刺芹侧耳栽培料及菌体中漆酶介体分子的挖掘

漆酶（laccase，EC 1.10.3.2）属于多铜氧化酶家族，广泛存在于植物、真菌和细菌中，体外实验发现它能够催化氧化苯酚和苯胺类化合物，还原空气中氧气并生成水分子。漆酶氧化还原电位大约为800mV，低于非酚型木质素的氧化还原电位（约1 300mV），因此氧化效率极低。小分子介体有效地扩展了漆酶的底物谱（Majeau et al. 2010；Singh et al. 2015），例如，2'‐联氨‐双‐3‐乙基苯并噻唑啉‐6‐磺酸[2,2'‐azino‐bis (3‐ethylbenzothiazoline‐6‐sulfonic acid)，ABTS]、紫尿酸（violuric acid，VLA）、1‐羟基苯并三氮唑（1‐hydroxybenzotriazole，HBT）和 2,2,6,6‐四 甲 基 哌 啶 ‐氮 ‐氧 化 物 [(2,2,6,6‐tetramethyl‐1‐piperidinyl) oxidanyl，TEMPO]等化学合成的介体小分子，能够介入到漆酶催化氧化反应中，起到电子载体等作用，提升漆酶的催化能力。然而，人工合成介体的环境成本高，在催化过程中易产生毒性物质，带来二次污染，在实际应用中有负面环境效应（Canas & Camarero 2010）。因此，寻找低成本、低毒性和高效的天然漆酶介体体系（laccase‐mediator system，LMS）一直是环保和生物质能源漆酶应用研究的热点之一。

肌浆蛋白的提取参考Molina I等[18]的方法：准确称取5 g肉样，加入15 mL 0.2 mol/L，pH 6.5的PBS（甲液：NaH2PO4·2 H2O 31.21 g/L；乙液：Na2HPO4·12 H2O 71.64 g/L；甲：乙=1：2）混合均匀，在冰浴条件中4000 r/min匀浆10 min后，再10000 r/min 4 ℃离心20 min，上清液即为肌浆蛋白提取液。

已知的天然介体多为酚类衍生物，如香草醛、对羟基肉桂酸、丁香醛和芥子酸等。研究表明在移除工业染料（Camarero et al. 2005）和多环芳烃化合物（Canas et al. 2007）等应用领域，天然介体与人工介体拥有同等的效率，一些与木质素相关的芳香化合物也能够提高漆酶的表达和活性（Yang et al.2013）。此外，这些天然介体酚类化合物可从植物来源的原料中获取，如豆粕提取物（Liang et al.2017）和玉米秸秆气爆水解液（Qiu et al. 2014）均表现出高效降解非酚类污染物的能力，然而一直缺乏系统地从植物和真菌中筛选天然介体的高通量方法。

死体可燃物含水率(Y)与气温(X2)、相对湿度(X3)、连旱天数(X4)、风速(X5)、蒸发量(X6)之间的数学模型为：

刺芹侧耳Pleurotus eryngii，俗称杏鲍菇，隶属担子菌门、伞菌目，因其菌肉肥厚、质地脆嫩、具有杏仁的香味和丰富的营养，已成为一种市场前景看好的珍稀美味食用菌。自上世纪 90年代末引种栽培以来，国内刺芹侧耳工厂化栽培已逐渐发展起来，与双孢蘑菇和香菇等均具有广泛的栽培（Tang et al. 2013）。刺芹侧耳能够产生多类木质素降解酶如漆酶、锰过氧化物酶和芳基乙醇氧化酶等，其分解木质纤维素能力较强，并具有选择性降解木质素的特性（Rodríguez et al. 2004；Hadibarata & Kristanti 2014；Chang & Chang 2016）。

本研究采用普通有机溶剂如甲苯、乙醇和乙酸乙酯，从刺芹侧耳的栽培料、子实体和菌丝体中提取各种天然小分子，利用快速漆酶LMS动力学实验评估各组分的介体活性。进一步通过HPLC‐MS检测和XCMS代谢物组生物信息学对比分析，鉴定出高活性组分所富集的代谢物及代谢通路，从代谢产物组学角度筛选潜在天然介体分子（图1）。

1 材料与方法

1.1 生物材料

刺芹侧耳菌株选用杏韩，由上海市农业科学院食用菌研究所所属的上海国森生物科技有限公司提供。栽培料（compost）以木屑为主，木屑40%，玉米芯32%，麸皮25%，玉米粉3%，含水量66%。用1 100mL塑料瓶装湿料，约780–850g。混合配制栽培料后，进行自动化装瓶，并将栽培料进行高压灭菌（121℃，90min），灭菌后将栽培料在无菌冷却室进行迅速冷却，对16瓶栽培料进行干燥取样。菌丝体（mycelium）样本来自自动化接种 30d后的培养瓶，对长满菌丝的栽培瓶进行后熟处理（10d），同样进行干燥取样（16瓶）。刺芹侧耳子实体（fruiting body）样本来自对菌丝体搔菌处理后，置于生育室（16℃，湿度 85%–98%）培养至菌丝扭结成原基并发育成小子实体，最后成为采收级别的子实体，切片干燥后取样（16瓶）。介体活性实验测试所用漆酶来源于白腐菌Trametes versicolor，购自 Sigma‐Aldrich公司，邻苯二酚标定酶活值为0.87U/mg。

  

图1 利用快速酶学检测和代谢物组学分析从刺芹侧耳的栽培料、子实体和菌丝体中挖掘天然介体的流程Fig. 1 Diagram of searching natural mediators from fruiting body, mycelium, and compost of Pleurotus eryngii, using fast LMS enzyme kinetics and metabolomics analyses.

1.2 萃取和柱分离

在GPS房产测绘信息系统运行过程中，图文一体化管理一直是其中比较重要功能，该功能是在GPS技术的支持下，结合互联网技术有效将房产资源的图片与文字进行结合，以图文并茂的方式更好地呈现在人们眼前，提升对房产信息的观看效果。但是，在建立图文一体化管理体系的过程中，由于房产测绘包含的信息量庞大，数据比较复杂，还存在一定的困难。因此，在GPS房产测绘信息系统中建立图文一体化管理体系，还需解决信息收集、信息分析以及信息之间的内在联系等多方面的问题。

1.3 漆酶反应动力学检测

37%浓盐酸以 3:7比例与水混溶，配置成稀盐酸。取100mg邻联甲苯胺置于0.5mL稀盐酸中，加热溶解后用15mL蒸馏水稀释，再加入49.5mL稀盐酸，混匀后用蒸馏水定容至100mL，底物终浓度为4.7mmol/L。

另取37mg的漆酶溶解于10mL的100mmol/L醋酸‐醋酸钠缓冲液（pH 4.5）中，终浓度为0.06mmol/L。酶反应动力学检测体系为 2mL，其中含 1 870μL的 100mmol/L醋酸‐醋酸钠缓冲液（pH 4.5）、20μL的4.7mmol/L甲苯胺、100μL的0.06mmol/L漆酶及10μL待测组分。在室温25℃下使用Agilent 8453紫外可见光光谱仪进行时间分辨扫描，波长范围为190–1 100nm，每0.5s记录一次光谱，扫描时长共为5min。每个实验重复2次测量。检测样本包括不同萃取液的10mL柱分离组分，吹干后用3mL乙醇复溶。对照空白实验用 10μL的乙醇，酶活测量过程同上。

1.4 HPLC-MS检测

2.3.2 香豆素合成代谢通路：该代谢通路在 05‐04和05‐06代谢组学差异对比中分别属于两类不同的香豆素合成路径，P‐value分别为0.003和0.04。在05‐04对比中，7‐羟基香豆素（7‐hydroxycoumarin）、2,4‐二羟基肉桂酸（2,4‐dihydroxycinnamate）和咖啡酸均上调30倍以上，O‐咖啡酰莽草酸（caffeoylshikimate）和滨蒿内酯（scoparone）轻微上调，阿魏酸轻微下调；在 05‐06对比分析中，香豆素（coumarin）和反式肉桂酸轻微上调。

1.5 酶动力学介体活性分析

使用非负矩阵分解（non‐negative matrix factorization，NMF）和交替最小二乘法（alternating least squares，ALS）方法解析酶反应动力学实验数据（Qi et al. 2015）（图1A）。原始紫外动力学数据矩阵 D(λ, t)分解为成分依赖的吸光度矩阵 S(λ,n)和时间依赖的浓度矩阵C(n,t)，以及残差矩阵E(λ,t)。利用邻联甲苯胺底物的285nm处最大吸收峰，以及产物在365nm、630nm和850nm的吸收峰（Pan et al.2014），通过线性拟合计算出目标产物的形成速率，并与无添加的对照组反应速率相比，获得添加物对漆酶催化氧化邻联甲苯胺的调节度（regulation degree，RD）：

 

RD值为正时，添加物对漆酶催化氧化具有介体效应，反之则为抑制效应。测量样本的添加量相对于酶活性测量体系可以忽略不计，该法经过人工介体ABTS测试后可行。

1.6 代谢产物组差异谱分析

将 LC‐MS数据上传至 XCMS网站（http://xcmsonline.scripps.edu）（Tautenhahn et al. 2012），对刺芹侧耳栽培料甲苯萃取液的 20个柱分离组分进行两两比对，即CTE01组分与CTE02组分对比，CTE02组分与CTE03组分对比，以此类推，挖掘相邻组分中代谢产物差异。代谢产物组生物信息学分析采用Welch t‐检验方法，P值、倍数阈值、荷质比容忍度分别设定为0.05、1.3、30。利用mummichog算法来富集两两对比中具有显著差异的代谢物和代谢通路，该算法将一定范围内符合代谢物特征的所有可能代谢物映射到代谢网络，寻找局部富集区域（Li et al. 2013；马鑫和赵一雷 2016）。

2 结果与分析

2.1 萃取组分优选

本研究利用 3种不同极性的有机溶剂对栽培料、菌丝体和子实体进行小分子萃取，通过对 10个柱层析组分的介体活性统计分析，表明在相同的工艺流程下栽培料甲苯萃取液中蕴含较高介体活性物质（图2）。刺芹侧耳栽培料的主要成分来自农副产品，可能在处理过程中释放出天然介体分子；再则，栽培料的工艺过程曾被优选以期刺芹侧耳养分转化率达到最高（Chang & Chang 2016），均有可能导致介体分子在栽培料中富集。其次，实验结果也表明非极性有机溶剂甲苯比极性溶剂乙酸乙酯和乙醇更加有效地提取介体成分，说明潜在天然介体小分子在化学结构上具有与芳香基相似相容的基团。

2.2 介体分子富集分离

在采集代谢组生物信息学数据时，对介体活性最高的栽培料甲苯萃取液在常压柱层析收集组分时扩充1倍（20个组分），利用相同的酶学LMS检测方法测试各组分的活性并利用 HPLC‐MS分析各组分所富集的代谢产物。图3为第2次柱分离20个组分的RD测量值，可见CTE01、02、05和07组分具有较显著的富集效应，而其他柱分离组分对漆酶活性提升不显著甚至出现抑制效应。其中 CTE05组分的介体活性比相邻的CTE04和CTE06组分分别提升了47%和36%。由于常压柱层析分离所得20个组分中相邻保留时间的组分之间化学成分有很大重叠，为下一步代谢产物组学分析挖掘天然介体分子提供了有利条件。在后续分析中，我们侧重于CTE05与CTE04、06的差异分析，以期从中挖掘出可能的介体分子。

  

图2 快速酶学检测中刺芹侧耳萃取分离组分对漆酶活性的平均调节度 RD%为正表示分离组分在漆酶催化反应起介体作用，反之则为抑制作用. CTE：栽培料甲苯萃取液；CEAE：栽培料乙酸乙酯萃取液；CEE：栽培料乙醇萃取液；MTE：菌丝体甲苯萃取液；MEAE：菌丝体乙酸乙酯萃取液；MEE：菌丝体乙醇萃取液；FTE：子实体甲苯萃取液；FEAE：子实体乙酸乙酯萃取液；FEE：子实体乙醇萃取液Fig. 2 Averaged regulation degree (RD%) measured with LMS bioassay of 10 column chromatographic components of compost, mycelium, and fruiting body of Pleurotus eryngii.Positive RD% indicated LMS mediator effect, whereas negative corresponding to inhibition effect for the laccase‐catalyzed reaction. CTE: Compost‐toluene‐extract;CEAE: Compost‐ethyl‐acetate‐extract; CEE: Compost‐ethanol‐extract; MTE: Mycelium‐toluene‐extract; MEAE: Mycelium‐ethyl‐acetate‐extract; MEE: Mycelium‐ethanol‐extract; FTE:Fruiting‐body‐toluene‐extract; FEAE: Fruiting‐body‐ethyl‐acetate‐extract; FEE: Fruiting‐body‐ethanol‐extract.

2.3 代谢组学差异分析

从HPLC‐MS实验中20个柱分离组分的保留时间与荷质比信号关系图可见，相邻组分之间的差异较小而较难分辨出高活性组分CTE05中富集何种代谢产物（图4）。然而XCMS代谢组学方法分析表明相邻组分中的上下调信号点范围在1 000–6 000个，倍数参数与差异点命中数呈现指数函数衰减。在两两对比的代谢物特征中，信号具有 3倍差异以上的占比 20%以下。由于 20种组分的 HPLC‐MS数据庞大，在后续分析中我们仅讨论介体活性最高的CTE05与相邻的CTE04和06组分的代谢组学差异谱分析。这两组差异谱具有目标活性反差最大、代谢组分最为相似的特点，有助于挖掘出天然介体分子。在05‐04和05‐06组间比较中，这些具有显著性差异的代谢物特征可以通过 mummichog算法富集到已知的代谢通路上（图5）。在05‐04的生物信息学代谢产物组学分析中，在 CTE05样本中共鉴定出 5条上调的代谢通路：软木脂单体合成、简单香豆素合成、丁香油酚或异丁香油酚合成、质体醌醇合成和由苯丙氨酸合成硫代葡萄糖苷（图6）。在05‐06组间差异的数据分析中，在CTE05样本中挖掘到4条显著上调的代谢通路：软木脂单体合成、香豆素合成、丁香油酚或异丁香油酚合成和安息香酸合成。下面对两两差异对比分析命中的 CTE05上调代谢通路及其富集的代谢产物逐一说明。

  

图3 栽培料甲苯萃取液的20个分离组分对漆酶活性的调节度Fig. 3 RD% measured with the LMS bioassay for the 20 components after column separation of the most active compost‐toluene extract (CTE).

  

图4 在HPLC-MS实验中栽培料甲苯萃取液20个柱分离组分的保留时间与荷质比的关系 CTE05为最高反应活性，呈现出与相邻的CTE04和CTE06有显著的差异Fig. 4 HPLC‐MS plot of m/z signal intensity and retention time, of 20 chromatographic components of the most reactive compost‐toluene extract. Among them, CTE05 was the most active component, which exhibited significant difference from reference of the neighboring CTE04 and CTE06.

  

图5 XCMS分析中上调和下调信号 A：CTE05对比CTE04；B：CTE05对比CTE06；红色表示在CTE05中处于上调状态，绿色则为下调Fig. 5 Up‐ and down‐ regulated signals in XCMS analysis. A: CTE05 vs 04; B: CTE05 vs 06. Red dots were the up‐regulated signals in CTE05, and green down‐regulated.

  

图6 CTE05相比于（A）CTE04和（B）CTE06所富集的代谢通路Fig. 6 Enriched metabolite pathways of CTE05 in comparison with (A) CTE04 and (B) CTE06.

2.3.1 软木脂单体合成代谢通路：软木脂单体合成代谢途径在05‐04和05‐06代谢组学差异对比中富集显著性P‐value分别为0.002和0.024。在05‐04的对比中，该代谢途径的咖啡酸代谢物（caffeic acid）在CTE05是CTE04的32.6倍，而阿魏酸（ferulic acid）却下调至 59%；在 05‐06的对比中，L‐苯丙氨酸（L‐phenylalanine）和反式肉桂酸（trans-cinnamate）均存在轻微上调，咖啡酸上调至 33.1倍，表明在CTE05中该代谢通路中大部分化合物得到富集。

采用Agilent HPLC 1290‐MS 6230高效液相色谱质谱联用仪，分析柱为 Agilent C18 column（4.6mm×150mm，5μm，Eclipae XDB‐C18，Agilent，USA）。各取1mL甲苯萃取栽培料的20个柱分离组分，12 000r/min离心3min，取10μL上清液进样。HPLC流动相为A液0.5%醋酸水溶液、B液为乙腈，梯度洗脱设置为0min 10% B，18min 40% B，22min 100% B，26min 5% B，30min 10% B。质谱仪采用正离子模式，每个样本重复3次HPLC‐MS实验。

2.3.3 丁香油酚或异丁香油酚合成代谢通路：该代谢通路在05‐04和05‐06的富集显著性P‐value分别为0.013和0.024。相对于CTE04组分，CTE05中丁香油酚（eugenol）和异丁香油酚（isoeugenol）上调至8倍；而相对于CTE06，除丁香油酚上调至7.8倍之外，发现松柏醇（coniferyl alcohol）同样上调9.5倍，表明CTE05中富含该代谢通路的产物。

传统的课堂教学重视知识的传授，重点放在教师如何教，忽视了教学是教与学的两个过程的结合。在概率统计课程教学中引入思维型课堂，其核心是在教学的四个环节中设计不同层次、不同目的的问题，层层推进。在师生平等的交流对话中完成学生对知识的自主构建，在知识的学习中培养数学思维与方法，并将之运用在实际问题的解决中，最终实现培养学生数学思维能力与应用创新能力的目标。

2.3.4 质体醌醇合成代谢通路：该代谢通路仅在05‐04对比分析中发现有显著富集，P‐value 为 0.007。该代谢通路产物 2,5‐二羟苯乙酸（homogentisate）在 CTE05中上调至 2.3倍，而 4‐羟苯丙酮酸（4‐hydroxyphenylpyruvate）上调至32倍。

2.3.5 安息香酸合成代谢通路：该代谢通路仅在05‐06对比分析中发现富集现象，P‐value为0.035。该 代谢通路 中 3‐羟基‐3‐苯 丙酸（3‐hydroxy‐3‐phenylpropionic acid）上调至1.6倍，L‐苯丙氨酸和反式肉桂酸存在轻微上调。

北平不是一个工业城市。城市居民主要包括军人、来自各省的学生、公务员、提供城市生活所需物资的商人、在屈指可数家庭作坊中制作地毯和景泰蓝的工人。由于许多人经济状况不佳，而且缺乏有组织的社会机构，毫无疑问，我们只能选择那些有望取得良好的医学—社会性预后的人，那些有望通过对当下天灾人祸和突发事件的帮助而有机会再次成为独立社会个体的人，或者是那些现有机构可以安置的人。

2.3.6 硫代葡萄糖苷合成代谢通路：该代谢通路仅在 05‐04对比分析中发现有显著性差异，P‐value为 0.013。其代谢产物 N‐羟基‐2‐硫代苯乙酰胺（phenylacetothiohydroximate）在CTE05中出现轻微上调，而其谷胱苷肽复合物（phenylacetohydroximoyl‐glutathione）下调至原来的6%。

2.4 代谢小分子天然介体

通过快速 LMS酶动力学检测和生物信息学代谢组学差异谱分析方法从 CTE05中捕获到上述 11种潜在的代谢小分子天然介体：其中4种已有文献验证为漆酶介体分子，分别为咖啡酸、阿魏酸、松柏醇和7‐羟基香豆素；其余7种尚待实验验证，分别是2,4‐二羟基肉桂酸、丁香油酚、异丁香油酚、5‐O‐咖啡酰莽草酸、2,5‐二羟苯乙酸、4‐羟苯丙酮酸和 N‐羟基‐2‐硫代苯乙酰胺（图7）。

收到短信的彭伟民将信将疑，没给妻子任何回复，而是直接打了个电话给欧阳锋。彭伟民在电话中说你应该清楚我是谁，昨晚发生的事情你必须尽快给个交待。

  

图7 CTE05中所富集的潜在介体小分子Fig. 7 Captured metabolites enriched in CTE05 component as a potential natural mediator molecules.

上述代谢产物在高介体活性的CTE05中被显著富集，目前尚不清楚这些小分子在漆酶催化氧化中是以单分子模式起介体效应还是多分子模式介入到漆酶催化中。另外，代谢产物组学分析发现这些代谢产物在生物合成代谢通路有相互交叉互通的现象，说明该类化合物在代谢中可能扮演多种角色（图6）。

其中，Ft,t+n是在t+n到期的期货合约在时期t的价格，st,t+n为时期t+n的现货价格，Φt是时期t的信息集，Et为时期t的信息集下的条件期望。上式意味着：在给定的t时信息集下，t+n到期的期货合约在t时的价格是t+n时现货价格st,t+n的无偏估计。随着时间的推移，新信息不断累积并增加到已有的信息集合中。T时期的信息集于是包含所有随后的信息集，就是说对于所有的时期t，当τ≥0时，有Φt+τ ≥Φt，考虑两个不同时期但到期日相同的期货价格Ft,T和Ft+τ,,T(T代表到期日)，如果市场是有效的，则有：

11个潜在介体小分子均为单苯环化合物，10个含有苯酚结构，另外一个含有类似的肟官能团，具有漆酶分子的底物共性（齐艳兵等 2014）。而且其中6种化合物含羧酸基团，可能暗示了羧酸基在漆酶介体体系中有一定的作用。

图7中本研究所富集到的酚类木质素低聚物，则有可能是真菌降解木质纤维素的各种次级代谢产物。3‐羟基‐2‐氨基苯甲酸（3‐hydroxyanthranilic acid）是首个从真菌代谢产物中发现的天然介体（Eggert et al. 1996），而后在真菌降解木质素的代谢物中又发现一系列天然酚类介体，大多为木质素单体衍生物。

取干燥栽培料、菌丝体和子实体各 150g机械粉碎成粉末状，分别加入到150mL甲苯、乙醇和乙酸乙酯中，浸泡14d后过滤获得萃取液。以石油醚:丙酮:乙酸=7:3:0.05的混合溶剂作为流动相进行常压柱层析分离。用流动相浸泡硅胶、超声脱气后，重力沉降法装柱（40mm×30mm）。第一次 LMS检测前，9种萃取液通过5 000r/min离心后，取2mL上清液，上柱，以流动相洗脱，洗脱流速为2mL/min，分批接收柱分离组分，共收集 10批次，每批次10mL。第二次LMS和HPLC‐MS检测前，对最有介体活性的栽培料甲苯萃取液同法上柱洗脱，收集20批次（每批次10mL）‐在柱分离实验操作系统误差内确保第二次柱分离组分能覆盖第一次柱分离的全部组分。

本研究首次通过代谢组学方法捕捉到非酚类的天然肟化合物介体分子，N‐羟基‐2‐硫代苯乙酰胺。虽然在CTE05中它的富集程度很低，但由于在人工合成的介体分子研究中发现肟化合物在电子传递中具有特殊的作用，这类化合物在漆酶的催化氧化条件下能够生成具有高反应活性和长寿命的氮氧自由基（R2N‐O˙），很可能在真菌的木质素降解代谢中起到类似人工介体 TEMPO的活性氧和活性氮自由基的生物作用（Canas & Camarero 2010）。

3 讨论

本研究通过代谢产物组学分析发现天然介体所处的多个代谢通路与木质素代谢通路相关，这种高通量介体分子筛选方法在漆酶降解环境污染物中有重要的应用潜力。例如，在软木脂合成通路中代谢物如咖啡酸和阿魏酸都已经被证明与木质素降解相关（Colberg & Young 1985；De la Cruz et al.2014），其中咖啡酸能够显著提升漆酶催化氧化非酚型底物藜芦醇的能力（Gonzalez et al. 2009），而阿魏酸能够显著提升漆酶催化氧化藜芦醇（Gonzalez et al. 2009）和苯并芘（Camarero et al.2008）。在香豆素合成代谢中，7‐羟基香豆素在多篇专利中被用于漆酶催化体系的添加剂（Schneider &Deussen 2002；Howard et al. 2006），2,4‐二羟基肉桂酸与咖啡酸结构类似，仅官能团位置不同。丁香油酚合成代谢通路中所鉴定的丁香油酚和异丁香油酚在真菌降解木质素的代谢产物中也被发现（Martinez et al. 2005）。松柏醇则是组成木质素结构的单体之一，实验发现松柏醇的加入，有助于漆酶降解污水中多类氯酚（Cho et al. 1999）。硫代葡萄糖苷合成途径能够产生多种独特的具有肟官能团化合物（＞NOH，oxime）。目前高效的人工介体分子，如1‐羟基苯并三唑、紫脲酸等均含有＞N‐OH活性官能团（Canas & Camarero 2010）。

综上所述，本研究通过代谢产物萃取分离经典实验技术，利用邻联甲苯胺氧化显色反应快速检验筛选介体组分，进一步结合现代组学差异分析的生物信息学技术，把高活性组分CTE05中富含代谢化合物的 LCMS信号投影到代谢通路上，通过mummichog算法有效地提高了代谢产物组学差异谱分析的信噪比，成功从中捕获到 11种代谢小分子天然介体。这些介体分子的物理化学共性为：分子量＜300、分子结构含有一个苯环且含有酚羟基或肟基。需要指出的是，由于萃取和常压柱层析分离过程的保留时间重复性较差，在一定程度上限制了高活性介体分子的进一步富集分离、化学表征及验证。

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二是巩固和完善农村基本经营制度，走共同富裕之路。这就需要适应新形势，处理好生产力和生产关系，经济基础和上层建筑之间的关系。落实第二轮土地承包到期后再延长30年的政策与完善农村承包地“三权分置”制度，为农地承包者和生产经营者稳定预期。对“三块地”改革试点经验进行系统总结，为城乡融合发展破除壁垒。坚持发展壮大农村集体经济，全面开展农村集体资产清产核资、集体成员身份确认，在条件适宜的乡村推动“资源变资产、资金变股金、农民变股东”的集体经营性资产股份合作制改革，探索农村集体经济新的实现形式和运行机制。

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三是统筹整合监督资源，加大监督检查力度。广西计划2018年开展两次扶贫资金专项督查活动。区直各成员单位应积极选派业务骨干参加实地督查，提高督查质量。各市专责小组要根据自治区的部署，自行组织督查组对自治区未抽查到的县(市、区)开展检查，实现检查范围的全覆盖。

Tang LH, Jian HH, Song CY, Bao DP, Shang XD, Wu DQ, Tan Q,Zhang XH, 2013. Transcriptome analysis of candidate genes and signaling pathways associated with light‐induced brown film formation in Lentinula edodes.Applied Microbiology and Biotechnology, 97(11):4977‐4989

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综上所述，首都医科大学附属北京友谊医院麻醉科在住院医师气道管理培训中探索性引进了“CBL”的教学方法，同时在我们进行的国家级气道培训项目和地区级手拉手培训项目中均已实施多年，取得了良好的教学效果。充分调动麻醉住院医师学习的积极性，通过培训可以迅速掌握具体临床实践思路和技术，切实地提高了气道管理的知识和技能。

Yang Y, Wei FX, Zhuo R, Fan FF, Liu HH, Zhang C, Ma L, Jiang ML, Zhang XY, 2013. Enhancing the laccase production and laccase gene expression in the white‐rot fungus Trametes velutina 5930 with great potential for biotechnological applications by different metal ions and aromatic compounds. PLoS One, 8(11): e79307

杜一朵删除了短信。她和大林的婚姻迫于无奈。她结束了前一段轰轰烈烈的感情，带着肚子里的孩子同意了大林的求婚。大林并不知情。7个月后，孩子出生，陈大林下了夜班赶往医院。孩子早产。她这样告诉大林。大林要的是母女平安。大林幸福地做了父亲。大林尽心于屋檐下的三口之家。她看出大林内心的苦。大林那方面有问题，很难真正地打成一次牌。每次真的就是游戏一次，大林也很尽责，除了最后一步外，卖力地扮演着丈夫的所有劳动姿态。他甚至给予杜一朵最大的自由。杜一朵可以不做家务，杜一朵可以彻夜外出打牌。杜一朵的生活可以无拘无束。

[附中文参考文献]

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清热解表。用于风热感冒，症见发热重、恶寒轻、汗出而热不解、头痛鼻塞、咳嗽、口渴咽红。本品口感微甜，服用方便，小儿易于接受，是适合于儿童服用的感冒良药。

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