共培养条件下绿木霉对褐环乳牛肝菌产酶的诱导效应

进入 21世纪以来，伴随着全球气候变暖，区域性温度持续升高，土地干旱和沙漠化已成为干旱和半干旱区域的主要环境问题之一（Lugo 2015），深刻影响着森林生态系统的健康（Ravi et al. 2010；Gauthier et al. 2015；Lugo 2015；Sugden et al. 2015；Trumbore et al. 2015）。作为欧洲赤松Pinus sylvestris的远东（蒙古地区）变种，樟子松P. sylvestris var.mongolica Litv.是我国东北森林的主要建群树种之一，由于其具有耐干旱、耐瘠薄的特性，樟子松适于在干旱及半干旱生态环境脆弱的地区造林，在生态环境治理方面发挥了重要作用。然而，在自然环境相对恶劣的条件下，对造林用苗的质量往往要求较高，对苗木生长环境进行人为正向干预，从根本上达到壮苗目的。有研究表明，引入菌根真菌是解决苗木定植的有效途径（丁效东等 2012）。然而，受多重环境因素的影响，单一使用菌根菌对苗木的正向调节作用往往很有限。

木霉菌 Trichoderma spp.是一类能够诱导植物产生系统抗病性的生物因子（Haman et al. 2004），能够诱导宿主植物产生一系列局部或系统防御反应，从而促进植物生长（戚益平等 2003）。绿色木霉T. viride、哈茨木霉T. harzianum等均可诱导植物获得对生物和非生物胁迫的系统抗性（Geert et al.1998；黄亚丽等 2013）。木霉菌激发生物的防卫反应是一个复杂的生理生化过程，这已在番茄、黄瓜、辣椒等作物上进行了较多的应用研究（Heather et al. 2007；Navazio et al. 2007；冯程龙等 2017；徐文等 2017），发现木霉菌可以有效诱导植物根际微生物产生中性蛋白酶、多酚氧化酶等保护酶类（陈桂梅 2009）。然而，在森林苗木上缺少相应研究。

作者所在课题组于2010年从以色列引进6株木霉菌，通过前期研究，发现绿木霉对几种森林病原菌具有显著的抑制效果（李冲伟等 2012；尹大川等 2012；杨立宾等 2013）。作者研究发现，作为樟子松高效外生菌根菌的褐环乳牛肝菌 Suillus luteus与绿木霉对樟子松苗木进行复合接种，可以显著提高樟子松苗木的抗逆性，并具有促生作用，效果均好于单一接种，说明二者具有“协同增效”作用（Yin et al. 2014），但该“协同增效”作用机制还不清楚。为此，作者开展了本项研究工作。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

菌根菌褐环乳牛肝菌S. luteus由采自辽宁省阜新市彰武县章古台樟子松人工林下的新鲜子实体分离获得，现保存于沈阳农业大学林学院森林微生物实验室（菌株编号N94）；绿木霉T. virens菌株由课题组从以色列希伯来大学农学院引进（菌株编号T43）。

1.2 褐环乳牛肝菌与绿木霉的对峙培养

用直径10mm无菌打孔器在已活化好的褐环乳牛肝菌菌株N94的菌落边缘打取菌饼，然后接种在直径90mm PDA平板上一侧，在25℃培养箱中黑暗培养。待菌落大约生长至培养皿的1/2直径时，在与菌饼相距40mm处接入直径10mm已培养5d的绿木霉菌饼。设3个重复，继续在25℃培养箱中培养。待绿木霉与褐环乳牛肝菌接触时结束培养，在光学显微镜下进行观察和照像。

1.3 褐环乳牛肝菌与绿木霉互作的扫描电镜观察

在对峙培养菌株交接处，用无菌打孔器切取直径10mm的菌饼，刮除多余的培养基，置于盖玻片上，然后将菌饼烘干，使其平铺并紧贴在盖玻片上。以单独切取褐环乳牛肝菌和绿木霉菌饼为对照，3次重复。将干燥的样品用扫描电镜（德国Sigma 500）进行菌丝形态观察。

1.4 绿木霉诱导褐环乳牛肝菌产酶

1.4.1 菌株培养及诱导物的制备：用直径5mm的无菌打孔器，切取在PDA平板上已培养20d的褐环乳牛肝菌和培养 5d的绿木霉菌饼，分别接种于盛有250mL PD液体培养基的500mL三角瓶中，每瓶接种3片菌饼，然后置于摇床上25℃、150r/min振荡培养。褐环乳牛肝菌培养15d，绿木霉培养5d，分别得到二者的液体菌剂，备用。用无菌纱布将培养好的绿木霉菌丝体滤出，经无菌水冲洗数次，将菌丝体在60℃烘箱中烘干灭活，然后将菌丝体碾成粉末，密封，4℃保存备用。

1.4.2 绿木霉的诱导接种：准确称取1g灭活木霉菌丝体，经紫外线表面消毒后，接种于前面已经培养好的褐环乳牛肝菌培养液中，置于摇床上（25℃、150r/min）振荡培养，以未接种木霉菌丝体为空白对照（CK），3次重复。每天用无菌吸管吸取褐环乳牛肝菌培养液1次，每次吸取10mL，共取样7次，每次取样均进行如下项目测定，试验周期为7d。

1.4.3 多酚氧化酶活性测定：参照Yin et al.（2014）的方法。取5mL 0.1mol/L pH 5.0的醋酸缓冲液，加入0.5mL 0.1mmol/L邻苯二酚，再加入0.5mL的培养滤液，30℃保温30min，用分光光度计于400nm处测定吸光值A400。以灭活培养菌液为对照，取1mL的滤液，煮沸 5min，然后取 0.5mL，加入 0.5mL 0.1mmol/L的邻苯二酚，加5mL 0.1mol/L pH 5.0的醋酸缓冲液，置于30℃反应30min，然后用紫外分光光度计（美国 UV-VIS）于 400nm处测定吸光值A400，3次重复。

Gauthier S, Bernier P, Kuuluvainen T, Shvidenko AZ,Schepaschenko DG, 2015. Boreal forest health and global change. Science, 349(6250): 819-822

这个灯红酒绿的城市随时都有光怪陆离的事情发生。就像前一分钟我打电话给我的男朋友秦明让他陪我去逛街他说学生会那边有事脱不开身，而后一分钟我就在一家餐馆靠窗的位置看到他正陪一位笑靥如花的女孩吃饭。我隔着玻璃窗看到他小心翼翼充满爱意地拨起那女孩洒落在脸颊的头发，彼此会心一笑。

1.4.5 漆酶活性测定：参照Yin et al.（2014）的方法。取 5mL 0.1mol/L pH 4.6的醋酸缓冲液，加入3.36mmol/L的邻联甲苯胺（用 95%的乙醇溶解）0.5mL，再加入0.5mL的培养滤液，28℃保温30min，用分光光度计于600nm处测定吸光值。以灭活菌液为对照，取0.5mL的滤液，煮沸5min，加入0.5mL 3.36mmol/L的邻联甲苯胺，加5mL 0.1mol/L pH 4.6的醋酸缓冲液，置于28℃反应30min，然后用分光光度计于600nm处测定吸光值，3次重复。酶活力以样品与底物反应30min后吸光值改变值表示。

本项调查新增植物中有一部分属于国家重点保护野生植物、福建省地方重点保护珍贵树木，据统计，属国家Ⅱ级重点保护野生植物有毛红椿、红豆树；属省级重点保护珍贵树木有青钱柳。此外，还有多花兰、黄花鹤顶兰、石仙桃、密花石豆兰、日本卷瓣兰、镰翅羊耳蒜、见血清、台湾独蒜兰、小舌唇兰、小沼兰、长轴白点兰、无叶美冠兰、广东异型兰、铁皮石槲等14种珍稀兰科植物[4]。

1.4.6 中性蛋白酶活性测定：参照Yin et al.（2014）的方法。取试管3支，每管加入1mL的培养滤液，40℃水浴预热 5min，再加入同样预热的酪蛋白1mL，保温 10min，立即向各管加入 2mL 0.5mol/L三氯乙酸终止反应，继续保温反应 20min。另取 3支试管，每管加入 1mL培养滤液，再加 0.4mol/L碳酸钠5mL，福林酚1mL，摇匀，40℃保温20min后，用分光光度计于660nm处测定吸光值，3次重复。空白试验测定方法同上，只是在加培养滤液之前加三氯乙酸，使酶失活。

2 结果与分析

2.1 褐环乳牛肝菌与绿木霉体外培养观察

2.1.1 褐环乳牛肝菌与绿木霉对峙培养观察：绿木霉在与褐环乳牛肝菌接触后，对褐环乳牛肝菌生长未见有明显影响，并未形成明显的拮抗线（图1）。绿木霉生长速度较快，在与褐环乳牛肝菌接触之后，逐渐将褐环乳牛肝菌菌落覆盖，而褐环乳牛肝菌生长也未受显著影响，依旧在绿木霉菌丝下生长，二者生长几乎互不干扰，且菌丝形态也未有明显改变。

2.1.2 褐环乳牛肝菌与绿木霉对峙培养扫描电镜观察：在扫描电镜10.0kV放大1 000×时，可以清晰地观察到绿木霉和褐环乳牛肝菌的菌丝体在培养皿中交联穿插，它们的生长相互影响并不显著（图2）。

2.2 绿木霉对褐环乳牛肝菌产酶诱导

2.2.1 多酚氧化酶活性：褐环乳牛肝菌经灭活绿木霉菌丝体诱导处理后，其培养液中多酚氧化酶活性变化显著（图3A）。经诱导接种后，培养液中多酚氧化酶活性即开始上升，在第6天上升至最高，为25.2U/mL；在第7天略有下降，且基本维持在第6天的活力水平，为 25U/mL。而在对照组中，酶活表现较为平稳，没有明显的起伏，表明该处理的多酚氧化酶活性基本没有变化。试验结果表明，灭活绿木霉菌丝体可以有效诱导褐环乳牛肝菌产生多酚氧化酶，且诱导效果比较迅速，在诱导接种后的第2天即表现出酶活性上升的现象。

综上所述，绿木霉与褐环乳牛肝菌在对峙培养条件下，褐环乳牛肝菌的生长几乎不受绿木霉的影响，液体共培养条件下，绿木霉可以有效诱导褐环乳牛肝菌产生多酚氧化酶、漆酶、几丁质酶和中性蛋白酶。本研究仅从诱导产酶角度，初步揭示了绿木霉与褐环乳牛肝菌复合接种樟子松的“协同增效”作用所产生的原因，但二者是否还存在其他作用机制，如环境因子等，还有待于进一步研究。

  

图1 褐环乳牛肝菌与绿木霉对峙培养Fig. 1 Dual culture of strains of Suillus luteus and Trichoderma virens.

  

图2 褐环乳牛肝菌与绿木霉对峙培养的扫描电镜观察 A：Trichoderma virens单独培养；B：Suillus luteus和T. virens对峙培养；C：S. luteus单独培养. a: T43孢子；b：N94菌丝Fig. 2 The SEM observation of dual culture of Suillus luteus and Trichoderma virens. A: T. virens culture; B: Dual culture of S.luteus and T. virens; C: S. luteus culture. a: Spores of T43; b: Mycelia of N94.

  

图3 绿木霉对褐环乳牛肝菌诱导产酶效应 A：多酚氧化酶；B：几丁质酶；C：漆酶；D：中性蛋白酶Fig. 3 The effects of mycelia of Trichoderma virens on enzymatic production of Suillus luteus. A: Polyphenol oxidase; B: Chitinase;C: Laccase; D: Neutral protease.

2.2.3 漆酶活性：褐环乳牛肝菌经过灭活绿木霉菌丝体诱导处理后，其培养液中漆酶活性呈明显升高（图3C）。在诱导接种后，褐环乳牛肝菌培养液中漆酶活性即开始明显上升，在试验第6天时，漆酶活性达到最高，为1 580U/mL。整个过程为明显上升趋势。到第7天时略有下降，降至1 560U/mL。而对照组漆酶活性在整个过程中趋于平缓，且表现为略有下降。测定结果表明，经绿木霉诱导后，褐环乳牛肝菌产漆酶明显增强，绿木霉可以有效起到诱导因子的作用。

2.2.4 中性蛋白酶活性：与几丁质酶活性诱导结果相似，中性蛋白酶的变化规律基本呈先上升后下降的趋势（图3D）。值得指出的是，绿木霉对褐环乳牛肝菌中性蛋白酶的诱导作用具有滞后性，在试验的第3天后，诱导组的酶活性才高于对照组，且在第6天酶活上升至最高，为269U。而在对照中呈现先略上升后下降的变化趋势。其中处理组酶活最高峰出现在第2天，为148U。测定结果表明，褐环乳牛肝菌可能自身产生中性蛋白酶，而绿木霉在一定程度上增加了其产酶量。

记者了解到，现阶段我国钾肥工业形成了科研、设计、设备制造、施工安装、生产、销售、农化服务等一套完整的工业体系，产品市场竞争力不断增强，钾肥生产技术和单套生产能力已达到国际领先水平。据中国无机盐工业协会会长王孝峰介绍，2017年我国钾肥产量达到970万吨，在盐湖锂、镁、钠、硼等资源综合利用方面取得重大突破，碳酸锂、高纯氢氧化镁、金属镁、纯碱等一批工业化项目相继建成投产，初步形成了以钾资源开发为龙头，锂、镁、钠、硼等资源梯级开发综合利用的工业体系。

3 讨论

通过绿木霉与褐环乳牛肝菌的共培养及诱导产酶研究，可以得出以下结论：1）绿木霉与褐环乳牛肝菌无明显营养生长竞争和拮抗作用；2）绿木霉可有效诱导褐环乳牛肝菌产酶，其中以多酚氧化酶和漆酶最为显著。结果表明，绿木霉对褐环乳牛肝菌生理功能表达有促进作用。

植物根际微生物的相互作用十分复杂，不同微生物之间的互作机制也不尽相同。作者在前期研究发现，采用绿木霉与褐环乳牛肝菌复合接种樟子松可以起到“协同增效”的作用，促进樟子松苗木的生长和提高其抗逆性（Yin et al. 2014）。本研究发现绿木霉和褐环乳牛肝菌在营养生长上不存在明显竞争关系，也不存在明显拮抗作用，而且在前期调查中也未发现木霉菌影响褐环乳牛肝菌对樟子松苗木根系的侵染率（Yin et al. 2014）。然而，有学者发现哈茨木霉与铆钉菇Gomphidius viscidus进行对峙培养时，存在一定程度的拮抗作用，在二者交界处的菌丝体变得致密，并产生拮抗线（陈桂梅2009）。木霉具有重寄生能力，能够分泌木聚糖酶、蛋白酶等有关细胞壁降解酶和一些挥发性代谢物（Benhamou & chet 1996；Harman 2000），但很少发现外生菌根菌的菌丝发生溶解、崩裂等现象（陈桂梅 2009）。本研究结果表明，绿木霉与褐环乳牛肝菌具有很好的兼容性，二者无拮抗线产生，只是绿木霉生长较快，其菌落覆盖了褐环乳牛肝菌菌落，但褐环乳牛肝菌生长并未受到显著影响。这与陈桂梅（2009）的研究结果略有不同。

少了接触的机会，我们自然也少了争吵，表面上看是和谐了，实际上是疏远了。我的想法是，看不惯的事，我就当没看见，家里的一切都交老伴做主，省得她一不顺心就跟我提离婚，孩子在中间跟着着急。

外生菌根菌具有产多酚氧化酶和漆酶的能力（张海涵2008）。黄艺等（2006）研究发现，用DDT胁迫处理美味牛肝菌Boletus edulis等外生菌根菌，可以显著促进其产生多酚氧化酶和漆酶，认为多酚氧化酶和漆酶的活性受外源物的诱导依赖程度较高，与本研究结果一致。陈桂梅（2009）研究发现，哈茨木霉的灭活菌丝体可以诱导外生菌根菌产生中性蛋白酶，本研究也证实了这一点，但结果却不完全一致。本研究发现，绿木霉灭活菌丝体能够诱导褐环乳牛肝菌产生中性蛋白酶，但褐环乳牛肝菌自身也可以产生一定量的蛋白酶。因此，灭活绿木霉菌丝体诱导接种后，褐环乳牛肝菌发酵液中的中性蛋白酶活性应该是诱导与其自身产生的“叠加效果”。几丁质酶是真菌中普遍存在的水解酶类，它可以催化几丁质水解成 N-乙酰葡萄糖胺。陈桂梅（2009）分别用灭活木霉菌丝体和几丁质为底物，诱导培养外生菌根真菌，结果发现，灭活木霉菌丝体对外生菌根菌几丁质酶的诱导效果要好于几丁质。张茹琴等（2011）以胶体几丁质和立枯丝核菌细胞壁为诱导物，对血红铆钉菇 Chroogomphidius viscidus、灰鹅膏菌Amanita vaginata进行几丁质酶诱导培养，结果发现，胶体几丁质不能诱导外生菌根菌产生几丁质酶。在本研究中，灭活绿木霉菌丝体对褐环乳牛肝菌几丁质酶的诱导具有“瞬时性”，在诱导培养的第2天即检测到较高的几丁质酶活性，与陈桂梅（2009）的研究结果相似。不同的是，对照组几丁质酶活性也会随着培养时间的延长而升高，但没有添加诱导物表现的迅速，且活性下降较快。

2.2.2 几丁质酶活性：对褐环乳牛肝菌几丁质酶活性的诱导结果见图3B。在试验开始时，诱导组和对照组的酶活性均有不同程度的上升，其中诱导组曲线斜率大于对照。诱导组几丁质酶活性在试验第 5天达到最大，为0.33U/g·s，随后开始缓慢下降；在试验结束时（第7天），几丁质酶活下降至0.25U/g·s。与此同时，对照组几丁质酶活性也在第5天上升至最高，为 0.35U/g·s，第 7 天下降至 0.15U/g·s。诱导组与对照组的酶活性变化趋势相同，均为先上升后下降。试验结果表明，褐环乳牛肝菌产几丁质酶受灭活绿木霉菌丝体的诱导效应不显著。产几丁质酶是褐环乳牛肝菌固有属性，在其生长到一定时期就会产生。但本研究结果显示，加入绿木霉诱导之后，几丁质酶活性的下降幅度要远低于对照，表明绿木霉的存在可以维持褐环乳牛肝菌几丁质酶的活性。

[REFERENCES]

中国在全面建设和完善社会主义市场经济的进程中，陌生人间的交往已取代熟人间的交往而成为主导性和常态化的交往模式，于是在家庭和国家之间形成了一个由陌生人构成的庞大复杂的公共交往空间。相应地，家庭和国家对个体或组织的影响力、规范力都有所削弱，这就决定了传统的以熟人共同体为背景的修齐治平的道德责任必须突破血缘和地缘的狭隘语境，经过思想内容的更新和创新才可能对以市场社会为背景的陌生人社会有规范意义。

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元青花中最原始、常见的缠枝纹，便是一种以藤蔓、卷草为基础提炼而成的传统吉祥纹饰，含有“生生不息”、“万代绵长”的美好愿望，这更证明瓷器纹饰对人类思想情感的表达是与生俱来。

Hodinkee的主编Benjamin Clymer写了一篇短文表达他的看法，他说有品牌离开巴塞尔表展并不奇怪，让他意外的是，最先退群的不是之前盛传的百年灵，却是斯沃琪集团。

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1.4.4 几丁质酶活性测定：参照Yin et al.（2014）的方法。取 0.5mL的培养滤液，加入 pH 5.5的50mmol/L冷醋酸缓冲液10mL，4℃、10 000r/min低温离心 20min，留上清。通过测定反应终产物中N-乙酰氨基葡萄糖的含量来表示样品中几丁质酶活性。反应混合物包括0.6mL的上清液和1mL 1%的胶体几丁质（用0.1mol/L pH 5.5的醋酸缓冲液配制），37℃水浴3h后，加入0.75mL二硝基水杨酸溶液，沸水浴10min终止反应，冷却，4℃、10 000r/min低温离心 5min，取上清液，用分光光度计测定各样品在540nm处的光吸收值A540，3次重复。

治疗前,2组卵泡刺激素及雌二醇水平无明显差异,无统计学意义(P>0.05)。治疗后,观察组卵泡刺激素及雌二醇水平优于对照组,对比差异有统计学意义(P<0.05)。见表2:

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对比实验组与参照组肝癌临床治疗效果情况（见表2），实验组肝癌临床治疗总有效率（81.40%）高于参照组（55.81%），两者差异明显（P＜0.05）。

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总之，工作坊教学模式以学生为主体、教师为主导，注重学生应用能力培养，契合了应用型高校大学生培养注重知识运用、实践技能、创新能力、综合素质的要求。食品科学与工程专业尤其注重学生的应用能力，工作坊教学模式在果蔬加工工艺学课程教学中的应用表明这种模式适宜在食品科学与工程专业相关课程教学中推广。

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省人医周边配套交通设施较为完善，门诊门口就有公交站台和出租车上下客点。但是这些交通配套设施的位置布局和管理还有待改善。由于医院周围有派出所、学校、公园等公共场所，导致在医院门口公交站上下车的人流更加频繁。另外，医院周边的出租车服务尚不完善，缺少内外衔接的出租车候客泊位和机动车临时上下客点，车辆只能在医院门诊门口沿街上下客，高峰期出租车违章占道停车现象严重，对医院及周边道路交通干扰很大，整体交通秩序还有待改善。

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企业价值共创体系的价值创造能力可分为基本价值创造能力和可持续价值创造能力两部分。前者对企业价值共创体系影响很大，是企业生存能力的综合体现，后者是企业价值共创体系的适应能力、协同感知能力、协同生产能力、未来竞争态势预测能力的综合体现。