氧化还原酶介导生物级联催化研究进展

随着可持续发展战略的逐步实施，绿色化学理念日益受到重视，如何简化合成路线，实现药物的绿色合成，成为合成化学领域探索的热门课题。级联反应也称为串联反应，即在催化剂和反应试剂的共同作用下，在不分离中间产物的条件下，完成目标化合物合成的反应[1]。级联反应可以有效避免中间产物的分离与纯化过程，简化反应步骤，还可直接用于原位反应，有利于提高反应效率。级联反应已成为有机合成领域备受关注的研究方向之一[2-4]。

催化反应中常用的催化剂有金属催化剂，有机小分子催化剂和生物酶催化剂等[5]。生物酶催化剂因具有选择性高、反应条件温和、反应效率高等优点而发展迅速[6]。近年来，多种酶共同参与的催化反应为药物合成提供了更为高效的合成方法[7]。生物酶催化剂可通过发酵培养获得，其再生性、循环性和生物相容性较好。不同酶催化的反应可以实现串联，建立酶-酶共催化反应体系[8-9]。然而，在同一体系中同时兼顾多种生物催化剂的催化活性和选择性并非易事。因此，寻找和建立多酶催化体系成为生物级联反应的重要研究内容。

 

Scheme 1

  

Scheme 2

目前，已有多种生物酶参与了构建生物级联催化体系，用于药物及中间体的“一锅法”合成。氧化还原酶的种类繁多，催化的反应类型丰富，底物适应性好，为构建生物级联催化体系提供了诸多选择。然而，氧化还原酶往往需要辅酶参与反应，催化机理相对复杂，其在级联催化反应中的应用受到了一定限制。本文以细胞色素P450单加氧酶和羰基还原酶(KERD)为例，综述了两者参与的级联催化反应及其在合成手性胺和手性醇等化合物中的应用，并对发展氧化还原酶级联催化反应面临的辅酶循环、限速步骤和化合物抑制等问题进行了讨论。

P450酶属于氧化还原酶，广泛存在于微生物、动植物及人体中。人体中的P450酶可参与多种内源性物质的代谢，在机体的正常代谢和循环中有重要作用[10]。此外，P450酶还具有多种生物催化活性，如氧化活性、环氧化活性、羟化活性、去甲基化活性等[11-14]。单一的P450酶在反应中只能催化单一价键的形成，将其与其他活性酶串联，可实现多种物质的合成。

Faber等[15]研究了P450酶与酪氨酸酚酶级联催化合成手性氨基酸的反应(Scheme 1)。该反应以苯衍生物(1a～1f)为底物，在P450-BM3的催化作用下羟化制得苯酚衍生物(2a～2f)，再以酪氨酸酚酶为催化剂，在丙酮酸盐和NH3作用下实现C—C键的偶联与不对称氨基化，最终合成了L-酪氨酸派生物(4a～4f)。具体来讲，Faber等以高选择性的P450-BM3突变体M2(47S/Y51W/I401M)为催化剂，对甲基、甲氧基、氟、氯和溴取代苯化合物进行羟化，制得σ-酚中间体(3a～3f)，再以酪氨酸酚酶TPL(M379V)催化后续的偶联和不对称氨化反应。针对P450酶与酪氨酸酚酶级联反应，为了尽量避免反应底物(1a～1f)与中间体(2a～2f和3a～3f)对酪氨酸酚酶的抑制作用，需要对底物浓度、反应时间和pH进行严格筛选。其中，对级联反应影响最大的因素是pH。其主要原因在于：1a～1f反应生成2a～2f和3a～3f的过程中，葡萄糖脱氢酶在消耗葡萄糖提供电子，促进电子循环的同时，也会不断积累葡萄糖酸，葡萄糖酸与反应生成的胺类物质(4a～4f)发生中和反应，使反应体系的pH变得不稳定，当pH<7时，C—C键的耦合反应受阻。因此在反应过程中，需提供外源的碱性物质，维持pH稳定，以驱动C—C键的耦合反应。在优化条件下，L-酪氨酸派生物的浓度可以达到5.2 g·L-1, ee>97%。

Müller等[16]研究了P450酶与醇脱氢酶级联催化合成环辛酮的反应(Scheme 2)。该体系通过P450-BM3的羟化作用，催化环辛烷生成环辛醇，再利用乙醇脱氢酶的脱氢作用催化环辛醇转化为化合物8。单加氧酶与乙醇脱氢酶的联合有效地实现了环辛酮的合成，当底物浓度为10 mmol·L-1时，P450-BM3浓度为0.61 μmol·L-1, Lb乙醇脱氢酶(LbADH)与Re脱氢酶(ReADH)浓度均为0.16 μmol·L-1时，产率最高可达51%。

  

Scheme 3

  

Scheme 4

加强水源地综合整治，完善河长制组织体系，严格落实水资源管理“三条红线”，严格执行饮用水保护和取水许可制度。落实水污染总量减排，集中治理工业集聚区废水。编制土壤污染治理与修复规划，推进矿产资源开发治理与修复，关闭非法砂场、碎石场107家，私挖滥采行为得到有效遏制。开展一号冰川、柴窝堡湖等重点水源涵养区生态治理。

Sello等[26]研究了羰基还原酶与两种不同醇脱氢酶的级联催化反应合成手性-羟基酸的反应(Scheme 8)。该反应分别以来自Escherichia coli菌株的醛羰基还原酶(ECAKR), Lactobacillus brevis菌株中的乙醇脱氢酶(LBADH)以及Pseudomonas fluorescensN3菌株的二醇脱氢酶(NDDH)进行重组表达，并构建了ECAKR-LBADH-NDDH三酶级联催化体系。该反应以前手性二酮化合物27为底物，首先经ECAKR还原得28，再经LBADH不对称还原得29，最后在NDDH作用下脱氢得到产物30。该级联体系为二酮化合物合成手性-羟基酸提供了一条有效途径。

吴忠柳等[28]研究了羰基还原酶与苯乙烯单加氧酶级联催化合成化学纯缩水甘油衍生物的反应(Scheme 10)。该反应以前手性α,β-不饱和酮化合物为底物，通过羰基还原酶的不对称还原反应级联苯乙烯单加氧酶的不对称环氧化反应，一锅法合成了缩水甘油衍生物。作者首先筛选出具有S选择性的羰基还原酶(ChKRED03)，有效地将34a～34n还原为(S)-烯丙醇35a～35n； 35a～35n在苯乙烯单加氧酶作用下合成了双手性产物36a～36n，产物的对映选择性>99%，非对映选择性>99%，产率>99%。

综上可见，P450酶单独参加催化反应时，产物单一，立体选择性往往不高；结合了不同催化活性的酶之后，不仅可引入更为多样的官能团，还可以提高产物纯度，用于含多个手性中心的化合物的合成。

综上所述，采用该春提早栽培技术生产青椒，产量高，效益好，风险小，且可达到早上市、抢市场、创高效的目的。但仍需结合青椒所在种植地的实际情况，不断加强田间管理、做好病虫害的防治工作，并按照行业情形、资源消耗等方面充分利用该栽培技术，从而为市场供应新鲜青椒供人们食用，满足人们对青椒的需求。

羰基还原酶可参与催化酮类化合物的不对称还原反应，对合成手性醇类药物有重要作用[19-22]。羰基还原酶不仅可以用于合成单一手性醇的反应，还可与其他生物酶进行级联反应，实现含多手性基团的醇类化合物的合成。

图7为在相同的运动加速度情况下,应用本文提出的基于加速度分离算法的改进卡尔曼滤波进行姿态解算的姿态误差曲线。

 

Scheme 5

  

Scheme 6

  

Scheme 7

Smonou等[24]研究了羰基还原酶与羰基还原酶级联催化合成双手性醇化合物的反应(Scheme 6)。该反应以S选择性的羰基还原酶(KERD-102)为催化剂，将前手性的3-取代-2,4-二酮正己烷化合物(21a～21d)还原为S构型的β-羟基酮中间物(22a～22d)，再经S选择性的羰基还原酶(KRED-101)作用合成(2S,4S)-23a～(2S,4S)-23d，或由R选择性的羰基还原酶(KRED-A1B)作用合成(2S,4R)-23a。该方法通过将底物特异性或选择性不同的两种羰基还原酶进行级联，可有效避免中间体β-羟基酮的分离，实现一锅法合成双手性醇类化合物。

 

Scheme 8

  

Scheme 9

Kohls等[25]研究了羰基还原酶与转氨酶的级联催化合成4-氨基-1-苯基戊烷-2-醇4个非对映异构体的催化过程(Scheme 7)。以消旋化合物24为底物、羰基还原酶(KERD-P1-B10)为催化剂，通过不对称氧化脱氢和还原作用拆分获得单一构型的(S)-24和(R)-24。(S)-24可由转氨酶(ATA-Cvi)和(Codexis ATA-025)分别催化合成(2S,4S)-26和(2S,4R)-26；(R)-24可由ATA-Cvi和Codexis ATA-025分别催化合成(2R,4S)-26和(2R,4R)-26。此反应巧妙的利用了羰基还原酶和转氨酶的底物特异性和立体选择性进行互补，实现了在一种化合物中多个手性中心的构建。

Flitsch等[17]研究了P450酶与醇脱氢酶和转氨酶的级联催化反应，实现了手性胺的不对称合成(Scheme 3)。其中自给型P450(Y96F)可实现4-取代乙苯化合物(9a～9e)的非选择性羟化，制得中间产物4-取代苯乙醇(10a～10e)； 10a～10e在LbADH和ReADH的共同作用下转化为4-取代苯乙酮(11a～11e)，最终在R选择性ω-转氨酶(ATA117)的作用下得到R构型的4-取代苯乙胺(12a～12e)。该级联体系的转化率为26%, (R)-苯乙胺的ee值达97.5%。

Nanda等[27]研究了羰基还原酶与脂肪酶级联催化合成手性2-羟甲基-2-甲基-1,2,3,4-四氢化萘-1-醇(33b)、 2-羟甲基-2-乙基-1,2,3,4-四氢化萘-1-醇(33d)、 2-(羟甲基)-2-甲基-2,3-二氢-1H-茚-1-醇(33a)和2-(羟甲基)-2-乙基-2,3-二氢-1H-茚-1-醇(33c)的反应(Scheme 9)。该反应首先通过脂肪酶(lipase-Ps)催化31得(R)-32和(S)-32； (R)-32在PPL作用下得(R)-31p； (R)-31分别在酮还原酶(Gc、 An或Cp)的作用下转化为(1S,2R)-33和(1R,2R)-33； (S)-32在Gc、 An或Cp的作用下转化为(1S,2S)-33和(1R,2S)-33。通过酶催化实现去乙酰化与使用化学方法(K2CO3/MeOH为溶液)实现去乙酰化相比较，使用酶催化具有能耗低、反应时间较短、ee值较高和产物包含4种构型等优点。以31b为底物时，在脂肪酶与酮还原酶的级联反应中可使(1S,2R)-33b的产率达80%， ee值99%、 (1R,2R)-33b产率达80%， ee值98%、(1S,2S)-33b产率达82%， ee值99%、 (1R,2S)-33产率达76%，ee值99%。该级联反应突显了酶催化过程的高效性、空间立体选择性强等特点。

Ma等[23]研究了羰基还原酶与卤醇脱卤酶级联催化合成降血脂药物阿托伐他汀中间体 (R)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的反应(Scheme 5)。该反应首先通过具有S选择性的羰基还原酶偶联葡萄糖脱氢酶催化4-氯-乙酰乙酸乙酯(17)合成(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯(18)，分离产率和ee值分别为96%和99.5%。然后在pH=7.3和常温条件下，通过卤醇脱卤酶催化18环化得到环氧化物中间体19； 19进一步在氢氰酸作用下开环合成最终产物20。值得注意的是，此过程所用的卤醇脱卤酶是通过定向进化技术获得的突变体，其催化效率较野生型提高了2 500倍，为该路线的工业化提供了保障。

LIFO在GAAP下是假定后购进的先发出，发出的存货按最后采购的单价进行计算。期末存货成本明显偏低，期末资产总价值也明显偏低。而销售成本较接近当前市价，销售利润比较真实。并且，当期销售收入能与当期销售成本相配比，能够反映出当期经营者的实际经营指标。这种方法的优点是配比性好，即在物价上涨的情况下，能够更好地实现收入和费用的配比。缺点是容易被用来操纵利润，即使用所谓的LIFO liquidation 操纵手法。简单地说，LIFO liquidation可以减少当期销售成本，增加当期利润，因为管理层只要减少当期采购，就会导致以前年度购买的期初存货被清算，从而虚增当期利润。

 

Scheme 10

  

Scheme 11

Li等[18]研究了P450不同突变体与醇脱氢酶级联反应催化环己烷，合成光学纯环己二醇的反应(Scheme 4)。该反应以P450-BM3突变体A82F和A82F/A328F将化合物13氧化为14； 14经催化反应转化为(R)-15和(S)-15。A82F和醇脱氢酶(BDHA)级联催化(R)-15可合成(R,R)-16，区域选择性为77%, er>99/1。A82F/A328F与BDHA级联催化(S)-15可合成(R,S)-16，区域选择性为65%。当A82F/A328F分别与BUDC和LBDHA构建级联催化体系，均可合成(S,S)-16，er分别为>99/1和96/4，区域选择性分别为70%和82%。

朱敦明等[29]研究了羰基还原酶和腈水解酶级联催化合成手性-羟基酸的反应(Scheme 11)。分别从Candida magnoliae菌株和Saccharomyces cereVisiae菌株中获得羰基还原酶(CMCR)和(Ymr226c)，两者可实现对化合物37的不对称还原反应，分别得到手性-羟基腈(R)-38和(S)-38。通过CMCR级联具有R选择性腈水解酶NIT6803，可以进一步制得对应的(R)-3-羟基-3-苯基丙酸(R)-39；将Ymr226c与S选择性的腈水解酶(bll6402)级联，可制得(S)-3-羟基-3-苯基丙酸(S)-39。

酶-酶级联反应不仅可以简化操作步骤，减少溶剂消耗，缩短反应时间；还能通过中间物的及时转化，在一定程度上减少中间产物对酶的抑制作用，有利于提高反应产率。利用底物特异性和选择性互补的酶构建级联催化体系，不仅保证了目标产物的对映体纯度，还能拓展反应类型。生物催化剂的活性和选择性可通过分子定向进化等技术进行改良，生物级联催化为更加复杂的化合物合成提供了可行之策。

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本文述及的P450可与酪氨酸酚酶、转氨酶和醇脱氢酶级联，羰基还原酶可与卤醇脱卤酶、醇脱氢酶和转氨酶等催化剂级联。虽然这些级联反应极大地丰富了级联催化反应的类型，但还需注意以下几个问题：(1)不同生物催化剂的最适反应条件(如最适温度和最适pH)往往不同，级联反应的条件很难完全符合每一种酶的要求；(2)对于参与酶较多的级联催化反应，往往存在木桶效应，这就需要尽量保证参与级联催化的每一种酶的催化性能较高；(3)利用不同重组酶的全细胞进行级联催化虽然可行，但也增加了底物和中间物与酶的接触屏障，降低了传质效率。构建多酶共表达的重组菌可以提高传质效率，但酶的表达量对其活性的影响却不容忽视；(4)不同酶对不同性质的化合物的耐受性存在一定差异，反应物对级联反应中酶活性的影响值得关注；(5)氧化还原酶介导的反应通常是辅酶依耐型的催化反应，对于多个氧化酶参与的级联反应，如何保证辅酶的特异性和有效循环是反应顺利进行的关键。

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