES-1细胞按5×105/mL接种于6孔板，培养至对数生长期时转染OGG1 siRNA，24 h后实施HP感染，于感染后48 h刮取细胞并加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂(Roche公司)的RIPA裂解液(碧云天公司)冰上裂解30 min，15 000 g离心20 min，取上清，采用BCA试剂盒(碧云天公司)测定蛋白浓度，60 μg蛋白上样10% SDS-PAGE电泳，蛋白分离后，经过转膜，封闭，而后加入兔抗人OGG1单克隆抗体(Abcam，1∶1 000)、羊抗人γH2AX单克隆抗体(Abcam，1∶1 000)、羊抗人PARP 多克隆抗 体 (Abcam， 1∶ 1 000)及 鼠 抗 人 β-actin (Sigma-Aldrich，1∶1 000)4 ℃孵育过夜，次日洗膜，37 ℃辣根过氧化物酶标记的二抗孵育2 h，采用增强的化学发光系统(Amersham公司)检测蛋白表达。

1.6　免疫荧光检测γH2AX焦点形成

应用SPSS 13.0软件录入各组数据，采用单因素方差分析统计各组数-据，用Student’s t检验分析两组间的差异，数据采用x±s表示，每组实验至少重复3次，以α=0.05为检验水准。

1.7　细胞凋亡检测

3.C 提示:A项,硅元素在自然界中无游离态,错误;B项,SiO2能与氢氟酸反应,错误;C项,C、Si、S三种元素低价态气态氢化物分别为CH4、SiH4、H2S,都具有还原性,易与O2发生反应,正确;D项,酸性强弱顺序为H2SO4＞H2CO3＞H2SiO3,错误。

ABS树脂的增韧机理为多重银纹及剪切带，橡胶粒子诱发银纹并阻止银纹的发展，多个橡胶粒子互相作用形成多重银纹，吸收能量，材料表现出韧性。当温度提高到一定程度，高分子之间自由空间加大，分子链段运到能力提高，分子链更加容易取向，在外力作用下更多的分子参与形变，形成剪切带，提高材料抵抗外力的能力。

1.8　Western blot检测

采用彗星试验试剂盒(Trevigen公司)检测经HP感染48 h后的细胞DNA损伤情况。用胰酶消化、重悬各组GES-1细胞，调整密度至(3～5)×105/mL，与0.65%的低熔点琼脂糖凝胶按1∶10(V/V)混匀并平铺于Trevigen彗星试验专用载玻片上，4 ℃预冷30 min后，将载玻片置于裂解液(2.5 mmol/L NaCl，10 mmol/L Tris HCl，100 mmol/L EDTA，10%二甲亚砜和1%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100，pH 10.0)，4 ℃裂解2 h，后置于碱性解旋液(200 mmol/L NaOH，1 mmol/L Na2 EDTA，pH＞13)，室温解旋30 min。随后将载玻片置于水平电泳槽，以1 V/cm电泳40 min。电泳完毕后，用去离子水清洗载玻片2次，75%乙醇脱水5 min，4 ℃干燥后，SYBR Green I(Invitrogen)染色液，避光染色25 min，荧光显微镜(Leica公司)观察并照相。所获图片采用CASP软件分析，每组至少分析100个细胞，采用尾长(tail length，TL)、尾部DNA含量、Olive尾矩(Olive tail moment，OTM) 和 尾矩(tail moment，TM)评价DNA损伤程度。

我国佛教对人们的社会生活影响深远，迄今为止流传下来的佛教典籍很多，例如玄奘经、金刚经等，人们通常使用的俗语和佛教用语也存在着一定的联系。例如做一天和尚撞一天钟，是形容人们消极怠工的状态，含有贬义。西方国家基督教流传下来的典籍主要是《圣经》，其内容已经在人们的社会生活中广为流传，具有一定的教育意义。基于该种宗教信仰背景，对很多中文俗语的英文翻译都是以西方教会的专用术语作为参考。例如“as poor as the church mouse”（一贫如洗）、“love is blind”（情人眼里出西施）等俗语的翻译，在英语中用盲人来比喻不看人的长相，这与汉语翻译的意思存在很大差异。

1.9　统计学方法

采用免疫荧光法检测经HP感染48 h后的γH2AX焦点形成。用多聚赖氨酸包被盖玻片并放置于24孔板，GES-1细胞按5×105/mL接种，培养至对数生长期时转染OGG1 siRNA，24 h后实施HP感染，于感染后48 h将贴有细胞的盖玻片用4%甲醛室温固定15 min，采用0.1% Triton X-100 在4 ℃透膜15 min，荧光封闭液(碧云天公司)封闭30 min后，加入γH2AX(Abcam，1∶200)，4 ℃过夜，次日，加入相应的Alexa Fluor® 647荧光二抗(Invitrogen，1∶100)，37 ℃反应1 h，洗片后，采用DAPI(碧云天公司)反染细胞核，共聚焦显微镜(Leica公司)观察并照相。

采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL)检测各组细胞经HP感染48 h后的凋亡情况。细胞处理同1.5。根据TUNEL试剂盒(Roche公司)说明书，细胞接种贴片后，将贴有细胞的盖玻片用4%甲醛室温固定15 min，0.3%的H2 O 2室温处理10 min以抑制内源性的过氧化物酶，采用0.1% Triton X-100在4 ℃条件下透膜15 min，随后，每个样本滴加50 μL TUNEL反应液37 ℃避光反应1 h，荧光显微镜(Leica公司)观察并照相。每组至少记录500个细胞，凋亡指数为总细胞中TUNEL阳性细胞的比例。

2　结　果

2.1　OGG1干扰对HP感染引起的胃上皮细胞活力变化和LDH释放的影响

图1　OGG1干扰对HP感染引起的胃上皮细胞活力变化和LDH释放的影响

GES-1细胞转染OGG1 siRNA或者对照siRNA序列后，再感染HP，分别于感染后24 h和48 h检测细胞活力和LDH释放。如图1所示。Western blot检测显示干扰组OGG1蛋白表达较对照组显著降低(p＜0.01)(图1A和B)。与对照组相比，单纯HP感染和单纯OGG1干扰细胞活力及LDH释放均无明显影响。而在OGG1干扰+HP感染24和48 h后，与对照组和单纯HP感染组相比，OGG1干扰+HP感染组细胞活力显著下降，LDH释放显著增多(p＜0.05或p＜0.01)。

2.2　OGG1干扰对HP感染引起的胃上皮细胞DNA 损伤的影响

彗星实验结果表明，OGG1干扰后，细胞DNA在HP感染后24 h和48 h发生拖尾现象(图2A～D和I～L)。经CASP软件分析后，与对照组及HP感染组比较，OGG1干扰+HP感染24 h后尾长、尾部DNA含量和Olive尾矩显著增加(p＜0.05或p＜0.01)(图2F和G)，而尾矩差异无统计学意义(P＞0.05)(图2H)；而在OGG1干扰+HP感染48 h后，与对照组及HP感染组比较，尾长、尾部DNA含量、Olive尾矩均显著增加(p＜0.01)，尾矩也显著增加(p＜0.05)(图2F和G)。与对照组比较，单纯HP感染组和单纯OGG1感染组细胞的尾长、尾部DNA含量、Olive尾矩及尾矩在感染后的24 h和48 h均无显著变化(P＞0.05)。

2.3　OGG1沉默联合HP感染引起胃上皮细胞DNA双链断裂

图2　OGG1干扰对HP感染引起的胃上皮细胞DNA损伤的影响

（2）同一时间只能在一套系统进行遥控操作这点是由于对遥控操作的安全性要求决定的，任何时候我们只是在一套系统上进行遥控操作，但是监视电网运行情况则可以同时进行，因为实时数据的来源是一致的。

图3　OGG1干扰对HP感染引起的胃上皮细胞γH2AX焦点形成及蛋白表达的影响

2.4　OGG1干扰对HP感染引起细胞凋亡的影响

HP感染48 h后，与对照组比较，单纯HP感染组和单纯OGG1感染组TUNEL阳性细胞及活化的PARP无明显变化，HP感染+OGG1干扰组细胞核TUNEL阳性细胞明显增多(图4A)。而采用Western blot检测发现，与对照组比较，HP感染+OGG1干扰组活化的PARP蛋白表达水平显著升高，差异具有统计学意义(p＜0.01)(图4B和C)。

图4　OGG1干扰对HP感染引起的胃上皮细胞凋亡的影响

3　讨论　

本研究通过RNA干扰技术沉默OGG1表达，评估了细胞活力、细胞凋亡和细胞死亡；并采用彗星实验和γH2AX焦点形成检测细胞DNA损伤，我们发现HP感染在胃上皮细胞OGG1表达下调的情况下，导致显著的细胞DNA损伤和细胞凋亡，在细胞水平解释了人群OGG1多态性和表达下调与胃癌发生相关关系的分子机制。

研究表明，HP感染引起细胞氧化应激，主要通过两条经典途径：一是通过PI3K/Rac1信号通路激活NADPH氧化酶1(NOX1)产生ROS[7]，二是通过精胺氧化酶在多胺精胺向精胺转化的过程中产生过氧化氢，细胞氧化应激进而引起氧化性DNA损伤 [3]。由于OGG1是氧化性DNA碱基损伤修复途径的关键酶，因此本研究发现的HP感染引起OGG1下调的胃上皮细胞DNA损伤和细胞凋亡主要是氧化应激介导的。既往研究表明，HP感染(病毒滴度为50∶1)引起胃上皮细胞氧化应激水平增高和ATM/ATR依赖的DNA损伤 [8]，而本研究采用更低剂量的HP感染(病毒滴度为10∶1)未引起DNA损伤，而在OGG1沉默的情况下出现DNA损伤效应，表明OGG1在HP感染致胃上皮细胞DNA损伤过程中发挥了保护作用。

HP感染产生的氧自由基攻击细胞DNA，首先引起具有潜在致癌特性的8-OHdG形成，此种DNA损伤类型主要由OGG1介导的碱基切除修复途径完成，从而防止基因突变，维持基因组DNA完整性 [9]。OGG1介导的氧化性DNA损伤修复不完全或失败将导致DNA链断裂、细胞周期阻滞、细胞凋亡以及线粒体功能障碍，进而加剧ROS产生 [10]。研究表明，OGG1沉默引起氧化性DNA损伤加重、DNA链断裂和细胞凋亡，提示OGG1对细胞DNA具有保护作用[11]。这与本研究的结论是一致的。

DNA损伤在各类癌症发生发展过程中关键作用已经得到广泛的认同。而OGG1因为参与氧化性DNA损伤修复，与癌症发生发展有着密切的联系。人群研究提示，OGG1基因多态性与胃癌、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌等多种恶性肿瘤发生密切相关 [12-15]，OGG1在多种肿瘤组织中OGG1表达下降 [4]，OGG1敲除小鼠致癌模型中发生肺癌的数量和大小较对照组显著增多，发生时间明显提前 [16]。新近研究发现，OGG1过表达的转基因小鼠在诱导乳腺癌模型中，肿瘤的体积较对照明显减小，转移率显著减低，同时伴随着氧化应激水平降低，DNA损伤减轻和线粒体功能改善，表明OGG1介导的氧化性DNA损伤修复限制了肿瘤的发生和转移 [17]。我们发现较低剂量的HP感染未引起胃上皮细胞DNA损伤和凋亡，然而OGG1沉默后，HP感染导致了细胞DNA损伤，同时伴随着细胞凋亡增加，细胞活力下降，表明OGG1保护了HP感染致胃上皮细胞DNA损伤。综合前面的分析，OGG1可能是HP感染致胃癌发生的早期关键分子，这为防护HP感染导致的胃癌发生提供了新的理论依据和干预靶点。

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