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光照和培养基对内生真菌棘豆链格孢Alternaria oxytropis苦马豆素含量的影响

更新时间:2009-03-28

小花棘豆Oxytropis glabra DC.又称醉马草,是豆科棘豆属多年生草本植物(马毓泉 1989),许多植株含对牲畜有毒的吲哚里兹啶类生物碱——苦马豆素(swainsonine,SW),其阳离子的半椅式构象类似于甘露糖阳离子,能与甘露糖苷竞争性结合抑制α‐甘露糖苷酶活性(Colegate et al. 1979),造成细胞功能紊乱,使牲畜出现中毒症状,严重时导致大量死亡,给畜牧业带来巨大损失(卢萍 2008);在医学领域,SW一直被作为是研究糖蛋白N‐寡糖合成的工具药,近年来又由于良好的抗肿瘤和免疫调节作用,而被广泛关注。由于SW(C8H15NO3)分子结构是双杂环,而且有4个手性构型,在人工合成过程中易形成手性异构体,难以区分,人工合成价格昂贵(聂礼飞等 2009)。因此,生物提取SW有望成为一种新途径。

国际上将棘豆属、黄芪属等有毒植物统称为疯草,而SW是引起动物疯草病的唯一毒素(James et al. 1981)。Braun et al.(2003)从美国 3种疯草(Oxytropis lambertii、Oxytropis sericea 和 Astragalus mollisimus)分离培养出产SW的内生真菌,鉴定为Embellisia,Pryor et al.(2009)将Embellisia oxytropis修订为 Undifilum oxytropis,Woudenberg et al.(2013)再修订为 Alternaria oxytropis。卢萍等(2009)在小花棘豆O. glabra中分离出内生真菌,经体外培养后合成了 SW,但未分离出该内生真菌的植物体都不含 SW,从而确定了 SW 由内生真菌而不是植物体产生,经形态学与 DNA鉴定将其与Braun鉴定的菌株归为一类。在SW合成途径中,酵母氨酸还原酶基因编码酵母氨酸还原酶(Harris et al. 1987;Sim & Perry 1997),催化赖氨酸转化为酵母氨酸,再生成α‐氨基己二酸半醛,α‐氨基己二酸半醛是合成SW的前体之一,因而酵母氨酸还原酶是生物合成SW的关键酶之一(Mukherjee et al.2012)。目前推测SW生物合成可能有两条途径,P6C途径和P2C途径。在P6C途径中,L‐赖氨酸→酵母氨酸→α‐氨基己二酸半醛→P6C,酵母氨酸还原酶催化了以上3步反应,P6C在吡咯啉‐5‐羧酸还原酶作用下生成吡啶羧酸,然后聚酮合酶催化其生成1‐氧‐吲哚里西啶,再在 P450家族酶的作用下生成SW,但具体的细节不清楚;P2C途径是新近推测出的另一条SW生物合成途径,由L‐赖氨酸→α‐己酮酸→P2C→吡啶羧酸→1‐氧‐吲哚里西啶→SW,该途径涉及的酶尚不清楚,还需深入研究(Lu et al.2016;Ren et al. 2017)。

对牛羊口蹄疫病进行防治的过程中,免疫工作是非常重要的一环。为了更好的保证口蹄疫防治效果,相关部门应该按照国家要求开展免疫计划,尤其是对于牛羊等动物的免疫效果,更是直接影响了口蹄疫的防治质量。对于出口以及进口的牛羊,需要更加细致的进行免疫效果测定,更好的避免口蹄疫病毒侵入。

本课题组用简并PCR和RACE克隆得到小花棘豆内生真菌酵母氨酸还原酶基因 cDNA全长序列(KJ944635),又克隆出酵母氨酸还原酶完整基因序列(KY052048),构建了酵母氨酸还原酶基因缺失载体,将其转化到原生体中再生,在添加潮霉素的再生培养基上筛选转化子,获得了酵母氨酸还原酶基因缺失突变体M1。鉴于前人在A. oxytropis中发现绝大多数SW存在于胞内,菌丝体SW的含量远高于发酵液中SW的含量(余永涛 2009),本研究探索OW7.8和M1株在不同培养基和光照条件下菌落生长速率及其菌丝体中SW含量的变化,为研究酵母氨酸还原酶基因对内生真菌生物合成SW的影响奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

内生真菌Alternaria oxytropis的野生株OW7.8和酵母氨酸还原酶基因缺失突变株M1来源于本实验室。

1.2 培养基

M1菌株在CDA上暗培养时,SW含量在14–29d期间上升,29d时至最高点(2.43μg/g)后下降。在PDA上培养时,暗培养下SW在29d达到最大(2.19μg/g)后下降,间歇光照下在 24d达到最大(1.60μg/g)并开始下降。在ODA上暗光照条件培养时,其变化趋势亦为先上升后下降且29d时达到最高(1.54μg/g);间歇光照下,在14d SW含量最高(2.49μg/g),后急速下降,19–29d期间上升,到34d开始下降(图3B)。

本文采用熵权法客观赋予权重,虽然选取上存在不全面的因素,但从一定程度上来说,具有科学性及可借鉴性,同时基于耦合协调度模型,较客观的研究了湖南省2001~2015年城市化与生态环境耦合协调关系及其动态过程。主要结论如下:

1.3 培养方法

James LF, Hartley WJ, Van Kampen KR, 1981. Syndromes of Astragalus poisoning in livestock. Javma-Journal of the American Veterinary Medical Association, 178(2): 146‐150

真菌生长过程中,菌落的生长速率及次生代谢情况与培养条件密切相关,培养条件的变化可对次生代谢过程产生影响,内生真菌受环境胁迫作用,如pH改变和温度变化,都可改变SW的含量(Ralphs et al. 2008)。本研究发现A. oxytropis 野生株OW7.8在胡萝卜葡萄糖琼脂(CDA)上暗培养时菌落生长速度最快,而 M1在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)上暗培养时菌落生长速度最快;SW 在间歇光照下合成量高。何珊等(2012)将内生真菌OW5.3在马铃薯蔗糖琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、马铃薯燕麦片琼脂培养基和马铃薯玉米粉琼脂培养基上培养,发现马铃薯葡萄糖琼脂培养基上菌落生长速率最快,马铃薯燕麦片琼脂培养基培养菌丝体SW 的含量相对较高,与本研究结果相似,都是在以葡萄糖为碳源情况下菌落生长快。

1.4 菌落生长速率的测定

将坐标纸固定在每个培养皿的背面,从培养第5天开始,每隔3d以菌落边缘4个生长点为基点测量菌落直径,每个菌落测2次,共测3个菌落,取平均值,计算菌落生长速率。

1.5 菌丝体SW的提取与测定

长时间光照使菌落生长变缓,故本研究选择间歇光照和暗培养条件在前述3种培养基上于25℃恒温培养内生真菌,进行SW提取和测定。从第14天开始,每隔 5d从平板上刮取菌丝,置于干燥器中80℃干燥 20h,直至恒重,准确称取干重并记录,每组3次重复。

Lu P, Dennis C, Zhao ML, Dale RG, Lü GF, Han GD, 2009.Culture and identification of endophytic fungi from Oxytropis DC. Acta Ecologica Sinica, 29(1): 53‐58 (in Chinese)

1.5.2 HPLC‐MS的应用:HPLC‐MS检测柱为 C18 反向柱,检测母离子数156,流动相为甲醇‐乙酸铵,时间梯度为 0–2min,流速 0.4mL/min,进样 2μL,于30℃柱温洗脱分离。用无菌超纯水制备5个浓度梯度的标准品溶液(0.31、0.62、1.24、2.47、4.95μg/mL)500μL,用0.22μm针筒式滤膜过滤器分别过滤,再用孔径0.2μm溶剂微孔滤膜真空抽滤1L甲醇‐乙酸铵(5%甲醇,20mmol/L乙酸铵)流动相,按浓度由低至高依次自动进样,绘制SW标准曲线。取待测样品用 500μL无菌水溶解,过滤,上机检测。Agilent Mass Hunter定量分析软件对所得数据进行处理。

主要危害酸樱桃和甜樱桃的叶片。在酸樱桃上产生褐色或紫色不规则形坏死斑,数斑联合可使叶片大部分枯死,叶背产生红霉。甜樱桃病叶上的病斑大而圆,叶背有粉色霉产生,病叶易早落。

1.6 统计学分析

使用SPSS Statistic 17.0(www.ibm.com/software/analytics/spss)进行多因素方差检验(ANOVA),分析菌株、培养条件对真菌SW含量的影响。

2 结果与分析

2.1 不同培养条件对内生真菌生长速率的影响

菌株Alternaria oxytropis OW7.8菌丝生长形成白色绒毛状的边缘整齐的圆形菌落,边缘致密,中间有明显隆起,并分泌黑色素,菌丝最终变成黑色(图1左)。M1菌丝生长形成白色边缘整齐的圆形菌落,但光照培养下的菌落表面出现明显的褶皱,相较于OW7.8 而言,菌落更为致密,未形成突起,分泌红色素,使菌落周围培养基变为淡红色(图1右)。相同的光照条件下,不同培养基条件的OW7.8和M1生长速率不同(表1),暗培养比光照培养下的菌落生长速度更快,其中OW7.8在ODA上真菌生长速率低于CDA、PDA,M1在PDA上培养明显优于ODA、CDA。相同培养条件下,M1生长速率明显快于OW7.8。

2.2 内生真菌中SW含量变化动态

以苦马豆素标准品浓度为横坐标,液相色谱265nm处吸收峰响应值×103为纵坐标获得的标准方程 y=377.114626*x‐59.639818,相关系数 R2=0.998,线性关系良好(图2),可进行后续实验。

Yu YT, 2009. Isolation, identification and genetic polymorphism of swainsonine‐producing fungal endophytes from locoweeds in China. PhD Dissertation,Northwest A & F University, Yangling. 55‐60 (in Chinese)

菌株 A. oxytropis OW7.8在 PDA上暗培养14–29d期间SW含量均呈现上升状态,第29天达到最高(12.07μg/g)后呈下降趋势;间歇光照条件下,14–29d期间逐渐上升,29d时达最高点(18.54μg/g),29–44d迅速下降。在 ODA 上间歇光照培养第14天时SW含量最高(20.35μg/g),随即下降至最低,后呈现上升趋势到34d时开始下降;暗培养条件下,缓慢上升至最高点后迅速下降。在CCA上不同光照条件下培养,SW 含量呈现相似的变化趋势(图3A)。

  

图1 不同培养条件下OW7.8(左)和M1(右)菌落形态 A1:PDA上全光照培养;B1:ODA上全光照培养;C1:CDA上全光照培养;A2:PDA上间歇光照培养;B2:ODA上间歇光照培养;C2:CDA上间歇光照培养;A3:PDA上暗培养;B3:ODA上暗培养;C3:CDA上暗培养Fig. 1 The strains Alternaria oxytropis OW7.8 (left) and M1 (right) colony morphology under different culture conditions. A1:Light culture on PDA; B1: Light culture on ODA; C1: Light culture on CDA; A2: Intermittent light on PDA; B2: Intermittent light on ODA; C2: Intermittent light on CDA; A3: Darkness culture on PDA; B3: Darkness culture on ODA; C3: Darkness culture on CDA.

 

表1 不同培养条件下真菌菌落的直径Table 1 The colony diameters of two fungal strains of Alternaria oxytropis under different culture conditions

  

Note: **P<0.01; *0.01<P<0.05.

 

菌株Strain培养基Medium光照培养Light culture (mm/d)间歇光照Intermittent lighting (mm/d)暗培养Darkness culture (mm/d)ODA 0.27±0.02** 0.54±0.03** 1.55±0.01**OW7.8 M1 PDA 0.36±0.01** 0.60±0.06** 2.45±0.09**CDA 0.43±0.04** 0.46±0.07** 2.57±0.17**ODA 2.23±0.02** 2.74±0.09* 4.32±0.12**PDA 2.65±0.02** 2.91±0.05 4.93±0.10**CDA 2.27±0.01* 2.53±0.07* 3.85±0.10**

  

图2 液相色谱测定苦马豆素标准品的标准曲线Fig. 2 Standard curve of swainsonine by HPLC.

M1菌株分别在ODA、PDA和CDA培养基上暗培养 14–29d,SW含量均缓慢上升至最高点(1.66μg/g、2.19μg/g、2.43μg/g),然后迅速下降,其中在ODA上下降速率最快。在ODA上间歇光照培养M1时,SW含量在14d时达到最高(2.49μg/g),然后迅速降低至 19d时的0.82μg/g再开始上升,第 29天达到次高点(1.54μg/g)(图3B)。

以马铃薯蔗糖琼脂培养基(potato sucrose agar medium,PSA)为基础培养基,活化内生真菌。分别在马铃薯葡萄糖培养基(potato dextrose agar medium,PDA)、胡萝卜葡萄糖培养基(carrot dextrose agar medium,CDA)、燕麦葡萄糖培养基(oat dextrose agar medium,ODA)接种培养内生真菌。

内生真菌中SW合成动态变化的ANOVA方差分析结果见表2。不同培养条件下,每种菌株中SW含量差异都不显著;在相同培养条件下不同菌株(基因型)的SW含量差异显著。

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图3 不同培养条件下苦马豆素含量动态变化 A: OW7.8;B: M1Fig. 3 Dynamic changes of swainsonine content in the strains OW7.8 and M1 of Alternaria oxytropis in different culture conditions. A: OW7.8; B: M1.

 

表2 内生真菌苦马豆素含量变化方差分析Table 2 Variance analysis of swinsonine content in endophytic fungus Alternaria oxytropis

  

Note: **P<0.01; *0.01<P<0.05.

 

方差来源SV平方和SS自由度df均方差MS F 显著性Sig校正模型Correction model 435.128a 2 217.564 5.308 0.012截距Intercept 1081.802 1 1081.802 26.392 0.000**菌株类型Strain type 396.763 1 396.763 9.679 0.004*培养条件Culture conditions 6.249 1 6.249 0.152 0.699误差Error 1065.753 26 40.991总计Total 3507.166 29校正的总计Total correction 1500.881 28

3 讨论

由于不同洪水量级的河道综合糙率不同,需要选取与地形匹配的不同量级洪水过程来反求河道糙率。与1997年实测河道地形相匹配的较大洪水过程出现在1995年8月,博罗站洪峰流量为6 660 m3/s,接近东江流域三库调洪工况下的5年一遇洪水(简称“95.8”洪水),该场洪水可作为“常遇洪水”的率定资料。模型率定的上边界取值为博罗、麒麟咀的流量过程,下边界取值为大盛、泗盛围相应的潮位过程,率定结果见表1。

本研究发现M1菌丝体中SW含量低于OW7.8,与 Mukherjee et al.(2012)和 Sim et al.(1997)的结果有差异,推测在A. oxytropis野生株OW7.8中,SW合成有P6C和P2C两条途径;而在突变株M1中酵母氨酸还原酶基因缺失使酵母氨酸和赖氨酸合成最初受阻,即P6C途径受阻,由于赖氨酸是真菌必需氨基酸,而酵母氨酸为赖氨酸合成的前体,可能需要从逆反应方向即在酵母氨酸氧化酶催化下,使P6C转变成酵母氨酸,再合成赖氨酸以维持真菌的生命活动,M1中SW合成就只依赖P2C途径,故M1中SW生成量低于OW7.8。

[REFERENCES]

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图书馆的本质在于文化的传承,在于以文化服务开民智,而非在于单纯的信息存储。在我国大力推进公共文化服务,努力完善文化治理体系的环境下,图书馆应该明确自身定位,以文化治理作为深化职能的导向,发挥自身在社会教育方面的优势,为未成年人提供优质的阅读资源,并与出版社、学校、社会组织等合作,建立多方协同的文化治理格局,引领全民阅读新风潮。

2016年被称为VR元年,虚拟现实(VR)/增强现实(AR)呈井喷式发展,在各个领域的运用迅速铺开,国内多家出版社也应时而动,纷纷试水,因地制宜结合资源优势,武装出版形式,进行创新性发展。VR/AR技术为数字出版的发展提供了新的思路和方式。

选取活化15d且生长良好的OW7.8与M1菌株定量接菌,用打孔器取直径5.5mm的菌饼分别置于CDA、PDA、ODA上培养,每个培养皿中加培养基10mL,每皿放1个菌饼,设置3组对照,于25℃下恒温培养。接种M1时需要添加终浓度50mg/mL的潮霉素。将上述不同培养基分为3组,分别进行光照(24h全光照培养)、间歇光照(12h光照与12h暗培养交替进行)、暗培养(24h无光照培养)。

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1.5.1 SW的提取:将干燥后的菌丝体在液氮中快速研磨成粉末,置于 10mL离心管内,再加 2%乙酸4mL和氯仿3mL,机械旋转仪80r/min室温混匀12h,于4℃、2 500r/min离心10min后抽取上清,转移到下层塞少量的玻璃纤维丝、上层加阳离子交换树脂的10mL注射器中,注射器上端加橡皮塞,水平旋转混匀20min;另外,在10mL离心管内加2%乙酸4mL,重复上述步骤,使SW充分结合到树脂上;再加5mL无菌超纯水,颠倒旋转5min,弃去溶液,重复两次;用5mL 1mmol/L氨水洗脱,分装至1.5mL离心管,用真空离心浓缩仪浓缩至粉末状备用。

Ma YQ, 1989. Flora intramongolica. Inner Mongolia People’s Publishing House, Hohhot. 330‐331 (in Chinese)

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菌株A. oxytropis OW7.8 分别在CDA、ODA和PDA培养基上暗培养时,14–29d期间SW含量均稳步上升,其中在CDA上升高较快,在CDA和PDA上培养第 29天时SW 含量最高(12.07μg/g),在ODA上SW含量在34d达最高(17.64μg/g),然后迅速下降。在CDA和PDA培养基上间歇光照培养14–29d期间,SW合成量都呈现上升趋势,在CDA和PDA上培养29d时达到最高(均为18.54μg/g),29d后下降;在ODA上培养14d时SW含量达到最高(20.35μg/g),19d 时降至最低点(4.2μg/g),后又开始上升至34d达到次高点(图3A)。

高血压多发病于我国的中老年群体,是造成冠心病、脑卒中、心功能不全等疾病的高危因素[1]。心功能是高血压患者常见的一种伴随症,死亡率十分高,处在心脏疾病的终末阶段[2]。目前该病主要治疗方式为药物治疗,药物治疗方式不仅要控制患者机体血压情况,还需降低心率,改善心功能状态,从而降低患者死亡率。本文目的在于观察比索洛尔对治疗老年高血压伴心功能不全患者的效果,现研究如下。

查询概率矩阵,可以预测出下一个可能出现的状态,得到灰色马尔科夫预测模型计算值分别为0.501、0.474 7、0.482 2、0.508 1、0.531 8、0.560 9、0.569 7、0.540 7、0.529 4。

[附中文参考文献]

综上所述,利用PiCCO技术进行精确液体管理的方式,能更合理有效地同时实现早期液体复苏和改善心脏功能的目的,获得更佳的近期治疗效果。

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1.对国际形势进行了新判断。报告指出:“世界多极化、经济全球化深入发展,文化多样化、社会信息化持续推进,科技革命孕育新突破,全球合作向多层次全方位拓展,新兴市场国家和发展中国家整体实力增强,国际力量对比朝着有利于维护世界和平方向发展,保持国际形势总体稳定具备更多有利条件。”[1]“同时,世界仍然很不安宁。国际金融危机影响深远,世界经济增长不稳定不确定因素增多,全球发展不平衡加剧,霸权主义、强权政治和新干涉主义有所上升,局部动荡频繁发生,粮食安全、能源资源安全、网络安全等全球性问题更加突出。”[1]

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白灼菜口味鲜咸微辣,白灼汁不能太多(盘子深度的 1/5),浇油要热要少,菜品要整齐美观。上汤菜口味要清鲜、汤汁乳白,原料要2/3浸入汤中,不能出现浮油现象。

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李欣,卢萍,吕桂芬,袁博
《菌物学报》 2018年第05期
《菌物学报》2018年第05期文献

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