西藏设施西(黄)瓜根腐病的分离与鉴定

瓜类根腐病是典型的弱寄生性土传病害，棚室土壤位置相对固定，有利于根腐病病原菌累积，加之根腐病害发生的隐蔽性及土壤的屏障作用，增大了其防治难度[1]；而且西藏温室大棚种植的蔬菜主要是茄科和葫芦科作物，轮作倒茬比较困难，土壤中的病原菌多年连续繁殖积累，导致土传病害逐年加重，而棚内高温、高湿的条件则更有利于根部病害的发生[2].发展设施蔬菜，不但可以提高农业生产效益，而且还可以促进地区经济的快速发展.故而有效防治根病，一则可以减缓设施蔬菜根病逐年加重的趋势，二则能有效降低种植户的经济损失，提高新种植户的生产积极性，同时对设施蔬菜的示范推广起到推动作用，更对市场上蔬菜的供应产生了积极的影响.黄瓜根腐病的相关报道较多[1-4]，但根腐病发生的因素较为复杂，不同的地区可能拥有不同的主要致病菌，且西藏瓜类根腐病的研究报道较少.鉴于此，本研究于2011年从西藏拉萨郊县及林芝地区等设施瓜类主产地采集病样，在室内对其病原做了分离培养和鉴定，以期明确当地设施瓜类作物根腐病的种类，为该病害的综合防治提供科学依据.

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试病原菌；分离自西藏设施瓜类根部的镰孢霉属真菌(Fusarium spp.)；供试培养基：PDA培养基、PS液体培养基和PSA培养基[5].

学校是教师所处时间最长的地方，也是教师情绪劳动表现的场所，上文重点谈到学校文化与小学教师情绪劳动的关系及其期待建议，此处重点涉及关于教师情绪劳动管理的其他层面，主要包括教师专业生活的充实和教师非专业生活的滋润，同时也要求学校对教师情绪劳动表现做出相应的考核。

1.2 试验方法

1.2.1 症状描述及病原分离与纯化 在西藏拉萨市等地对典型病株症状进行描述后采集病株带回实验室，按照常规的组织分离法分离病菌，在PSA培养基上进行培养与纯化[5]，将纯化获得的菌株黑暗培养，待产孢后进行单孢分离，进一步纯化后移入PSA斜面培养保存备用[5].

1.2.2 致病性测定 将供试菌株用无菌水配制成孢子悬浮液(约 106个/mL)[5]，在室温条件下，采用直接浇灌法，将分生孢子悬浮液均匀接种在健康西瓜和黄瓜植株根围，以无菌水为对照，连续观察植株的发病情况，形成典型症状后，对病原菌进行再分离，按柯赫氏法则确定病原菌[6].

1.2.3 病原鉴定

1.2.3.1 形态学鉴定 将经致病性测定的病原菌培养产孢后，在显微镜下观察分生孢子梗和分生孢子特征，并测定100个分生孢子的大小[6]，并在显微镜下拍照[7].根据病原菌形态特征，参考文献[8-12]进行病原菌种的鉴定.

D-树胶醛糖(K)：菌落圆形，边缘光滑，气生菌丝不发达，其上有水珠状物质分布，从培养基背面观察，菌饼周围有环状橙黄色或者白色分泌物.

② PCR扩增 本试验选取通用引物ITS1和ITS4(上海生物工程有限公司合成)对供试菌株进行扩增，ITS区段PCR扩增引物示意图和引物序列分别如下[13]：

Step2　确定衡量聚类结果合理性的指标．记个类中所有元素与其各自重心距离的平方和为，给定充分小量，当时，即认为已得到了较为合理的分类，将会停止聚类的迭代过程．

10×PCRBuffer5.0 μLTaqDNA聚合酶(2 U/μL)1.2 μLITS1(10 mmol/L)2.0 μLITS4(10 mmol/L)2.0 μLdNTP(10 mmol/L)3.0 μLDNA 模板(10 ng/μL)2.0 μL(以加2.0 μL ddH2O为阴性对照)ddH2O34.8 μL总体积50 μL

1.2.4 温度对菌丝生长的影响 采用生长速率法.将已经活化好的病原菌用0.4 cm直径的打孔器切取菌饼，置于PSA平板中央，置于0，5，10，15，20，25，30，35和40 ℃下培养，重复5次，5 d后用十字交叉法测量菌落直径，并对所得数据用SPSS软件进行方差分析[6].

究其原因，一方面是东营市将生态林场的建设、“三网”绿化提升作为建设重点，实施了生态林场建设工程。目前，东营市已建有生态林场11处，新增造林面积达到36万亩，自然保护区修复湿地达到30万亩。另一方面，东营市大力实施水气污染整治专项行动。严格执行大气污染物排放标准，对东营市燃煤电厂、10吨以上燃煤锅炉进行超低排放改造，并且对能耗和污染排放源头进行严格控制，大力发展循环经济。2016年，东营市空气质量有所提升，各项空气污染物指标全面下降，二氧化硫、二氧化氮、PM10浓度情况都有所改善，分别比上年同期降低了23.2%、13%、8.96%，蓝天白云天数比2015年增加了28天。

⑤ 扩增产物的检测和测序 取5 μL扩增产物在1.2%琼脂糖凝胶上电泳检查扩增结果，具特异性条带的扩增产物送上海生物工程有限公司测序[13].

不同碳源培养基上菌落形态：乳糖(J)：菌落圆形，但不十分规则，较薄，边缘光滑，菌丝较短且较疏松，无色素分泌.

③ PCR扩增体系 本试验采用50 μL体系进行扩增，具体如下[13]：

④ PCR扩增程序 本试验扩增条件采用95 ℃预变性3 min后35个循环的扩增程序，具体如下[6]： 95 ℃ 3 min，94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，72 ℃ 10 min，共35个循环.

1.2.5 碳氮源对菌丝生长的影响 在含1%的碳源(葡萄糖、乳糖、D-树胶醛糖、麦芽糖、氯醛糖、D-半乳糖、蔗糖、可溶性淀粉、甘露糖、D-木糖、 D-果糖、不加糖)以及在含0.2%葡萄糖的马铃薯琼脂培养基中加入0.25%的氮源(氯化铵、硝酸铵、碳酸铵、硝酸钠、L-谷氨酸、尿素、大豆蛋白胨、L-组氨酸、 L-精氨酸、亮氨酸、蛋白胨、甘氨酸、不加氮源)培养基，置于最适温度下培养，分别以不加碳氮源为对照[12]，重复5次，5 d后用十字交叉法测量菌落直径，并对所得数据用SPSS软件进行方差分析[15].

2 结果与分析

2.1 症状描述

成株期发病，植株生长缓慢，长势弱、矮化、叶片自下而上逐渐萎蔫，发病初期中午萎蔫，早晚可恢复，如此反复数日后萎蔫加重，整株叶片枯萎下垂，不再恢复常态.病株根部褐色腐烂，维管束呈褐色(图1).潮湿时，根茎病部表面常产生白色或粉红色霉层，即病菌的分生孢子座和分生孢子.

2.2 病原的分离与致病性测定

2011年8月采集西藏设施瓜类病株带回实验室进行常规组织分离培养，根据培养性状及菌丝形态初步分为2个真菌分离物，其中在堆龙县西瓜根部分离到的1号菌为当地优势菌，出现频率在50%以上，其次为5号菌.将2个真菌分离物的悬浮液接种于健康西瓜和黄瓜幼苗上，经连续观察，在接种第10天出现萎蔫症状，剖开茎秆，茎秆维管束变褐，其发病症状与田间症状一致(图2).从发病茎秆上均可再分离得到与原接种菌株菌落及形态特征相同的真菌分离物.根据柯赫氏法则，确定该2个分离物均为瓜类作物根腐病的致病菌株[6].

表1表明，茄镰孢菌可以利用供试的13种碳 源，但是在含有碳源乳糖的培养基上菌落的生长速率与对照差异显著，呈抑制生长作用，在分别以树胶 醛糖和甘露糖为碳源的培养基上的生长速率也与对照差异显著，呈促进生长作用，在其他供试碳源培养基上生长速率异差不显著.

图1 西瓜根腐病田间症状 Figure 1 Field symptoms of the watermelon root rot

图2 西瓜根腐病致病性测定 Figure 2 Pathogenicity test of the watermelon root rot

2.3 病原菌鉴定

2.3.1 形态学鉴定 从堆龙县园区瓜类作物上分离到的1号和5号分离物均为菌落白色，平铺稍隆起，菌表细绒状，致密，菌背米白色，在PDA培养基上1号菌不产生色素，但5号菌产生粉红色色素.菌丝白色有隔，粗细1.2～3.5 mm，大型分生孢子马特型，两端钝圆，具1-4个隔膜，大小21.2～35.3 μm×4.1～4.7(25.9×4.2) μm；1隔孢子较多，大小11.8～22.3 μm×2.9～5.9(17.9×4.0) μm；单胞孢子长椭圆形，短杆状，两端较圆，大小7.1～12.9 μm×2.4～4.7(9.9×3.3)μm；产孢梗单瓶梗，有些很长，大小24.7～56.5 μm×1.8～4.1(38.7×3.0) μm(图3).参考相关文献[7-11]，根据其形态特征初步鉴定1号和5号分离物均为茄镰孢菌Fusarium solani (Mart.) Sacc.

图3 病原菌孢子形态特征 Figure 3 Morphological characters of the pathogen

根据其形态特征初步鉴定1号和5号分离物均为茄镰孢菌Fusarium solani (Mart.) Sacc.但1号菌为优势菌，因此本试验对1号分离物进行了以下试验.

2.3.2 病原菌ITS鉴定 采用Biospin Fungus Genomic DNA extraction Kit提取1号分离物的基因组DNA[16]，所提取的基因组DNA纯度、浓度和完整性能满足PCR扩增反应的要求(图4).利用引物ITS1和ITS4 PCR扩增，产物经电泳检测，在500～750 bp处有一条明显的扩增条带，且没有其他非特异性条带，即为获得的目的ITS rDNA片断，

可进行测序[16](图5)，将该扩增产物送上海生工测序.再将所测ITS rDNA序列输入GenBank中比对后，分别搜索下载同源性最高的序列，并与相似序列一起用Claustle(1.8)进行多重序列比较，再用Mega 4.0软件以Neighbour-Joining method 法寻找到的最简约系统发育树[16](图6).

图4 DNA的提取 Figure 4 DNA extraction

图5 ITS rDNA扩增 Figure 5 PCR product of ITS rDNA

图6 Fusarium sp1系统发育树 Figure 6 The phylogenetic tree of Fusarium sp1

茄镰孢菌的rDNA-ITS的碱基长度为574 bp，由系统发育树可知，其与GenBank中茄镰孢Fusarium solani(JF299258.1)聚在一起，且一致性在99%以上，因此鉴定其为茄镰孢，该结果与形态鉴定一致.

国民素质偏低是制约共享经济高质量发展的一个重要因素。一方面是因为人口基数庞大，道德教育难以普遍落实；另一方面是由于道德成本低。例如，先后出现在北京、上海、成都的共享睡眠舱，还未普及，就被查封叫停。一是有些用户长期霸占且不注重个人卫生，导致共享能力下降、用户体验不佳；二是安全无法得到保障，违法涉黄、暴力抢夺等极端情况暂未找出合适的解决办法。

2.4 病原菌的生长温度测定

从西瓜上分离得到的茄镰孢菌在15～40 ℃均可生长，最适温度为30 ℃(图7).

不同温度下菌落形态为：5 ℃和10 ℃：不生长；15 ℃：菌落圆形，边缘光滑，菌丝白色，无色素分泌；20 ℃：菌落圆形，边缘光滑，气生菌丝不发达，微黄，菌饼周围有焦黄色色素分泌；25，30和35 ℃：菌落圆形，边缘光滑，菌丝较短，生长紧密，紧贴培养基生长，无色素分泌；40 ℃：菌落圆形，边缘光滑，菌丝白色较短，生长紧密，紧贴培养基生长，培养基背面颜色较深，无色素分泌.

2.5 病原菌对碳源的利用能力

企业与学校是平等的两个主体，要实现校企合作的长期稳定发展，共赢是前提。学院在与九典制药合作过程中，先由校企双方主管领导牵头成立校企合作领导小组，共同负责制定合作计划、制度以及教学过程质量监控等。同时由院系和企业部门负责人组成协同育人工作小组，负责一般决策和具体工作任务的布置与实施，出台学生管理办法、校企资源共享办法等。随着合作的不断深入，相关制度和办法持续改进。实验证明，只有先做好顶层设计，各层级组织信息融通，才能实现预期的效果。

图7 生长温度测定 Figure 7 Measure of growth temperature

⑥ 数据处理 所测序列进入GenBank数据库进行相似性分析，并与GenBank中的相似序列在Claustal(1.8)程序包中进行多重序列匹配排列(Multiple Alignmemts)分析，最后形成一个多序列匹配排列阵，用Mega(4.0)程序包中的Neighbor-Joining法构建系统发育树[14].

1.2.3.2 ITS序列鉴定 ① DNA的提取 在PDA培养基上将病原真菌纯化培养5-8 d后，用5 mm打孔器打取菌饼，取1块加入到150 mL PS液体培养基中，25 ℃，150 r/min摇床震荡培养5-7 d，4层无菌纱布过滤后，用无菌生理盐水洗2次，再用无菌吸水纸吸干水分.取200 mg新鲜菌体，液氮中充分研磨成粉末，后按DNA提取试剂盒说明提取，经电泳检测具特异性条带的DNA提取物置于-20 ℃保存[13].

甘露糖(M)：菌落圆形，边缘光滑，气生菌丝不发达，从培养基背面观察有褐色泡沫状物质以菌饼为中心轮纹状辐射分布.

表1 碳源利用能力测试

Table 1 The test of carbon source utilization ability

碳源5个重复菌落直径/cm平均值/cm半乳糖6.30 6.30 6.50 6.30 6.30 6.20 5.72麦芽糖6.00 6.10 6.00 6.00 6.00 6.10 5.43可溶性淀粉6.00 5.90 6.10 6.20 6.20 6.00 5.47果糖6.20 6.10 6.10 6.00 6.20 6.00 5.50木糖6.30 6.20 6.30 6.30 6.30 6.30 5.68蔗糖6.30 6.40 6.40 6.00 6.20 6.20 5.65葡萄糖6.40 6.20 6.20 6.20 6.20 6.30 5.65洋芋琼脂6.30 6.20 6.20 6.30 6.30 6.30 5.67水琼脂5.90 5.90 5.70 5.70 5.90 6.00 5.25乳糖3.90 3.90 3.90 4.20 3.90 3.90 3.35树胶醛糖7.90 7.80 8.00 8.00 8.00 8.00 7.35氯醛堂5.80 5.80 5.50 5.50 5.80 5.80 5.10甘露糖7.40 7.40 7.40 7.50 8.00 7.80 6.98

2.6 病原菌对不同氮源的利用能力

图8表明，西瓜上分离得到的镰孢霉菌可以利用供试的13种氮源，但在含有氮源碳酸铵和精氨酸的培养基上菌落的生长速率与对照差异显著，呈抑制生长作用，在含有氮源硝酸钠、组氨酸的培养基上，菌落的生长速率也与对照差异显著，呈促进生长作用，在其他供试氮源的培养基上生长速率差异也较显著，但大多均低于对照，说明供试氮源多对该病原菌有抑制作用.

L-组氨酸(S)：菌落圆形，边缘光滑，菌丝较对照稍长，从培养基背面观察，有墨绿色色素分泌.

取3号免疫小鼠脾脏进行杂交瘤制备，经过3轮亚克隆及筛选后获得2株单克隆抗体，分别命名为3G3和3G4。如图4所示，腹水单抗经纯化后纯度得到了很大的提升，3G3和3G4浓度分别为6.06 mg/mL，2.22 mg/mL。 如图 4所示，两株单克隆抗体纯化后的效价均为105。

该组数据均经SPSS 22.0统计学软件处理分析，计量资料其表现形式为平均值±标准差（±s），组间及组内比较 t检验；计数资料用[n（%）]表示，组间比较用 χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

L-精氨酸(R)：菌落圆形，边缘处有一扇形缺刻，其余部位光滑.菌丝生长疏松，无色素分泌，从培养基背面观察有深浅相间的同心轮纹.

目前的教学方法种类很多，如“讲授法、问题法、讨论法、探究法、实验法等等，这些教学方法给有千秋，但谁也不能说哪一种方法好，哪一种方法不好。从学生的角度看，由于他们的个体差异，即使同一知识点，也要采用不同的教法，因此，每个教师在选择教法时，切记生搬硬套，而是应注重研究所用的教学方法是否能更好的体现快乐教育原则，是否能充分调动学生的积极性和主动性，只有从教学内容出发，从学生实际出发，才能设计出优良的教法，才能真正的体现每个教师自身的教学特色，否则，即使已被公认的教法，如果孤立的应用，或机械的照搬都难以凑效，甚至适得其反。

硝酸钠(V)：菌落圆形，较薄，边缘光滑，无色素分泌.

碳酸铵(Y)：菌落圆形，边缘光滑，菌丝疏松，无色素分泌.

N：对照；O：甘氨酸；Q：亮氨酸；S：L-组氨酸；P：蛋白胨；R：L-精氨酸；T：大豆蛋白胨；U：L-谷氨酸；V：硝酸钠；W：硝酸铵；X：尿素；Y：碳酸铵；Z：氯化铵. 图8 氮源利用能力测试 Figure 8 The test of nitrogen sources utilization ability

3 讨论

镰刀菌种类多、分布广，所以，镰刀菌的分类鉴定是一项十分复杂的工作，传统的镰刀菌种级别鉴定标准以分生孢子、分生孢子梗、厚垣孢子、菌落形态、生长速率和产生色素等综合特征进行确定，但物种形态特征除了受遗传物质控制外，还受到环境的影响，因此，将形态描述和DNA序列信息相结合显得十分必要[13].利用病原菌在rDNA区段及具有保守型又在科属种水平上均有特异性序列的特征，对ITS区段进行PCR扩增、测序及序列分析来检测植物病原菌和诊断病害[16]，这种方法快速、简便、精确.本试验结合病原菌的形态特征、ITS鉴定及生物学特性将西(黄)瓜根腐病病原鉴定为茄镰孢菌，在国内首次较详细地报道了西藏设施西(黄)瓜根部镰刀菌的病原形态以及生物学特性.然而，对该病菌有较好防治作用的药剂的种类有哪些，以及西藏设施西(黄)瓜根部镰刀菌是否会对其他地区的其他葫芦科作物造成病害，有待于进一步研究.

可以看出,TD-LTE信号中心频点从2 330 MHz成功搬移到140 MHz中频处。验证了多模射频TD-LTE模式射频配置的准确性。

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