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RNAi法分析香菇邻氨基苯甲酸合酶基因功能

更新时间:2009-03-28

高温胁迫不仅影响菌丝生长及其抗杂能力,而且影响食用菌子实体产量及品质(曹现涛等2015;张美敬等 2015)。香菇 Lentinula edodes是我国主要的人工栽培食用菌之一,近年来我国香菇主产区多次爆发因“高温烧菌”引起的菌棒腐烂现象。

邻氨基苯甲酸合酶基因(trpE)位于分支酸至色氨酸的代谢途径中,是色氨酸等下游代谢产物合成过程中的关键调控酶,主要催化分支酸生成邻氨基苯甲酸(Ishimoto et al. 2010;钱旭等 2015)。在色氨酸进一步合成吲哚-3-乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)的途径中,涉及色氨酸转氨酶(Tam-1)和 3-吲哚丙酮酸单加氧酶(YUCCA)两个关键酶(Luo et al. 2016)。邻氨基苯甲酸合酶(TrpE)对嗜热细菌在高温环境下的生存能力起到十分重要的稳定作用(Mackenzie et al. 2016),在嗜热栖热菌Thermus thermosphilus中发现,邻氨基苯甲酸合酶在高温环境中能保持稳定的活性,是通过TrpE和TrpG形成二聚体来实现其功能,使其自身能在高温环境中正常生长(Sato et al. 1988)。在植物及酵母菌的研究中,人们发现trpE 基因及其代谢物变化与生物逆境耐受相关(Shu et al. 2010;Stanley et al. 2010;Liu et al. 2012;Jarolim et al. 2013);前人研究表明,水稻在 42℃下处理1h,IAA的含量显著升高(Du et al. 2013);此外,IAA还能缓解热胁迫对芥菜和大豆肉茎的危害(Oberholster et al.1991;Chhabra et al. 2009)。

本实验室前期研究发现,香菇菌株S606在热胁迫条件下,LeTrpE蛋白表达水平出现大幅度上调。本文采用RNAi(RNA interference)介导的基因表达干扰技术研究香菇邻氨基苯甲酸合酶基因是否与其耐热性相关,为揭示香菇耐热性的分子机制奠定基础。

信息时代下,我国税收信息体系并不完善,信息手段严重滞后,信息共享还需进一步调整,严重影响了监督机制的落实。首先征收单位、财政部门间缺乏有效沟通,对地方收支情况难以及时把控。其次财政体系未设立核算网络,资金预算、支出反映不真实与及时。最后缺乏技术支持,监督工作强度大,资金活动需人工反复检查,工作效率显著降低。如美国会将1.15亿纳税人的纳税资料,按照税务登记号,储存在计算机系统,以便于审计检查与监督管理。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株:香菇栽培菌株S606和W1-26及载体质粒 pCAMBIA1300-g均由本实验室保藏;大肠杆菌菌株DH5α感受态细胞及农杆菌菌株AGL-1分别购自 TRAN公司和上海唯地生物技术有限公司。

队员们告诉记者,练腰鼓真有点上瘾。之前就听说腰鼓是一种独特的舞蹈艺术形式,集舞蹈和体育于一身,具有2000年以上的历史。老师说,腰鼓看上去节奏欢快,其实掌握起来难度较大。初学的时候,由于跟不上节奏,发力不对,队员们的胳膊和腿都肿了,真有点想退缩,但是老师说这都是正常的,大家都没有被困难吓倒,练习得更加踊跃了。

1.1.2 培养基及试剂:常规培养基配方参考Li et al.(2017)的报道,栎木屑固体培养基(栎木屑78%、麸皮 20%、生石灰 2%,干料:湿料=1:9;琼脂 20g/L),Phanta Super-Fidelity DNA Polymerase、ClonExpress Multis One Step Cloning Kit、HiScript II One Step RT-PCR Kit和AceQTM Qpcr SYBR Green Master Mix购自Vazyme公司,San Prep柱式DNA回收试剂盒购自Sango公司,RNAiso Plus购自TaKaRa公司,pClone007 Blunt Simple Vector Kit购自TsingKe公司。

1.2 LetrpE基因克隆及蛋白结构分析

将转化子接种于 MYG抗性平板(含 6μg/mL潮霉素),25℃恒温培养,采用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取高纯度DNA,用HindIII限制性内切酶对DNA进行酶切,以hpt557-F和hpt557-R为引物扩增hyg基因片段作为探针标记,通过酶切产物和探针的杂交结果,判断外源基因片段在香菇基因组中拷贝数(Fan et al. 2014)。

1.3 LetrpE基因沉默载体构建

参考灵芝RNAi方法构建双向启动子载体(Mu et al. 2012),以菌株S606的cDNA为模板,对LetrpE基因antisense片段进行扩增;以菌株W1的DNA为模板,对Legpd、Leactin片段进行扩增。用KpnI和EcoRI限制性内切酶对质粒pCAMBIA1300-g进行双酶切,回收扩增片段和酶切大片段,通过同源重组构建LetrpE基因沉默载体pCAMBIA1300-g-trpE。

1.4 菌丝体转化及转化子筛选

借助根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的香菇遗传转化体系进行香菇菌丝的转化(喻晶晶2012;Yin et al. 2015),并在MYG抗性平板(含6μg/mL潮霉素)上对转化子进行筛选;利用微波法(Dörnte & Kües 2013)提取总 DNA,PCR 扩增Legpd和潮霉素基因大片段(YZgpd-F和YZhyg-R),鉴定阳性转化子。

还有些在外国是地方病常见病,国人通过旅游或商业交往将该病带回国内,就给诊断带来困难。因此,详细地询问旅行史、饮食史、居住史对于诊断和鉴别诊断也非常重要。

1.5 Southern杂交分析

基于本实验室香菇单核体基因组数据库(Chen et al. 2016),以香菇菌株W1-26 LetrpE的coding sequence(CDS)序列为模板设计引物LetrpE-F和LetrpE-R,以S606的DNA和cDNA为模板,对S606的 LetrpE基因进行克隆分析。利用在线软件ExPASy(http://web.expasy.org)对目的蛋白等电点及分子量进行预测,利用在线软件phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)对目的蛋白的二级和三级结构进行预测(戚元成等2017)。

考虑到ε≈vt/cp,cp为岩石介质中的纵波速度,依据流体弹塑性内摩擦侵彻理论,可以得到不同的岩石粒子速度下,岩石介质侵彻的阻抗函数[3,11]为

1.6 荧光定量PCR检测相关基因表达量

本研究的目的旨在利用 RNA干扰技术研究邻氨基苯甲酸合酶在耐高温反应中的作用,为今后利用香菇相关耐热基因资源,选育耐高温品种奠定基础。本研究发现,香菇菌丝受到热胁迫后,野生型菌株能够恢复生长,而LetrpE基因的两个RNAi转化子不能恢复生长,表明 LetrpE对香菇耐热能力具有一定的调控作用。

1.7 转化子菌丝形态观察及耐热性测定

将转化子接种于栎木屑培养基平板培养(25℃),观察菌落形态及菌丝形态(100×显微镜,OLYMPUS,BX51),采用十字交叉法测量菌落生长速度,SPASS软件进行单因素方差分析(α=0.05)。将转化子接种于栎木屑培养基平板,25℃培养5d,40℃热激24h,再置于25℃下培养5d、10d和15d,连续观察菌丝能否恢复生长。

2 结果与分析

2.1 LetrpE基因克隆及蛋白结构分析

比较采用DNA和cDNA克隆的LetrpE基因序列,发现该基因有 4个外显子和3个内含子(图1A)。将 LetrpE基因蛋白序列 mapping至 NCBI Conserved Domian Search,分析LeTrpE蛋白的结构组成(图1B),发现LeTrpE蛋白包含424个氨基酸,属于 Chorismate_bind super family(54–409 AA),其中54–133为LeTrpE结构保守域。二级结构和三级结构预测结果显示,该蛋白以α-螺旋(11个)和β-转角(17个)为主;Interpro蛋白功能预测LeTrpE分子量是47.00kDa,等电点为6.37,参与细胞内色氨酸代谢过程。

2.2 基因沉默载体构建

以 pCAMBIA1300-g质粒为载体骨架,通过同源重组连接启动子 Legpd、Leactin及 LetrpE基因antisense片段,利用同源重组法连接片段与线性化载体(图2A),转化E. coli,通过菌落PCR发现,所有挑选的菌落都有1条1.1kb带(图2B),并且XhoI单酶切质粒有7.6kb、2.3kb和1.3kb的3条带(图2C),进一步表明构建的载体是正确的。

2.3 菌丝转化及转化子筛选

在 MYG抗性平板(含 6μg/mL潮霉素)上经过5次筛选,得到11个较为稳定的抗性转化子,微波法提取菌丝总DNA。以gpd-F和hyg-R为引物对其进行特异性扩增(图3),PCR产物经凝胶电泳后检测,得到1 230bp的条带,因此初步判断这些转化子为阳性转化子。

多增氧:溶氧决定产量,多开增氧机增氧,曝气、调水的效果好。使用罗茨风机加纳米管或纳米盘增氧,功率可达10瓦/立方水体,产量也可达10斤/立方水体。

  

图1 LetrpE基因及蛋白结构分析 A:LetrpE的内含子和外显子分布;B:LeTrpE的功能域Fig. 1 Gene and protein structure analysis of LetrpE. A: Intron and extron distribution of LetrpE; B: Functional motif of LeTrpE.

  

图2 重组质粒pCAMBIA1300-g-trpE载体图谱及验证 A:重组质粒pCAMBIA1300-g-trpE载体图谱. B:1–12:大肠杆菌菌落PCR鉴定;M:1kb DNA Ladder. C:重组质粒pCAMBIA1300-g-trpE酶切鉴定结果;M:1kb DNA LadderFig. 2 Vector map of recombinant plasmid pCAMBIA1300-g-trpE and vertification. A: Vector map of recombinant plasmid pCAMBIA1300-g-trpE. B: 1–12: PCR identification of single colony; M: 1kb DNA Ladder. C: Enzyme digestion analysis of recombinant plasmid; M: 1kb DNA Ladder.

  

图3 LetrpE基因沉默转化子PCR鉴定 1:野生型S606;2–12:转化子S606-trpE-i-8、10、14、19、24、29、33、37、41、43、53;13:pCAMBIA1300-g-trpE;M:BM2000 markerFig. 3 PCR identification of LetrpE silencing transformants. 1: Wild type S606; 2–12: Transformants trpE-i-8, 10, 14, 19, 24, 29, 33,37, 41, 43, 53; 13: pCAMBIA1300-g-trpE; M: BM2000 marker.

2.4 Southern杂交

以hpt557-F和hpt557-R为引物扩增的hyg基因片段作为探针标记,用 HindIII酶切后的转化子基因组DNA为模板进行Southern杂交,结果显示探针与S606菌株酶切产物杂交无条带,而在受测的37号和53号转化子中均出现了1个条带(图4),表明外源插入性 LetrpE基因片段在转化子中以单拷贝形式存在。

  

图4 LetrpE基因沉默转化子Southern杂交结果Fig. 4 Southern blot analysis of LetrpE silencing transformants.

2.5 LetrpE基因qRT-PCR分析

对获得的11个转化子分别提取总RNA,反转录为cDNA,采用荧光定量PCR技术检测LetrpE基因在S606野生型菌株及转化子中的表达情况(图5)。结果显示,其中37号和53号RNAi转化子中LetrpE基因的表达量较野生型菌株下调至 29.327%和42.779%,表明LetrpE基因表达在这2个转化子中已成功受到干扰。

2.6 色氨酸与 IAA合成途径中其他酶基因的表达水平

Mackenzie RJ, Lawless C, Holman SW, Lanthaler K, Beynon RJ,Grant CM, Hubbard SJ, 2016. Eyers absolute protein quantification of the yeast chaperome under conditions of heat shock. Proteomics, 16(15-16): 2128-2140

  

图5 LetrpE基因沉默转化子荧光定量PCR分析Fig. 5 qPCR analysis of silencing LetrpE transformants.

2.7 转化子菌丝生长速度测定及形态观察

在栎木屑培养基平板上,对11个LetrpE基因沉默转化子的菌丝生长速度进行测量并记录,用SPASS软件进行数据处理,数据采用单因素方差分析,α=0.05,菌丝形态观察结果,转化子trpE-i-37和trpE-i-53菌株和野生型S606的菌丝形态没有显著的差异(图7A–C),在木屑培养基上的菌落形态是一致的(图7D–F);在MYG和木屑培养基上,野生菌株和转化子长速没有表现出显著的差异(图7G)。

2.8 转化子热激后的恢复生长情况

Qi YC, Liu YD, Sun XK, Zhang MK, Zhang Q, Wen Q, Qiu LY,Shen JW, 2017. Cloning and expression analysis of Pleurotus ostreatus aldehyde dehydrogenase gene PoALDH1 under abiotic stresses. Mycosystema, 36(8):1121-1131 (in Chinese)

可是接下来的一幕把所有人都吓傻了,周暄一拳头挥过去把那人打倒在地,又冲上去补了两拳,对方不甘心,跟周暄厮打,饭局一片混乱,一群人费了好大劲儿才把他俩拉开。

  

图6 色氨酸及IAA合成途径中相关基因表达量的qRT-PCR分析 A:25℃;B:40℃Fig. 6 qPCR analysis of genes related to IAA biosynthesis in LetrpE silencing transformants. Expression levels of LetrpB, LeTam-1,LeYUCCA in 25°C (A) and 40°C (B).

  

图7 LetrpE沉默转化子菌丝形态、菌落形态和生长速度Fig. 7 Mycelial and morphology characteristics and mycelial growth rate of LetrpE silence transformants.

3 讨论

以S606为对照菌株,采用实时荧光定量PCR技术检测 LetrpE基因的相对表达量,以及色氨酸与 IAA合成途径中 LetrpB、LeTam-1、LeYUCCA基因的相对表达量。对照组及处理组 25℃恒温培养至满皿,40℃热激 24h,取样。样品总 RNA提取采用 RANiso Plus(TaKaRa,DaLian,China)法,cDNA的合成采用 HiScript II One Step RT-PCR Kit(Vazyme,Nanjing,China)试剂盒,实时荧光定量PCR采用AceQTM Qpcr SYBR Green Master Mix在Bio-Rad CFX Connect Real-Time System上进行。退火温度为60℃,循环数为40。

  

图8 40℃处理前后香菇供试菌株菌丝生长情况 A:野生型S606(40℃);B:转化子trpE-i-37(40℃);C:转化子trpE-i-53(40℃);D:野生型 S606(25℃);E:转化子 trpE-i-37(25℃);F:转化子trpE-i-53(25℃)Fig. 8 Growth conditions of Lentinula edodes mycelia before and after 40°C heat stress. A: Wild type of S606 (40°C); B:Transformant trpE-RNAi-37 (40°C); C: Transformant trpE-RNAi-53 (40°C); D: Wild type of S606 (25°C); E:Transformant trpE-RNAi-37 (25°C); F: Transformant trpE-RNAi-53 (25°C).

本实验室前期对 IAA合成途径中相关基因分析发现,野生型菌株S606 LeTam-1热激后表达量上调,而在RNAi转化子中该基因表达量下调。此外,外源添加IAA能提高热敏感菌株Y3357的耐热能力调控香菇菌丝的耐高温能力(未发表)。在植物中TrpE是依赖色氨酸合成IAA代谢途径中的限速酶(Stepanova et al. 2005)。对巴西固氮螺菌Azospirillum brasilense trpE基因进行插入突变表明,转座子插入后菌株生长素(IAA)含量均表现出下降,而在培养基中补充邻氨基苯甲酸可以恢复IAA的表达水平(Xie & Chen 2006)。因此,推测香菇LetrpE沉默转化子可能通过降低IAA含量来调控香菇菌丝对热胁迫的响应,但尚需进一步研究证实。

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之所以你去药店,柜员都给你推荐贵的维生素C,一是因为越贵的药他们提成越高,两块钱的维生素C片能有什么提成?当然不想跟你推荐了。另外一个原因是维生素C大量服用会中毒,由于药用维生素C浓度高,一片浓缩了100mg维生素C,所以柜员可能觉得直接吃这个不安全。但是一般来说,只有一次性服用超过5g维生素C,也就是5000mg,也就是50片那种药用维生素C片才会中毒,谁没事吃这么多维生素C片?

Chen LF, Gong YH, Cai YL, Liu W, Zhou Y, Xiao Y, Xu ZY, Liu Y,Lei XY, Wang GZ, Guo MP, Ma XL, Bian YB, 2016. Genome sequence of the edible cultivated mushroom Lentinula edodes (shiitake) reveals insights into lignocellulose degradation. PLoS One, 11(8): e0160336

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材料科学知识点涵盖面广,包括物理、化学、力学和热力学等多个方面,教学过程中应该以工程材料的结构—工艺—性能—应用贯彻教学过程;对必要的知识点,如主要力学性能、常见晶体结构和钢铁的各种转变等需要学生强化记忆。运用启发式、案例式、参与式和讨论式等多种教学方法,使学生在课堂上就能够充分掌握知识,达到对融会贯通的目标。同时注意教学内容的前沿性,应在讲述每类材料时都向学生介绍该类材料的发展、涉及的新技术、新工艺,以适应新时期科技发展对人才培养的要求。

Li C, Gong W, Zhang L, Yang Z, Nong W, Bian Y, Kwan HS,Cheung MK, Xiao Y, 2017. Association mapping reveals genetic loci associated with important agronomic traits in Lentinula edodes, shiitake mushroom. Frontiers in Microbiology, 8: 237

(3)突出重点、突破难点。高中开设的科目多,为帮助学生理解知识点,每一单元都设置了很多内容,但并不要求全面掌握,抓住重点,也才抓住了精华。

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对37号和53号转化子分别提取总RNA,以反转录后的cDNA为模板,采用荧光定量PCR技术,分别检测25℃和40℃时LetrpB、LeTam-1、LeYUCCA基因在野生型菌株 S606以及转化子中的表达情况。结果显示,与野生菌株S606相比较,25℃时在RNAi转化子中LetrpB、LeTam-1、LeYUCCA基因表达没有明显变化(图6A);但40℃热激处理后,trpE-i-53的LeTam-1和LeYUCCA基因表达量约下调至野生型的50%,trpE-i-37的LeTam-1和LeYUCCA基因有下调的趋势(图6B)。

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将野生型及转化子菌丝 25℃培养 5d(图8D–F),40℃热处理24h后,再置于25℃培养,发现野生型菌株 S606能够恢复生长(图8A),而 2个 RNAi转化子在培养 15d后依然不能恢复生长(图8B,8C)。

虽然也有一些县保留了乡镇水利站,但这些水利站中仍有36.69%实行的是“以块为主,条块结合”的管理模式,水利站的人财物由乡镇政府直接管理,县水利局只是负责对水利员进行业务指导。这种管理体制导致县水利局无法根据工作需要统一调整配备人员,有的乡镇还将水利员调作他用或安排业务知识欠缺的人员从事水利管理,造成了水利站管理职责不明和人员管理上的失控,水利站的水利管理作用难以发挥。

加强特色优势企业与旅游业的交融发展,大力实施“旅游+”工程,将藏药、民族服饰、清真食品等送入景区,提升青海旅游的文化内涵,充分发挥旅游业对特色产业的拉动作用。

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随着现代社会和经济的快速发展,电能资源作为一种重要能源愈来愈受到人们的重视和依赖,它逐渐成为了人们生产生活中不可或缺的一部分,社会的发展对电力能源的需求不断提升,输变电工程项目也由此迎来了难得的发展时机。然而从另一方面来讲,输变电工程建设的成本也越来越高,随着全球经济的一体化,我国也不得不卷入市场经济的洪流中,输变电工程造价出现了极大的波动,不同时期和不同地区差异性较大。且可以利用的非可再生能源逐渐消耗,在加强人们环保意识的觉醒,基于绿色环保角度考虑,新的发电方式对输变电工程建设提出了更高的要求,这使得输变电工程发展难度加大,其整体造价上升也是一种必然的趋势。

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1.2.1 空间变量及其获取 利用CA进行城市土地利用变化模拟时,需要获取的数据有一系列空间距离、周围元胞的城市化元胞数量、元胞自身的属性等,这些因素决定了元胞状态的变化(例如非城市用地转为城市用地).经过分析,选取表2中所示的参数.其中,选取的空间距离变量包括离城镇点的距离X1、离公路的距离X2、离街道的距离X3.这些距离的获取是通过在ARCGIS中创建点、线的矢量图层,并计算其Straight Line得到.局部变量是邻域城市化元胞数X4,通过focal()函数获取.当然,参数中还包括元胞自身的土地利用类型X5.

张美敬,刘秀明,邹亚杰,黄晨阳,刘斌,张金霞,2015.侧耳属食用菌高温胁迫条件优化研究. 菌物学报,34(4): 662-669

 
马超君,王刚正,周莎莎,罗义,龚钰华,边银丙
《菌物学报》 2018年第05期
《菌物学报》2018年第05期文献

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