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基于线粒体COI基因的青海省44种蚤类的分子鉴定及系统发育分析

更新时间:2009-03-28

近年新发展起来的DNA条形码技术具有客观、简便、准确、快速、易操作等优点,它的出现弥补了传统形态分类的诸多不足。线粒体COI基因已广泛应用于昆虫的种类鉴定以及发现隐存种,成为昆虫物种鉴定效率、发现新种和隐存种、研究系统进化关系、保护昆虫物种资源多样性等研究领域的重要方法之一(刘慎思等, 2012)。

青海省地理景观多样,蚤类区系丰富,现发现165种和亚种,约占全世界蚤类总数的7%,占我国蚤总数的24%,其中有3个属和53个种为青藏高原特有种,故具有较高的科学价值(蔡理芸等, 1987)。蚤类不仅因叮刺和吸血搔扰人畜使其不得安宁或引起过敏性皮炎和贫血造成直接危害,更重要的是它作为某些重要传染病如鼠疫、地方性斑疹伤寒和土拉菌病的媒介作用不容小觑(Dunnet et al., 1991)。常规形态学手段进行蚤种鉴定必须具备长期经验积累和丰富的分类知识,过程相对复杂和低效,这对于年轻专业人员有很大的难度;同时对蚤类透明标本的制作要求较高,需要保持蚤种形态特征完整,残缺标本或片段则无法进行物种分类鉴定。

鉴于上述原因,本研究选用DNA条形码技术对青海寄生蚤种的COI基因序列进行测定和分析,旨在探索建立快速高效的医学媒介鉴定新方法,积累青海蚤类COI基因片段序列数据信息,建立青海省DNA蚤类条形码信息及资源数据库,有助于促进蚤类生物学、生态学、生理学等相关领域的研究。

1 材料与方法

1.1 蚤类样本及其形态分类鉴定

本研究使用的182头蚤样本,采自青海省5州1市12县,样点采集信息见表1。将采集的蚤标本用75%乙醇保存,带回实验室后在光学显微下进行镜检,按《青海高原蚤目志》(蔡理芸等, 1997)中所列的检索分类特征进行分类鉴定,共鉴定蚤种42种,隶属于3总科6科22属(表1)。提取DNA前,将置于75%酒精中的蚤用眼科镊轻轻摄出,置于解剖镜下,用手术刀片将其腹部轻轻切开2~3个小切口。因蚤体的几丁质外骨骼要留做凭证标本,为保持标本的完整性,注意一定不能切断蚤体。再将已切的单头蚤体放入1.5 mL离心管中提取DNA(防止样本污染)。提取DNA后剩余的几丁质外骨骼做成玻片标本后作为凭证标本用于形态鉴定的复核。

1.2 DNA提取

利用上述个体样本,使用Qiagen DNeasy 血液和组织试剂盒(Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit)按操作手册提取单头蚤的总DNA。

为分析方位向重构性能,设置方位向存在四个强度分别为[1,0.1,0.50.8]的散射点,仿真CFS信号载频f0=10GHz;子脉冲数N=256;载频步进量Δf=2MHz;脉组数Na=256.图4为不同采样率下方位向重构结果,其中传统方法表示基于OMP算法的重构方法,本文方法表示基于DCS-SOMP算法的重构方法,信噪比设置为20dB.图5为不同信噪比下的方位向重构结果,采样率设置为α=0.5.

本实验共制备182份蚤DNA样品,将提取的DNA置于-20℃冰箱保存备用。

1.3 COI基因PCR扩增

在25 μL反应体系中:10×buffer 2.5 μL,10 μmol/L上下游引物各0.5 μL,10 μmol/L dNTPs 0.5 μL,蚤DNA模板2 μL,Taq DNA聚合酶(0.75 U) 0.15 μL(宝生物大连生物有限公司)。每次反应均设空白对照。扩增时选用2组引物(Folmer et al., 1994; Hajibabaei et al., 2006)扩增COI基因片段,即L1490(5′-GTCAACAAATCATAAA GATATTG-3′)和H2198(5′-AAACTTCAGGGTGACC AAAAAAT-3′),以及LepF(5′-ATTCAACCAATCATA AAGATATTGG-3′)和LepR(5′-TAAACTTCTGGATGT CCAAAAAATCA-3′),以获得清晰目标条带和质量较高的测序峰图。使用L1490/H2198引物扩增切唇蚤科(Coptopsyllidae)、细蚤科(Leptopsyllidae)和角叶蚤科(Ceratophyllidae)(山蚤属Oropsylla、盖蚤属Callopsylla、单蚤属Callopsylla)的蚤种,LepF/LepR引物扩增蚤科(Pulicidae)、多毛蚤科(Hystrichopsyllidae)、栉眼蚤科(Ctenophthalmidae)和角叶蚤科(Ceratophyllidae)(副角蚤属Paracera、瘴蚤属Amalaraeus、倍蚤属Amphipsylla)的蚤种。

我国油页岩资源储量丰富。油页岩干馏后可得到类似于天然石油的页岩油,被公认为现阶段较为理想的石油替代能源。而油页岩资源不论品位,也不论采用何种干馏技术,最终的炼油产品主要有页岩油、干馏瓦斯尾气、干馏污水、油泥及干馏后的页岩废渣等5种。

Column-Bot使用非特定人声语音识别技术(Automatic Speech Recognition,ASR)最重要的现实意义就在于能够在脱离编程器和常规输入硬件的状态下,对机器人进行编程和操作,能够加大机器人与人的人机交互能力,目前机器人可以获取50条关键字,并且配合MCU对机器人主控制器发送命令,完成人声控制机器人的行走及任务执行过程.

1958年7月15—17日涑水河流域普降暴雨,造成涑水河发生特大洪水,位于涑水河上游的吕庄水文站7月16日实测洪峰流量655 m3/s。而涑水河由于河道行洪能力不足,洪水在蓄滞洪区和伍姓湖大量蓄积,受此影响流域把口站张留庄水文站所测数据不能直接反映本次洪水的演进过程。为研究涑水河流域暴雨洪水时空分布规律,弥补水文实测资料的不足,特针对本次洪水作历史洪水调查。

1.4 蚤COI基因片段测序

PCR扩增产物以100+1.5 kb DNA Ladder作为分子量标准对照,经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,选取目标条带清晰的样品送北京擎科生物技术有限公司进行双向测序。扩增效果和测序结果不好的样本构建克隆载体,经蓝白斑筛选法筛选出阳性克隆,用M13引物扩增鉴定后测序。测序结果首先用Chromos软件观察测序峰图质量,如果峰图质量很低不能准确判断碱基,则重新进行扩增和测序。所得序列经与GenBank中蚤类序列比对后确认是蚤类的COI基因,并排除假基因的可能。将确认后的序列提交至GenBank,获得GenBank登录号。

1.5 蚤COI基因序列处理与系统发育分析

用Clustal X(Thompson et al., 1997)软件进行多重序列比对, 并进行适当的手工调整。同时将测定的序列在NCBI上运行BLAST程序进行序列同源性比较,以确保所获得的序列是目标序列。再运用MEGA6(Tamura et al., 2013)软件分析各基因序列的碱基组成和变异,基于Kimura-2-parameter(Kimura, 1980)模型计算遗传距离、序列碱基组成、保守位点、变异位点、简约信息位点、自裔位点、转换数与颠换数的比值(Ts/Tv)等。

 
 
 
 

本研究共测得3总科6科22属44种182条COI序列(GenBank登录号:MG138154-MG138335),另外从GenBank中查询的蚤类同源序列经Clustal X软件比对,共有597个位点。采用MEGA6软件进行序列组成分析,结果显示COI基因序列中保守位点有276个,变异位点有321个,简约信息位点有280个,自裔位点有41个。同时A, T, C和G碱基的平均含量分别为27.6%, 39.7%, 17.5%和15.2%,其中A+T含量(67.3%)远高于G+C含量(32.7%),与目前已测线粒体DNA序列中较高的A+T含量现象相一致。

2 结果

2.1 蚤类COI基因片段序列分析

常见的建树方法中,ML法计算量非常大,极为耗时,MP法若序列变异大会出现长枝吸引而导致建树错误,BI法适用于大或复杂的数据集,其缺点是对进化模型比较敏感,邻接法(neighbor-joining, NJ)是基于最小进化原理经常被使用的一种算法,它构建的树相对准确,假设少,计算速度快,适用于进化距离不大,信息位点少的短序列。本研究选用邻接法构建系统发育树,利用埃及伊蚊Aedes aegypti和白纹伊蚊A. albopictus的COI基因作为外群。分支的置信度采用自展法(Bootstrap analysis, BP)重复检测1 000次。

由表2可以看出,COI基因序列的碱基转换值明显高于颠换。T-C间的转换平均值是15,A-G间的转换平均值是5,T-C转换大于A-G间的转换。转换/颠换的平均值0.92,其中转换数42,颠换数45,转换主要发生于A-G之间,颠换主要发生于T-A之间。第1位点R值最小,仅0.69,说明第一位点的替换多是同义替换,不会导致氨基酸的改变。

2.2 系统发育树构建

基于Kimura-2-parameter模型,利用MEGA6软件邻接法构建青海常见寄生蚤COI基因序列的系统发育树,所有序列在系统发育树中形成44个高支持度的分支(图1)。

本工程于2016年7月20日进行第一次变形观测,于2017年7月17日进行最后一次变形观测,观测结果显示,支护桩水平位移量及变形速率均满足规范要求。

2.3 遗传距离差异分析

由MEGA6软件计算青海省部分蚤种遗传距离,分析其COI序列差异可知:全部蚤种内遗传距离0.01%~2.90%,种间遗传距离4%~12%,种间遗传距离显著大于种内遗传距离。表3以基因条数占比最大的双蚤属为例说明种间距离大小(3.1%~12.5%);表4以双蚤属中基因条数最多的长鬃双蚤为例说明种内遗传距离大小(0.001~0.017)。

由于多个电压互感器同时故障的概率很小,因此,当利用时间序列分层聚类将电压互感器分为两类及以上时,则认定包含电压互感器数量最多的一类是非故障互感器,而其他是故障电压互感器。

 

表2 青海省蚤类COI基因碱基替换数Table 2 The base substitutions on COI gene of fleas in Qinghai Province

  

位点Site转换/颠换(Ts/Tv)碱基替换数 Number of base substitutionTTTCTATGCTCCCACGATACAAAGGTGCGAGG第1位点 1st site0.696810161104301625741041第2位点 2nd site3.1347510529001058100148第3位点 3rd site1.0288000053000023000034平均值Average0.9220315182158630173138520683

3 讨论

3.1 形态鉴别结果的修订

本研究挑选了形态特征比较明显的蚤标本做分子实验,但这样依然出现了一些鉴定错误,尤其是雌蚤的鉴定结果。通过NCBI查询,蚤目现有7 227条核酸序列上传,但COI基因序列仅10条,GenBank登录号分别为JN008915-JN008924(Gunn et al., 2011)。在分析和比对本研究的蚤类COI基因片段序列时,我们发现一些个体的形态鉴别可能存在误定问题。如样本编号为Z112的窄板额蚤(雄蚤)的COI基因序列与欧洲兔蚤Spilopsyllus cuniculi的COI基因序列(GenBank登录号: JN008923)核苷酸一致性为85%,可以认定为蚤类的COI基因序列。与该号标本聚为一支的4个雌蚤 (Z100, Z103, Z108和Z26_09),根据第7腹板形态分别暂定为圆指额蚤、棕形额蚤、毛额蚤和巨凹额蚤。根据蚤类形态鉴别以雄性为主、雌性为辅的原则,我们将这4个雌蚤定命为窄板额蚤。鉴于形态常规分类存在鉴定错判的可能,今后蚤类鉴定应以雄性标本外部形态鉴定为主,结合分子鉴定结果进行雌性标本的鉴定,以更好地发现和纠正传统形态学鉴定中的错误,从而科学地鉴别物种。

 
 

图1 基于COI基因核苷酸序列用Kimura-2-parameter模型构建的蚤类邻接系统发育树Fig. 1 A neighbor-joining phylogenetic tree of fleas based on nucleotide sequence of COI with Kimura 2-parameter model图中分支上数值为1 000次自展检验置信度;标尺示遗传距离;括号内为GenBank登录号;问号示暂定种名。The number on the branch indicates bootstrap values for 1 000 replicates. Scale bar represents the genetic distance. The numbers in parentheses are GenBank accession numbers. The question mark indicates the tentative species name.

3.2 系统发育树的构建和形态分类存在的问题

构建的系统树显示所有个体形成44个高支持度的单一分支,提示蚤种类应该有44种,这与蚤凭证标本复核结果大致一致,说明DNA条形码技术可用于蚤类鉴定。

现场采集的蚤类经镜检鉴定为66种,但仅有2/3的蚤种获得了COI基因片段。形态鉴定结果显示双蚤属Amphipsylla、新蚤属Neopsylla和额蚤属Frontopsylla的蚤分别为10, 9和8种,但分子实验时新蚤属扩增出的种类最多(7种),额蚤属最少,只有1种,双蚤为6种,说明该研究COI基因引物适用于新蚤属,不适于额蚤属,提示本研究采用的引物还不适用于整个蚤目,还有必要设计针对蚤目的非特异性引物,用于蚤类DNA条形码的实际运用。

 

表3 双蚤属部分蚤种间(6种)与种内(6种)的遗传距离(%)Table 3 Inter-species (6 species) and intra-species (6 species) genetic distance (%) of the genus Amphipsylla

  

种间 Inter-species长鬃双蚤A. longispina 共和双蚤A. gongheensis似方双蚤指名亚种A. quadratoidesquadratoides直缘双蚤指名亚种A. tuta tuta原双蚤指名亚种A. primarisprimaries种内Intra-species长鬃双蚤 Amphipsylla longispina0.1共和双蚤Amphipsylla gongheensis3.10.6似方双蚤指名亚种Amphipsylla quadratoides quadratoides9.29.11.6直缘双蚤指名亚种Amphipsylla tuta tuta4.33.29.50.2原双蚤指名亚种Amphipsylla primaris pri-maries7.46.59.06.11.6细钩双蚤Amphipsylla tenuihama12.111.712.511.411.60.5

 

表4 长鬃双蚤样本间的种内遗传距离Table 4 Intra-species genetic distance of Amphipsylla longispina samples

  

样品编号Sample no.123456789101112131415161718120.00030.0000.00040.0100.0100.01050.0050.0050.0050.01560.0080.0080.0080.0020.01470.0080.0080.0080.0020.0140.00080.0080.0080.0080.0020.0140.0000.00090.0030.0030.0030.0100.0080.0080.0080.008100.0150.0150.0150.0050.0200.0070.0070.0070.015110.0070.0070.0070.0030.0120.0020.0020.0020.0070.008120.0020.0020.0020.0080.0070.0070.0070.0070.0020.0140.005130.0080.0080.0080.0050.0140.0030.0030.0030.0120.0100.0050.010140.0100.0100.0100.0100.0150.0080.0080.0080.0100.0120.0070.0080.012150.0100.0100.0100.0030.0150.0020.0020.0020.0100.0080.0030.0080.0050.010160.0080.0080.0080.0020.0140.0000.0000.0000.0080.0070.0020.0070.0030.0080.002170.0030.0030.0030.0070.0080.0050.0050.0050.0030.0120.0030.0020.0080.0070.0070.005180.0120.0120.0120.0020.0170.0030.0030.0030.0120.0070.0050.0100.0070.0120.0020.0030.008

五侧纤蚤Rhadinopsylla dahurica的COI基因序列与注册号JN00918的欧洲兔蚤Spilopsyllus cuniculi COI基因序列相似性为82%,也可以确定为蚤类的COI基因序列。在系统发育树图中所有五侧纤蚤标本分为2个高支持率的小分支(置信度99%),结合现场鉴别结果,将这2小分支分别为五侧纤蚤指名亚种与五侧纤蚤邻近亚种。形态鉴别为角尖眼蚤两个亚种(深窦亚种和指名亚种)的标本,其COI基因序列在系统发育树中却聚为一个分支,置信度100%,考虑亚种在形态鉴别中的很多问题和歧义,本研究认为把这一分支直接定为种的阶元——角尖眼蚤,而不再进行亚种的区分。鉴别结果为秃病蚤2个亚种(田鼠亚种与指名亚种)的标本在系统发育树中也聚为置信度100%的同一分支,出于同样的考虑,我们把这一分支也命名为秃病蚤。上述结果说明,有些蚤类的亚种分类存在遗传学的基础而有些可能并没有明确的遗传学差异,这些亚种的分类地位值得进一步探讨。

Dunnet GM, Mardon DK, 1991. Siphonaptera. In: Naumann PBC, Lawrence JF, Nielsen ES, Spradberry JP, Taylor RW, Whitten MJ, Littlejohn MJ eds. Insects of Australia: a Textbook for Students and Research Workers. 2nd ed. Division of Entomology, CSIRO, Australia. Melbourne University Press, Melbourne. 125-140.

系统发育树中长鬃双蚤与共和双蚤分支中问题较多,有4头蚤(2雌2雄)形态鉴定为青海双蚤、2雌蚤形态鉴定为共和双蚤、2雌蚤鉴定为青海双蚤、1雄蚤鉴定为丛鬃双蚤,但上述9头蚤却和长鬃双蚤聚为一支;共和双蚤分支中有1雄蚤形态鉴定为长鬃双蚤。复检透明标本后我们认为形态鉴别无误,所以把这两支暂时归为疑似长鬃双蚤、疑似共和双蚤类群。这些结果一方面提示为准确做好蚤类分子鉴定,有必要联合多种基因标记综合研判,以防研究结果出现偏颇;同时,也可能存在一些近缘种的同种异名问题。

Cai LY, Zhan XR, Wu WZ, 1987. The flea fauna of Qinghai Province. Acta Biol. Plat. Sin., 7(1): 87-107. [蔡理芸, 詹心如, 吴文贞, 1987. 青海的蚤类区系. 高原生物学集刊, 7(1): 87-107]

尽管NJ法建树有很多优点,但它也有其局限性,如所分析序列的遗传距离不能太大,对基因序列上的所有位点都等同对待,所构建的系统树难以说明种上水平的进化关系。今后如果在分子鉴定的基础上开展分子系统学的研究,则需要用两种或以上的方法建树,让构建的分子树更具有说服力。

在对物种进行DNA条形码分类的过程中,我们必须依据传统分类方法,假设目的物种为纯种并且归类正确,在此基础上再测定COI基因序列,以此作为该物种的DNA条形编码,供其他学者参考对比。尽管DNA条形码鉴定前景非常乐观,但在现阶段的使用中不能完全抛弃形态学手段,并应与经典分类紧密结合并尽可能保存凭证标本,而且还必须突破单分子标记的局限性。

蚤类系统发育研究还处于早期阶段,不同学者应用的分子标记不同影响了研究结果的可比性,今后应寻求适于蚤目分子系统学研究的标准标记以利于不同学者的协作研究。分子生物学方法在昆虫系统学研究中发挥了极为重要的作用,但并不能解决形态分类中的所有难题,形态数据与分子数据联合分析是昆虫分子系统学研究发展的趋势,两者作为系统学研究的互补信息可以更好地解决蚤类群系统进化问题。

参考文献 (References)

系统发育树中新蚤属细柄新蚤、阿巴盖新蚤聚在4个不同分支内,这在其他蚤种的系统发育树结果并未出现。因试剂盒提取DNA时,每头蚤都是单独提取,排除了样品交叉污染的可能。查找原始资料后发现标记红色的三分支样本均为1头,细柄新蚤(1♀)采自久治县的青海田鼠;副规新蚤(1♂)采自互助县的黄胸鼠体表,其上的副规新蚤黑色分支(2♂♂2♀♀)采自兴海县和互助县的甘肃鼢鼠体;阿巴盖新蚤(1♂)采自平安县的长尾仓鼠,其下的阿巴盖新蚤黑色分支(1♂2♀♀)采自都兰县和尖扎县的高原鼠兔;上述蚤种我们复鉴凭证标本的形态特征后认为形态鉴定无误,提示宿主和采集地的不同,会导致蚤种的分子数据不同,这在分类形态特征差别甚小的蚤属中尤为突出,从分子层面印证了隐种存在的可能性。

Cai LY, Zhan XR, Wu WZ, Li C, 1997. The Flea Fauna of Qinghai-Xizang Plateau. Shaanxi Science and Technology Publishing House, Xi′an. 10-296. [蔡理芸, 詹心如, 吴文贞, 李超, 1997. 青海高原蚤目志. 西安: 陕西科学技术出版社. 10-296]

3.2 PFI打浆预处理可显著提高玉米芯残渣的酶水解效率。随着打浆转数的提高,玉米芯残渣的酶水解效率逐渐提高;当打浆转数增加到20000转时,玉米芯残渣酶水解时的葡萄糖浓度与葡萄糖转化率分别达到23.94 g/L和72.0%。

L1490/H2198引物扩增条件:94℃预变性4 min; 94℃变性30 s, 52℃退火30 s, 72℃延伸40 s,共35个循环;LepF/LepR扩增条件:94℃预变性4 min; 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸40 s,共10个循环;94℃变性30 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸40 s,共30个循环。

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百达翡丽于北京开幕十周年之际,宣布其世界时腕表东八区代表城市将从 2019 年起回归“北京”,以向历史致敬!

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具体实现的功能是前台读者在搜索框输入关键词搜索,像使用百度一样,可以在海量数据中得到想要的查询结果。后台管理人员,通过全文搜索模块[3],迅速得到检索结果,对数据进行修改。前台和后台都设置有高级检索模块,可以通过设置检索条件,精确定位检索数据,比如:可以设置某一时间段、某一栏目等。

Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S, 2013. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0. Mol. Biol. Evol., 30(12): 2725-2729.

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马英,李海龙,何建,赵延梅,杨汉青,鲁亮,刘起勇
《昆虫学报》 2018年第04期
《昆虫学报》2018年第04期文献

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