灵芝两个无孢品种中水提物成分分析及免疫活性比较

灵芝是灵芝属Ganoderma真菌的统称，是一类大型药用真菌，隶属于真菌界Kingdom Fungi，担子菌门 Basidiomycota，伞菌纲 Agaricomycetes，多孔菌目Polyporales，灵芝科Ganodermataceae（Cao et al. 2012；戴玉成等2013；Zhou et al. 2015；Dai et al.2017）。

通常情况下，灵芝生长发育的后期，会向外弹射释放出生殖细胞，即担孢子，此为担子菌纲真菌的主要特征之一（张伟和曾园山 2004；孙馥雪2013）。但有些情况下，灵芝子实体可能只弹射少量孢子甚至不弹射孢子，此种灵芝被称之为无孢灵芝（卯晓岚 2000；张平等 2014）。

本研究中，龙芝2号和鹿角灵芝的菌种来源均为赤芝Ganoderma lingzhi Sheng H. Wu, Y. Cao & Y.C.Dai，且同属于无孢灵芝。龙芝2号是浙江龙泉地区培育的一种子实体专用型品种，由于自身结构而造成了弹射孢子的能力较弱（李朝谦等 2016）。鹿角灵芝则是福建农林大学国家菌草工程技术研究中心选择在赤芝的生长发育过程中，人为控制外界的CO2浓度，从而导致了子实体异型生长而不分化繁殖器官（钟孝武 2002）。为分析比较鹿角灵芝和龙芝2号的营养及活性成分的差异，此前曾有研究对灵芝两个无孢品种子实体中的三萜类物质及其抗肿瘤活性进行分析比较（钱丁寅等 2017）。本研究将进一步分析比较两者水提取物中多糖、核苷、蛋白质和氨基酸的种类及含量，并以沪农1号这一产孢灵芝为参照，探讨有孢灵芝和无孢灵芝的水提物免疫活性差异。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

1.1.1 子实体与细胞：龙芝2号和鹿角灵芝的子实体、对照品沪农1号有孢灵芝，分别由浙江省龙泉市灵芝栽培基地、福建农林大学国家菌草工程技术研究中心和上海市农业科学院食用菌研究所提供，其子实体的出发菌株经上海市农业科学院食用菌研究所唐传红副研究员鉴定均为赤芝Ganoderma lingzhi，所有样品粉粹后过20目筛备用。小鼠RAW 264.7细胞株（小鼠单核/巨噬细胞系）购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。

持续长度是该模型的一个基本参数.持续长度与自由旋转链的处理方法有异曲同工之妙,因为二者都采用了后键依次在前一键上投影并依此前推至所需键的计算方法.自由旋转链因为需要所有键之间进行两两点乘,因此其平均范围广,需要大量样本的统计平均方可采用投影法进行平均处理.持续长度涉及的是各个键在第一个键方向上投影,一旦键的方向与第一个键相反,它在z轴方向的投影就是负值.经平均处理后,负值就不再出现,代之以收敛于0的投影值.因此,持续长度的计算同样应该是大量连接单元的统计平均值.

1.1.2 试剂：细菌脂多糖（inositol and lipopolysaccharide，LPS）购自美国Sigma公司；RPMI 1640培养基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffered saline，PBS）购自美国 Gibco公司；青霉素和链霉素购自美国Amresco 公司，其他试剂均为国产分析纯。Griess试剂配制方法参照冯娜等（2010a）的方法。

首先，建立“3T”原则导向下的信息发布制度。 设计科学全面的信息发布制度，是应对网络事件舆情危机的重要举措之一。 传统的由单一部门独立进行信息发布的方法存在着诸多问题，如遇到涉及多主体的事务时会造成部门扯皮、沟通不畅、互相推卸发布职责。 而“3T”原则下信息发布机制的建立，首先建立信息发布常设机构，用以协调各部门联动，对政府发布舆情进行统筹安排。 机构内部依据发布流程设立分部以维持机构运行。 其次，建立与舆情发布相关的专家联系咨询制度，建构发布机构与民众的沟通互动机制，在常设机构下组建一支高素质的舆情发布队伍。

Zhang DX, Wang XL, Liu GQ, 2015. The structure and the structure-activity relationships of Ganoderma lucidum polysaccharides. Food Industry, 36(11): 258-261 (in Chinese)

1.2 样品制备

精密称取粉碎后的样品2份，每份10g，其中一份加入85%乙醇200mL超声提取3次，每次1h，倾出上清液，滤渣继续加入200mL超纯水100℃水浴2h，过滤，滤液真空冷冻干燥，干燥后样品用于测定粗多糖含量及免疫活性；另一份加入200mL蒸馏水超声提取30min，上清液测定样品中核苷含量。

1.3 样品测定

1.3.1 多糖含量测定：参照NY/T 1676-2008《食用菌中多糖含量的测定》检测依据，由农业部食用菌产品质量监督检验测试中心（上海）进行检测。

1.3.2 多糖重均分子量分布测定：采用高效凝胶尺寸排阻色谱-多角度激光光散射仪-示差折光检测仪（high-performance size exclusion chromatographymulti-angle laser light scattering-refractive index detector，HPSEC-MALLS-RI）联用分析多糖重均分子量分布。色谱柱：TSK Gel Super Multipore PW-H（6.0mm×150mm，日本Tosoh公司），其他测定条件参考Liu et al.（2013）的方法。

1.3.3 核苷含量测定：采用高效液相色谱法分析核苷样品中核苷种类及含量，色谱条件和洗脱程序参考王金艳等（2016）的方法。

1.3.4 蛋白质、氨基酸含量测定：样品中蛋白质及氨基酸含量由农业部食用菌产品质量监督检验测试中心（上海）测定。其中，分别参照GB 5009.5-2010《食用菌中粗蛋白含量的测定》方法测定样品中蛋白质的含量；参照GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸含量的测定》方法测定样品中氨基酸含量。

冯娜，张劲松，唐传红，刘艳芳，郝瑞霞，杨焱，唐庆九，贾薇，汪文瀚，吴迪，周帅，刘方，2010a. 不同生育期灵芝子实体水提物与其免疫活性. 食用菌学报，17(4): 52-57

2 结果与分析

2.1 多糖测定

2.1.1 多糖得率及含量测定：灵芝两个无孢品种中多糖含量测定结果表明，龙芝2号中的多糖得率及含量稍高于鹿角灵芝（表1）。

Feng N, Zhang JS, Tang CH, Liu YF, Hao RX, Yang Y, Tang QJ, Jia W, Wang WH, Wu D, Zhou S, Liu F, 2010a. Effect of aqueous extracts from Ganoderma fruit bodies harvested at different stages of development on nitric oxide production by RAW 264.7 cells. Acta Edulis Fungi,17(4): 52-57 (in Chinese)

2.1.2 多糖重均分子量分布测定：从 HPSEC图谱（图1、图2）中可以看出，龙芝2号子实体中含有3个糖峰，鹿角灵芝子实体中只有一个糖峰，这说明它们的多糖分子量的分布存在差异。由表2重均分子量的计算结果可知，龙芝 2号多糖的重均分子量分布范围较广，且多糖分子量较大，其多糖Peak 1、Peak 2和Peak 3的分子量分别为2.021×106、1.802×106 和 4.825×105，鹿角灵芝子实体中只含有分子量为1.589×104的多糖组分。从质量分数上看，两者多糖组分均集中在40min后的糖峰。

样例的实体中包含原型，原型又包括冗余信息原型与非冗余信息原型。研究发现，表面上与问题无关的冗余信息对原型激活具有干扰效应。“原型启发”理论认为，概念内涵的获得依赖于激活原型中的关键启发信息，即可通过减少、缩小类别对象获得关键信息。由于概念模型是利用图形、符号和文字组合而成的流程图，能对生命活动的规律和机理等进行分类、描述和揭示，所以可利用概念模型将原型中的关键信息呈现出来。

2.1.3 核苷含量测定：从两者核苷液相图谱（图3）中可以看出，鹿角灵芝和龙芝2号中核苷种类差异不大，但由表3可知，两者核苷含量存在明显差异，其中，鹿角灵芝中尿嘧啶、次黄嘌呤、尿苷、腺嘌呤、尿苷及腺苷的含量高于龙芝2号，而龙芝2号中胞苷、黄嘌呤及肌苷的含量高于鹿角灵芝。

 

表1 灵芝两个无孢品种水提物中的多糖得率及含量Table 1 Yield and content of polysaccharides from water extract of two sporeless Ganoderma lingzhi cultivars

  

Note: LZ: Longzhi No. 2; LJ: Antler-shape Ganoderma lingzhi.The same below.

 

样品Sample得率Yield (%)多糖含量Polysaccharide content (%)鹿角灵芝LJ 1.29 2.74±0.06龙芝 2号LZ 1.44 2.96±0.05

  

图1 鹿角灵芝多糖分析的HPSEC图谱Fig. 1 HPSEC spectra of polysaccharide from antler-shape Ganoderma lingzhi (LJ).

  

图2 龙芝2号多糖分析的HPSEC图谱Fig. 2 HPSEC spectra of polysaccharide from Longzhi No. 2(LZ).

2.2 蛋白质和氨基酸含量

鹿角灵芝和龙芝 2号中蛋白质含量分别为10.70%和10.32%，其蛋白质含量差异不大（表4）。根据GB/T 5009.124-2003《食品中氨基酸含量的测定》方法检测灵芝2个无孢品种中的氨基酸组成及含量可知，鹿角灵芝和龙芝2号中氨基酸含量相似，其中含有必需氨基酸中的6种，两者均不含有组氨酸，蛋氨酸在两者中含量均较高，分别达到2.556%和2.591%（表5）。

  

图3 灵芝两个无孢品种中核苷的高效液相色谱图Fig. 3 HPLC analysis of nucleoside from two sporeless Ganoderma lingzhi cultivars.

2.3 体外免疫活性测定

不同浓度的鹿角灵芝和龙芝 2号中粗多糖对RAW 264.7细胞释放NO含量见图4，体外免疫活性测定以LPS和沪农1号灵芝为阳性对照，目的是考察实验的可靠性并比较无孢灵芝与有孢灵芝体外免疫活性的差异。从结果可以看出，灵芝两个无孢品种水提物对RAW 264.7细胞NO释放量的促进作用趋势及强度相似，但沪农1号有孢灵芝中粗多糖对RAW 264.7细胞释放NO的促进作用强于鹿角灵芝和龙芝 2号。其中，沪农 1号在最大浓度（500µg/mL）作用下，其NO的释放量达到16µmol/L左右，而灵芝两个无孢品种在此浓度下，NO的释放量仅为7µmol/L左右。说明不同灵芝品种中多糖的免疫活性存在较大差异。

贾庆龙表示，双创园80%的业务围绕互联网开展，随着全国互联网产业转型升级步伐加快，特别是国务院把宁夏确定为西部地区“互联网+医疗健康”这个重大利好和园区产业基础较好这个客观情况形成的叠加优势，为双创园发展以互联网为依托的信息技术和中、高端大健康为核心业态的智慧生态产业园区建设提供了优质的业态培育基础。

 

表2 灵芝两个无孢品种中多糖的分子量分布特征Table 2 Molecular weight distribution of polysaccharides from two sporeless Ganoderma lingzhi cultivars

  

Note: Mw: Weight average molecular weight; Mn: Number average molecular weight.

 

样品Sample峰Peak重均分子量Mw多分散系数Mw/Mn质量分数Mass fraction (%)鹿角灵芝LJ Peak 1 1.589×104 1.151 100.0龙芝2号LZ Peak 1 2.021×106 1.002 22.8 Peak 2 1.802×106 1.000 16.0 Peak 3 4.825×105 2.625 61.2

 

表3 灵芝两个无孢品种中核苷种类及含量对比Table 3 The kinds and content of nucleoside from two sporeless Ganoderma lingzhi cultivars

  

分析物Analytes鹿角灵芝Antler-shape G. lingzhi (LJ) (µg/g)龙芝2号Longzhi No. 2 (LZ) (µg/g)尿嘧啶 Uracil 63.07±0.01 57.16±0.00胞苷 Cytidine 70.06±0.02 71.11±0.03次黄嘌呤 Hypoxanthine 35.69±0.00 24.59±0.02黄嘌呤 Xanthine 148.20±0.01 200.27±0.01尿苷 Uridine 230.54±0.00 119.21±0.01腺嘌呤 Adenine 28.57±0.04 17.83±0.00肌苷 Inosine 23.77±0.01 39.48±0.02鸟苷 Guanosine 167.36±0.00 95.36±0.01腺苷 Adenosine 124.06±0.02 107.06±0.03

 

表4 灵芝两个无孢品种中蛋白质含量对比Table 4 Content of protein in two sporeless Ganoderma lingzhi cultivars

  

样品Sample鹿角灵芝Antler-shape G. lingzhi (LJ)龙芝2号Longzhi No. 2 (LZ)蛋白质Protein (%)10.70±0.10 10.32±0.06

 

表5 灵芝两个无孢品种中氨基酸含量对比Table 5 Content of amino acids in two sporeless Ganoderma lingzhi cultivars

  

注：*为必需氨基酸Note: * represents essential amino acids.

 

氨基酸 鹿角灵芝Amino acids Antler-shape G. lingzhi (LJ) (%)龙芝2号Longzhi No. 2 (LZ) (%)天冬氨酸 Asp 0.477±0.02 0.426±0.02苏氨酸* Thr 0.306±0.04 0.280±0.04丝氨酸 Ser 0.319±0.02 0.250±0.01谷氨酸 Glu 0.446±0.05 0.459±0.10甘氨酸 Gly 0.271±0.04 0.229±0.05丙氨酸 Ala 0.287±0.01 0.255±0.02缬氨酸* Val 0.240±0.04 0.208±0.05蛋氨酸* Met 2.556±0.03 2.591±0.01异亮氨酸* Ile 0.272±0.06 0.253±0.01亮氨酸* Leu 0.356±0.15 0.330±0.05酪氨酸 Tyr 0.120±0.01 0.120±0.04苯丙氨酸* Phe 0.202±0.05 0.200±0.12赖氨酸* Lys 0.189±0.04 0.205±0.08组氨酸His 0.000 0.000精氨酸 Arg 0.173±0.05 0.156±0.05脯氨酸 Pro 0.212±0.12 0.190±0.01必需氨基酸Essential amino acids 4.121±0.23 4.067±0.21非必需氨基酸Non-essential amino acids 2.309±0.25 2.083±0.18

  

图4 灵芝两个无孢品种水提物对RAW 264.7细胞释放NO的影响Fig. 4 Effects of water extract from two sporeless Ganoderma lingzhi cultivars on NO production by RAW 264.7 cells. LZ:Longzhi No. 2; LJ: Antler-shape G. lingzhi; HZ represents Hunong No. 1 cultivar. LPS: Lipopolysaccharide; PBS:Phosphate buffered saline.

3 讨论

本研究以龙芝2号和鹿角灵芝的子实体为原材料，分析这两个无孢品种中水提物成分及含量的差异，并检测了水提物体外刺激巨噬细胞RAW 264.7释放NO的能力。结果证实，鹿角灵芝与龙芝2号子实体的水提物均具有体外刺激巨噬细胞 RAW 264.7释放NO的活性，且随着样品浓度的增加，其巨噬细胞释放NO的量也有所增加，呈浓度依赖性。这说明灵芝两个无孢品种的子实体可能具有一定的免疫活性。但相对于产孢灵芝沪农1号，此无孢灵芝水提物的免疫活性相对较弱。对鹿角灵芝和龙芝2号子实体水提物的化学成分和含量的分析结果表明两者子实体中的多糖含量和蛋白质含量分别相当，含有相同的氨基酸种类，但多糖分子量分布存在较大差异。龙芝2号中含有3种多糖，鹿角灵芝中仅有1种多糖，这说明两者子实体中含有不同种类的多糖。此外，鹿角灵芝和龙芝2号子实体中含有相同的核苷种类，但各核苷的含量存在一定的差异。

灵芝多糖是灵芝水溶性成分中的一类重要物质，是灵芝研究的重点之一。通过甲基化、高碘酸盐氧化及Smith降解、酶解等化学衍生化反应，并辅助核磁共振、红外光谱、气相色谱-质谱联用等技术手段，灵芝多糖的结构得以解析。目前已知鉴定结构的 70余种灵芝多糖中，分子量范围大多在2.0×103–4.0×106 Da，以 β 构型为其主要构型，由 D-葡萄糖为主的杂多糖组成（林志彬 2001）。

●在吉林省白城市套北区南高平村有千亩重度盐碱地，PH值达到9以上，最高达到12。多年来种植水稻，插秧后成活率只有30%，使用有机硅功能肥，成活率达到90%以上。以前，水稻插秧一个月以后，土壤出现返碱，造成水稻烂根死苗。使用有机硅功能肥不再出现返碱，亩产达到1000斤，每亩增产600斤。白城的老百姓奔走相告，在盐碱土壤上纷纷使用有机硅功能肥，老百姓都说硅谷好肥料，省时省力有神效。

灵芝中的多糖是被证实具有免疫活性的一类物质。灵芝中多糖的分子量分布、单糖的组成和比例、重复单元数目以及多糖的空间构象等，都是影响多糖生物活性有无和强弱的因素（张冬雪等2015）。因此，针对灵芝两个无孢品种中的多糖，有必要进一步研究其化学结构的差异及构效关系，为灵芝中活性物质的精确利用提供研究基础。

● 联网平台重复建设带来的使用烦恼，催生了用户对应用轻量化的旺盛需求。原先是一种软件解决一个问题或一类问题，面对不断增长的各种需求，用户迫切需要一站式的解决方案，不会再三部署不同的平台软件，而是通过统一的后端数据平台适配不同的应用程序，构建整个安防系统的信息生态圈。

Cao Y, Wu SH, Dai YC, 2012. Species clarification of the prize medicinal Ganoderma mushroom “Lingzhi”. Fungal Diversity, 56: 49-62

常规西医治疗；口服5 m g泼尼松（国药准字H44020682，广东华南药业集团有限公司生产，药品特性：化学药品，5 mg）联合普瑞巴林（商品名：乐瑞卡，德国Pfizer Limited生产，国药准字J20100102，分装企业：辉瑞制药有限公司药品特性：化学药品，75 mg），初始计量75 mg/d，1周后剂量增加至150～160 mg/d，3次/d。

对研究区以及研究区各县NDVI、RUE分别进行显著性检验（P＜0.2）（表 1）［13］。 从整个研究区来看，NDVI无显著变化，而RUE显著降低，整个研究区植被变化的人为影响呈中度负向干扰。分县域来看，每个县NDVI均呈上升趋势，但变化不明显；石渠县、若尔盖县、红原县与阿坝县4个县RUE均显著降低，这4个县对植被变化的人为干扰呈中度负向干扰，其余3个县NDVI、RUE均无明显变化，人为干扰不明显。

Dai YC, Cao Y, Zhou LW, Wu SH, 2013. Notes on the nomenclature of the most widely cultivated Ganoderma species in China. Mycosystema, 32(6): 947-952 (in Chinese)

[REFERENCES]

Dai YC, Zhou LW, Hattori T, Cao Y, Stalpers JA, Ryavrden L,Buchanan P, Oberwinkler F, Hallenberg N, Liu PG, Wu SH,2017. Ganoderma lingzhi (Polyporales, Basidiomycota),the scientific binomial for the widely cultivated medicinal fungus Lingzhi. Mycolopical Progress, 16:1051-1055

季、年平均气温（10 m高度）：年均9.58℃，春季10.73℃，夏季25.48℃，秋季9.95℃，冬季-8.19℃。

Feng N, Zhang JS, Tang QJ, Hao RX, Liu YF, Yang Y, Jia W, Zhou S,Tang CH, Zhong JJ, 2010b. Steroids from fruiting bodies of Coprinus comatus and their inhibition to tumor cell proliferation. Mycosystema, 29(2): 249-253 (in Chinese)

Li CQ, Cai WM, Han HY, 2016. The characteristics of Longzhi No.2, a new Ganoderma lucidum, and its performance of productive cultivation. Edible and Medicinal Mushrooms,24(2): 118-119 (in Chinese)

Lin ZB, 2001. Modern research on Ganoderma lucidum.Beijing Medical University Press, Beijing. 1-157 (in Chinese)

其次，危机也会改变相关声索国的决策逻辑。长期以来，越菲等声索国利用中国的克制不断采取“以小欺大”的方式来扩大既得利益并“乐此不疲”。南海相关危机中的中国决心展示，也将使相关声索国决策中的极端民族主义思维碰壁，理性思维逐渐回归主流，从而会慢慢地转向依靠双方的合作与沟通来理性地管控分歧与争端。以菲律宾为例，2016年新上任的总统杜特尔特就职后开始快速调整菲律宾的南海政策。这很大程度上是因为，过去几年阿基诺三世政权在和中国的对抗中，菲律宾什么也没有得到。在现任菲律宾总统杜特尔特看来，“中菲南海争端的解决应该排除战争手段，转而采取渐进式谈判这一和平路径加以实现”。[33]

Liu Y, Zhao Y, Yang Y, Tang QJ, Zhou S, Wu D, Zhang JS, 2013.Structural characteristics and hypoglycemic activity of polysaccharides from Coprinus comatus. Bioactive Carbohydrates & Dietary Fibre, 2(2): 164-169

Mao XL, 2000. The macrofungi in China. Henan Science and Technology Press, Henan. 10-20 (in Chinese)

Qian DY, Feng N, Liu W, Zhang JS, Han W, 2017. Comparison of ethanolic extracts from fruit bodies of two sporeless cultivars of Ganoderma lingzhi. Acta Edulis Fungi, 24(2):67-70 (in Chinese)

因此，如何合理地使用教材，从学生的实际出发，在尊重教材的基础上，灵活地、创造性地使用教材就成为了摆在教师面前的一个亟待解决的问题。下面，就如何灵活使用教材谈谈自己的一些想法。

Sun FX, 2013. Modern pharmacology of Ganoderma lucidum.Chinese Medicine, 8(8): 1199-1200 (in Chinese)

Wang JY, Wang CG, Zhang JS, Zhu LN, Liu YF, Zhou S, Zhang Z,Tang QJ, 2016. An analysis on nucleosides of spore powder produced by Ganoderma lingzhi. Mycosystema,35(1): 77-85 (in Chinese)

1.1.3 仪器：Waters 2695高效液相色谱（Waters 2996型二极管阵列检测器，美国Waters公司）；Waters 2414示差折光检测器（美国Waters公司）；多功能倒置荧光显微镜（日本Olympus 公司）；Synergy HT多功能酶标仪（美国 Bio-Tek公司）；超低温冰箱（Thermo Forma公司）；二氧化碳培养箱（美国Thermo Forma公司）；Coulter Z series细胞计数仪（美国Beckman-Coulter公司）；台式高速大容量离心机（德国 Eppendorf公司）；超低温冰箱（美国Thermo Forma公司）；旋转蒸发仪（德国BÜCHI公司）；HWS28型电热恒温水浴锅（上海一恒科学仪器有限公司）；KQ-600B型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

Zhang P, Xie N, Lai TQ, 2014. Biological characteristics of Ganoderma sp. Journal of Hebei North University(Natural Science Edition), 30(5): 36-40 (in Chinese)

Zhang W, Zeng YS, 2004. Research progress of Ganoderma lucidum spores. Journal of Integrative Medicine, 2(6):463-465 (in Chinese)

Zhong XW, 2002. Antler-shape Ganoderma lucidum and its pollution-free cultivation points. Research & Information on Traditional Chinese Medicine, 4(10): 23-25 (in Chinese)

Zhou LW, Cao Y, Wu SH, Vlasák J, Li DW, Li MJ, Dai YC, 2015.Global diversity of the Ganoderma lucidum complex(Ganodermataceae, Polyporales) inferred from morphology and multilocus phylogeny. Phytochemistry,114: 7-15

我国水资源总量为28 412亿m3，居世界第六位，人均水资源量约2 100 m3，为世界平均值的28%。人多水少、水资源时空分布不均是我国的基本国情和水情。水资源的有效开发利用有力地支撑了经济社会的快速发展，但总量不足和水质恶化导致的水资源短缺也成为制约我国经济社会发展一大“瓶颈”。

[附中文参考文献]

戴玉成，曹云，周丽伟，吴声华，2013. 中国灵芝学名之管见. 菌物学报，32(6): 947-952

1.3.5 体外免疫活性测定：参照冯娜等（2010b）的方法进行多糖刺激RAW 264.7细胞释放NO含量的测定。取对数生长期的RAW 264.7细胞，将其稀释成5×105个/mL的细胞悬液，分别加入96孔板中，每孔180µL。培养箱中培养4h后加入20µL不同浓度的待测样品，每浓度3个重复。阴性对照为PBS溶液，阳性对照为 LPS（作用终浓度为 1µg/mL），37℃培养48h。分别取100µL上清于96孔板，每孔加入50µL Griess试剂，室温孵育10min后，在543nm波长下测定吸光度。根据亚硝酸钠制作的标准曲线计算NO产生量。

冯娜，张劲松，唐庆九，郝瑞霞，刘艳芳，杨焱，贾薇，周帅，唐传红，钟建江，2010b. 毛头鬼伞子实体中甾类化合物的结构鉴定及其抑制肿瘤细胞增殖活性的研究. 菌物学报，29(2): 249-253

李朝谦，蔡为明，韩鸿翼，2016. 灵芝新品种龙芝2号的特性及生产性栽培的表现. 食药用菌，24(2): 118-119

林志彬，2001. 灵芝的现代研究. 第2版. 北京：北京医科大学出版社. 129-157

卯晓岚，2000. 中国大型真菌. 河南：河南科学技术出版社. 10-20

钱丁寅，冯娜，刘伟，张劲松，韩伟，2017. 两种无孢灵芝子实体醇提物的比较. 食用菌学报，24(2): 67-70

马克思主义与功利主义（实用主义）的论争也即“问题与主义”之争，是在科学社会主义传入中国之后，马克思主义与反马克思主义进行的第一次比较著名的论战，对马克思主义及其公平思想的传播产生了较大影响。

孙馥雪，2013. 灵芝的现代药理学研究. 中国医药，8(8):1199-1200

王金艳，王晨光，张劲松，朱丽娜，刘艳芳，周帅，张忠，唐庆九，2016. 灵芝孢子粉中核苷类成分分析. 菌物学报，35(1): 77-85

张冬雪，王晓玲，刘高强，2015. 灵芝多糖的结构及构效关系. 食品工业，36(11): 258-261

张平，谢娜，赖腾强，2014. 无孢灵芝菌丝生物学特性研究. 河北北方学院学报（自然科学版），30(5): 36-40

张伟，曾园山，2004. 灵芝孢子的研究进展. 中西医结合学报，2(6): 463-465

钟孝武，2002. 鹿角灵芝及其无公害栽培要点. 中国现代中药，4(10): 23-25