三种黑果枸杞组织培养技术初探

黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr)系茄科(Solanaceae)枸杞属(Lycium)植物[1]，是我国西北荒漠地区一种特有的野生植物资源，分布于山西、宁夏、甘肃、青海、新疆、西藏等省[2]，其浆果呈球形，成熟后为紫黑色，无毒，有甜味.黑果枸杞营养成分丰富，含有17种氨基酸[3]，蛋白质含量为11.5%，总糖含量为34.43%[4]，还原糖含量为33.68%，VC含量为11 mg/100g，油率为5.54%，主要脂肪酸有3种，以不饱和脂肪酸为主，其中亚油酸含量最高，为71.48%[5].黑枸杞还含有13种微量元素，其中钙、镁、铜、锌、铁的含量高于红枸杞[6].另外，黑果枸杞有明显抗疲劳、保肝、抗肿瘤、疏通血管、降压、保护视力、防治糖尿病、保护心血管系统等药用功效[13].目前有关枸杞的研究主要集中在红果枸杞方面[14]，关于黑果枸杞的研究报道不多，取得的成果也比较少.本试验旨在从愈伤组织诱导培养、芽诱导培养、芽生长培养以及生根培养4个方面对黑果枸杞组织培养进行研究，为黑果枸杞的快繁研究及利用提供技术保障和理论依据.

第一，强化会计内控管理人员的法律意识，进行专门的法治教育，确保每一个财务内控人员都能够明确做假账等违法行为的恶劣影响，在团队内部形成良好的打假风气。同时，利用这个机会加强职业道德规范建设，提高财务内控人员的思想道德品质。第二，重视内控人员的继续教育，及时更新内控理念，强化财务管理专业知识，提高会计信息电算化操作技能。

1 材料与方法

1.1 材料

青海黑果枸杞来源于海拔在2 700～2 900 m的青海乌兰县；甘肃省黑果枸杞来源于甘肃武威民勤县的盐化荒漠地带；西藏黑果枸杞来源于西藏日喀则地区.

1.2 培养条件

温度25～27℃；光照3 000 lx,24 h光照.

比如剑桥企业中心，是剑桥大学的全资公司，下设技术转移部、咨询服务部、种子基金、创新风险基金四个部门，全权代表剑桥大学负责专利申请和技术转移工作。该企业中心机构设置健全、分工明确、流程严谨，主要工作包括：评估审核，在数目众多的申请书中对其市场价值进行严格的判定，确保待转化成果的高品质和成本的合理可控；决策咨询，外聘众多行业专家为企业进行决策咨询，增进高校与企业的充分交流，让高校科研工作者了解企业和市场的真正需求；管理种子基金，为初创企业提供种子基金，所有盈利会用于再投资［3］。

1.3 试验方法

1.3.1 诱导愈伤组织培养 将黑果枸杞种子用水冲洗干净后，用1.5 g/L升汞消毒5～8 min，用无菌水冲洗4～5遍，然后将灭菌后的种子接种到MS培养基上，在25～27℃条件下进行培养，待种子萌发，苗高5～10 cm时，剪取来自同一培养基大小相同的叶片接种到以下8种处理的培养基上：

由于车体受到会车气动流场的直接作用，且支撑车体的空气弹簧对压力变化较为敏感，因此需要首先研究车体在会车过程中的动态响应。车体的侧滚角θ与横移量Y在会车过程中的响应曲线分别如图6和图7所示。观察图6可知，车体侧滚角的变化趋势与会车流场压力的变化趋势相反，即当车体右侧流场压力增加时，车体发生逆时针侧滚运动，同时导致了转向架左侧空气弹簧内压升高，而右侧空气弹簧内压下降。由图7可知，交会车速越高，车体横移量越大；车体在交会初始正压力波的推动下首先向左侧横移，此后压力波出现两个负峰值点，车体受吸引作用向右侧横移，最后在车尾通过观测点时正压力波的作用下，车体又逐渐回复至平衡位置。

每个处理接20瓶，每瓶接5片，重复3次，分别在15 d和30 d观察统计愈伤组织大小在0.5cm左右的形成块数、颜色和疏密程度.计算出15 d形成的愈伤率和30 d形成的愈伤率，选出诱导叶片形成的愈伤组织适宜培养基.

愈伤率=形成愈伤组织的叶片数/总叶片数×100%

处理1：MS；处理2：MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L；处理3：MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L；处理4：MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L；处理5：MS+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L；处理6：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L；处理7：MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L.

由表1可以看出，3种黑果枸杞诱导叶片形成愈伤组织适宜培养基均为处理1，15 d时愈伤率分别为93%，96%，90%，30 d时愈伤率均达100%；30 d时不定芽数分别为88，123，96.处理3、处理4培养基中发生脱分化、再分化的作用较好，分化率较高，但形成不定芽的数量少于处理1、处理2，且差异显著(P<0.05).处理5、处理6培养基形成愈伤组织很少，分化率极低，没有再分化形成再生芽，而且培养基上形成愈伤组织的颜色为黄色.处理7、处理8培养基极少形成愈伤组织，形成的愈伤组织表现为浅灰色且生长缓慢.

1.3.4 生根培养 选取来自同一培养基长势相同、大小一致的幼苗，剪成1.0 cm左右的茎段，接种到以下5种处理的培养基上：

由表2可以看出，青海黑果枸杞以处理3为芽诱导适宜培养基，再生芽率为100%，平均再生芽数为5.64个，再生芽平均高度为1.78 cm.处理1由于激素浓度过低没能诱导愈伤组织形成再生芽.处理4、处理5虽然再生芽率均为100%，但平均再生芽数、再生芽平均高度均低于处理3，且差异显著(P<0.05)，同时还有少数再生芽发生玻璃化现象.处理6表现为再生芽率、平均再生芽数、再生芽平均高度明显降低，且多数再生芽发生玻璃化现象.

每个处理接30瓶，每瓶接5块，重复3次，45 d左右观察愈伤组织状况，计算出再生芽率、1 cm以上再生芽的平均再生芽数、平均苗高，并选出诱导生成再生芽的适宜培养基.

处理1：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L；处理2：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；处理3：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L；处理4：MS+6-BA1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；处理5：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L；处理6：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L；处理7：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L；处理8：MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+2,4-D 0.5 mg/L.

再生芽率

再生芽数

平均苗高

1.3.3 再生芽生长培养 选取来自同一培养基大小长势一致的再生芽接种到以下7种培养基上：

1.3.2 再生芽诱导培养基 选取来自同一培养基形状大小一致的愈伤组织接种到以下6种处理的培养基上：

每个处理接10瓶，每瓶接种5个，重复3次，然后观察形成愈伤组织的状况和统计茎段在60 d时的成苗率和幼苗平均高度.

成苗率

幼苗平均高度

③为服务外包中的委托与服务双方提供一个标准化程序和识别一致的参考框架，实现量化方式描述服务外包的范围、内容和责权边界，有利于提高服务质量和改善合作关系。

处理1：1/2MS+IBA 0.1 mg/L；处理2：1/2MS+IBA 0.2 mg/L；处理3：1/2MS+IBA 0.3 mg/L；处理4：1/2MS+IBA 0.4 mg/L；处理5：1/2MS+IBA 0.5 mg/L.

每个处理接种20瓶，每瓶接种5个，重复3次，然后观察幼苗在60 d内的开始生根天数和生长状况，计算成苗率、生根率、平均主根数、平均苗高.

伴随着《葡萄酒》杂志十年发展的金樽奖，除了肩负着为中国消费者挑选出最符合“中国人口味”的葡萄酒，更重要的是引领一种以葡萄酒主旨的生活方式。近年来，金樽奖的系列主题活动中，以主宾国为主题的大师班向来是一众葡萄酒爱好者必空出时间参加的活动。

2 结果与分析

2.1 诱导叶片愈伤组织培养

所有实验数据采用SPSS20.0统计软件进行分析处理。计量资料以均数±标准差表示，差异性检验采用t检验；计数资料以率表示，差异性检验采用卡方检验(Fisher确切检验)。P<0.05为差异有统计学意义。

为全面提升企业财务预算的执行和管理水平，企业在运营过程中应不断完善自体的预算组织框架。企业建设专门的组织机构，进而对财务预算进行规范化管理。在该框架中，企业要派遣专员去负责预算管理工作，并推行责任个人机制，以增强预算管理人员能力水平与职责意识，为财务预算执行质量全面提升做出支持。与此同时，企业也可创建委员会加强财务预算管理，同时对财务预算的执行情况进行监督，这是提升企业财务预算执行能力的有效办法之一。

表1 黑果枸杞叶片愈伤组织诱导情况

Table 1 The callum incluction status of black berry under different culture medium

处理叶片数15 d愈伤率/%青海甘肃西藏30 d愈伤率/%青海甘肃西藏不定芽数青海甘肃西藏愈伤组织状况110093a96a90b100a100a100a88a123a96a绿色210092a94b93a100a100a100a76b106b87b绿色310087b90c88bc100a100a100a37d92c64d深绿色410085c88d89b100a100a100a48c75d76c深绿色510041d34e34d53b44b39b000发黄610035e27f31e49c45b40b000发黄710026f21h20g35d29d28d000浅灰色810027f23g22f34d32c31c000浅灰色

2.2 再生芽诱导培养

处理1：MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.05 mg/L；处理2：MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L；处理3：MS+6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L；处理4：MS+6-BA 0.4 mg/L+NAA 0.1 mg/L；处理5：MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L；处理6：MS+6-BA 0.6 mg/L+NAA 0.1 mg/L.

甘肃黑果枸杞以处理5为适宜诱导再生芽的培养基，再生芽率为100%，平均再生芽数为3.20个，再生芽平均高度为1.97 cm.处理1、处理2、处理3中再生芽率、平均再生芽数、再生芽平均高度均小于处理5，且差异显著(P<0.05).处理4中虽然再生芽率为100%，但平均再生芽数、再生芽平均高度均低于处理5(P<0.05).处理6中诱导形成的再生芽有少数发生玻璃化现象.

西藏黑果枸杞诱导愈伤组织形成再生芽以处理3明显优于其他培养基，其再生芽率为100%，平均再生芽数为4.34个，再生芽平均高度为1.92 cm.试验观察可知培养基激素浓度过低会影响芽的生成，同时表现出再生芽细弱、发黄现象，而激素浓度过高又会造成大量愈伤组织的形成，会使再生芽生长缓慢、发黄和发生玻璃化现象.

表2 黑果枸杞诱导再生芽形成的状况

Table 2 Status of bud formation induced of black berry under different culture medium

处理叶片数再生芽率/%青海甘肃西藏平均再生芽数/个青海甘肃西藏再生芽平均高度/cm青海甘肃西藏再生芽生长状况11500000000000215084.2c55.3d92.0c4.48b1.92d3.32c1.83a2.03a1.95a细弱3150100a94.0c100a5.64a2.40c4.34a1.78b1.98b1.92b粗壮4150100a100a100a4.04c2.88b3.96b1.56c1.95c1.84c粗壮5150100a100a100a3.66d3.20a3.02d1.32d1.97b1.67d少数玻璃化615094.7b98.7b93.3b2.52e1.76e2.24e1.17e1.59d1.28e多数玻璃化

2.3 再生芽生长培养

通过表3可以看出，青海、甘肃、西藏黑果枸杞的芽生长培养的适宜培养基均为处理1，表现为成苗率最高，均为100%，幼苗平均生长高度最高，分别为13.21，12.46，12.57 cm.处理2，3，4，5培养基上有幼苗形成，随着激素浓度增大，形成幼苗数量减少，同时幼苗生长缓慢，并在基部形成愈伤组织.处理6，7培养基上没有幼苗形成，接种的再生芽在基部形成大量愈伤组织.

2.4 生根培养

通过表4可以看出，在处理1，青海黑果枸杞的成苗率、生根率和平均苗高最大，分别为79%、92%和13.59cm，处理5的出生根率、成苗率、平均苗高均为最低，但对平均不定根数表现出促进作用.

表3 黑果枸杞再生芽生长培养状况

Table 3 The status of regeneration bud of black berry under different culture medium

处理接种再生芽数/个青海黑果枸杞成苗率/%幼苗平均高度/cm甘肃黑果枸杞成苗率/%幼苗平均高度/cm西藏黑果枸杞成苗率/%幼苗平均高度/cm愈伤状况150100a13.21a100a12.46a100a12.57a无250100a10.06b92b10.27b84b9.15b无35072b3.78c46c5.25c54c4.39c少量45036c2.26d22d1.94d26d1.82d大量55018d1.75e12e1.83d00大量650000000大量750000000大量

表4 黑果枸杞的生根培养状况

Table 4 Proportion of the black wolfberry exogenesis hormone in rooting culture medium

处理接种苗数/个始生根天数/天青海甘肃西藏成苗率/%青海甘肃西藏生根率/%青海甘肃西藏平均不定根数/个青海甘肃西藏平均苗高/cm青海甘肃西藏110056879a76a88a92a80b95a1.16d1.08e1.01e13.59a13.50a13.44a2100761066b66c63c86b88a84c1.30c1.30c1.36d12.79b12.37b13.16b31001081066b70b69b70c76c90b1.83b2.12a1.56c12.14c12.81b12.99c410010101136c36d31d45d42d62d3.20a2.67d2.68b10.86d10.80c11.50d510012101228d27e28e38e35e43e2.68e3.37b3.49a7.22e5.03d6.47e

对甘肃黑果枸杞生根培养的比较，可以看出，处理1、处理2、处理3开始生根天数、成苗率、生根率、平均苗高都明显高于处理4和处理5，同时随激素浓度增大，成苗率、生根率、平均苗高都呈现降低趋势，但平均不定根数表现为上升趋势，且各处理之间都表现为显著差异.

对西藏黑果枸杞生根培养的比较，5种生根培养基中幼苗的成苗率、生根率、平均苗高随激素浓度增大而降低，同时以处理1的成苗率、生根率、平均苗高最大，分别为88%，95%，13.44 cm,但开始生根天数、幼苗的平均不定根数会随激素浓度增大而增大，并且相互之间表现出显著性差异.

3 讨论

在诱导叶形成愈伤组织方面，当培养基中加入6-BA浓度大于1.0 mg/L时，导致有大量的愈伤组织形成，并且愈伤组织疏松不紧密，建议6-BA浓度宜在0.2～1.0 mg/L之间；在培养基中加入2,4-D后，愈伤组织的形成大量减少，这说明本试验中加入2,4-D对愈伤组织的形成有抑制作用，这与李玉静等[15]在水稻中的研究结果相反.2,4-D在高浓度时有抑制作用，在低浓度时又有促进作用，可能是由于黑果枸杞对2,4-D比较敏感，建议将2,4-D浓度降低后再进行研究以探索适宜浓度范围；在芽诱导方面，当激素过大时，芽会大量出现玻璃化现象，这可能是由于激素浓度增大会使芽再分化能力加强，吸收营养过快，导致发生玻璃化现象.当愈伤组织过紧密或者过疏松时，芽的形成会迅速减少，所以在芽诱导试验中应该用紧密程度适宜的愈伤组织；在芽生长和生根方面，当激素浓度增大后，有些芽表现出不生长或死亡的现象，说明激素对芽的生长和生根有一定的影响.

4 结论

青海、甘肃、西藏3种黑果枸杞诱导叶片形成愈伤组织的适宜培养基均为MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L和MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；甘肃黑果枸杞诱导芽形成的适宜培养基为6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L，成芽率为100%，平均成芽数为3.20个，芽平均高度为1.97 cm.青海和西藏黑果枸杞诱导芽形成的适宜培养基为6-BA 0.3 mg/L+NAA 0.1 mg/L，成芽率都为100%，平均成芽数分别为5.64和4.34，芽平均高度分别为1.78 cm和1.92 cm；青海、西藏、甘肃黑果枸杞的茎段生长培养以MS培养基适宜幼苗生长，幼苗平均高度分别为13.21，12.57，12.46 cm；通过对青海、甘肃、西藏3种黑果枸杞的开始生根天数、生根苗数、成苗数、平均苗高、不定根总数、平均不定根粗综合分析得出生根培养都以1/2MS+IBA 0.2～0.3 mg/L为适宜培养基.

参考文献

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