干旱胁迫对山定子水分生理及AQPs表达的影响

山定子(Malus baccata Borkh.)具有较强的抗寒、抗旱、耐贫瘠能力，在我国黄河以北地区常用于苹果嫁接砧木[1].干旱胁迫影响果树的正常生长、产量及果实品质，当重度干旱胁迫时，果树停止生长，叶片和果实开始萎蔫并脱落，直至树体死亡[2-3].同时，干旱胁迫能够显著影响植物水势、组织含水量、自由水与束缚水等水分生理的变化.植物水势是其重要的水分生理指标之一，它能够反映植物遭受干旱胁迫时水分亏缺程度，其值的大小在一定程度上可以反映出植物的抗旱性[4].植物的生长发育与水分运输密切相关，植物水通道蛋白(Aquaporin，AQPs)对植物体内水分的运输和维持动态平衡有着重要意义.AQPs主要的生理功能是促进水分的跨膜运输，除此之外，AQPs参与植物的非生物胁迫防卫反应[5-7].因此，研究干旱胁迫对植物水分生理及AQPs表达量的影响，能够使人们更为深入地了解植物响应干旱胁迫的机制.

干旱是影响果树及其他农作物产量及品质的重要因素之一，在生产中防范干旱危害以提高产量及品质是农业生产面临的重要课题.对于果树而言，干旱对树体正常生理功能的影响表现在果树生长发育、生理生化过程的各个阶段[8].果树响应干旱胁迫是形态解剖结构、渗透调节反应、保护酶活性、光合作用、细胞膜稳定性等的综合反应[9].干旱胁迫能够抑制果树的光合作用，使树体光合速率下降[10-11]，枝条生长缓慢、叶片变小、木质化严重、果实生长量减少、果小而品质降低等[12-13].当果树体内水分严重亏缺时，枝条完全停止生长，叶片和果实随即萎蔫脱落，枝干脱水，最后整个植株死亡[14].目前，国内外对于苹果水通道蛋白基因的研究多为单个水通道蛋白基因，对于其基因家族研究分析鲜有报道.如Liu等[15]在苹果属水分亏缺下水通道蛋白与其生理及抗旱性关系的研究中指出，苹果属AQPs在转录水平响应干旱胁迫.Hu等[16]研究了苹果PIP1基因MdPIP1a和MdPIP1b的生理功能，结果表明MdPIP1除在果实膨大发挥重要作用外，还在胁迫条件下维持水分平衡.本研究基于山定子水分生理，同时对山定子多个AQPs基因在干旱胁迫下表达水平进行测定分析，研究不同干旱胁迫对AQPs相对表达量的影响.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为2年生山定子(Malus baccata Borkh.)，于2016年3月底定植于花盆(28 cm×32 cm×22 cm)中，每盆定植1株，栽培基质为蛭石及营养土(1∶1).试验材料于4周后开放顶部覆膜的塑料大棚中避雨栽植.

1.2 试验设计

测定盆栽苗田间持水量和基质水分，按基质水分与田间持水量的关系将试验共设置4个处理：对照(控水至田间持水量75%～80%，CK)、轻度干旱胁迫(控水至田间持水量的60%～65%，D1)、中度干旱胁迫(控水至田间持水量的45%～50%，D2)、重度干旱胁迫(控水至田间持水量的25%～35%，D3).5株为一个处理，重复3次，解除干旱胁迫后立即复水(R),连续3 d(R1、R2、R3)采样测定相关水分生理指标.

1.3 试验方法

1.3.1 山定子水分生理指标测定 叶片含水量、自由水及水势测定采用阿贝折射仪法[17]；叶片相对含水量及饱和亏测定参考陈林等[18]的方法进行.

所以，对慢性心力衰竭（多病因）患者进行心脏彩超诊断，能为患者诊断提供参考依据，临床应用价值较大，具有推广意义。

表1 引物设计

Table 1 Primer design

基因上游引物(5'- 3')下游引物(5'- 3')MdPIP1;4CCCTCCCTCACTTCACCACTTCCTTGCCTTCCATTTTMdPIP2;4TGGAGTGTTACCGAGGCTAGTGATTGGGATTGTGGCMdNIP1;2ACCAACCAAGAATCCAGCAGTGAGACCAAATTCACCACCAMdNIP5;1GAGAGCTTGATCGGAAATGCGCAAATGCAATGGTGAGAGAMdNIP6;1CGGTGGAGTGACAGTTCCTTGCCAACTCTCCAACTGCTCTMdNIP4;1ATGAACCCAGCAAGAAGCATCATTGTAGACCAAGGCACCAMdNIP4;2ACAGGCAGACTCTTTACACGATGATTTGAACCGCTATMdTIP1;3GTCATTGCTTGCTTGCTCCTACCACAGCGTTCCATACTCCMdTIP2;2GGCAACATCACCATCCTCCCTTCAATAGCACCTACTCCMdTIP5;1GTTCTCAATGCCATCTGCTTCGGTGATTCCGTAGGTCMdβ-TIPAAGGCTATCCGTTGTTCGGTGGTTCCTCCATCTCCCMdδ-TIPTTGGGAGATGTGACGATTGTAGAAGATGCCAGTGAGGGADPHTGAGGGCAAGGTGAAGGGTATCTTTCAAGTCAACCACACGCGTACTGT

1.4 数据处理

式中，为实验室系中子弹性散射的角微分截面，取决于入射中子能量和散射角；NH为单位面积聚乙烯靶中的氢核数；Ωs为反冲质子立体角，由质子准直器和二极磁铁的磁极间隙决定；η为反冲质子的传输效率。在模拟计算中，反冲质子磁谱仪的中子探测效率计算公式为

1.3.2 山定子组织RNA提取及荧光定量PCR 植物组织RNA提取利用植物RNAplant试剂并按照其说明书进行，利用生工生物公司(中国上海)在线免费服务进行引物设计，排除因含有特殊碱基而影响引物特异性的部分水通道蛋白基因，以GADPH为内参基因(表1).使用反转录试剂盒PrimeScriptTM RT-PCR(Takara公司)对RNA进行反转录.qRT-PCR分析由定量试剂盒SYRB○R premix EX TaqTM Ⅱ(Takara)、Light Cycler○R 96 Instrument(Roche)仪进行.反应体系含2 μL cDNA，上下游引物各 1 μL，10 μL SYBR Ⅱ，6 μL ddH2O，总体系 20 μL.反应程序为 95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，共40个循环，试验3次重复，反应结束后分析荧光值变化曲线，采用2-ΔΔCt方法分析数据，计算每个基因的相对表达量.

2 结果与分析

2.1 山定子水分生理指标测定结果

干旱胁迫显著影响山定子叶片水势、含水量、自由水、束缚水等组织的含水量(图2).在不同干旱胁迫下山定子叶片水势随胁迫程度的加重呈下降趋势，至重度干旱胁迫时最低，水势下降了25.25%，复水后叶片水势明显上升(图2,A).叶片组织含水量随干旱胁迫加重，下降幅度较大，至重度胁迫时下降幅度为24.35%，复水第3天后恢复至58.14%(图2,B).自由水与束缚水呈相反的变化趋势，自由水下降的同时，束缚水就会升高，二者随胁迫程度加重均发生显著的下降或上升(图2 C,D).叶片相对含水量与饱和亏也呈相反的变化趋势，二者的变化趋势相反且相关，随着干旱胁迫程度的加重叶片含水量下降，而饱和亏呈上升趋势(图2 E,F).叶片水分生理在复水后均展现出恢复现象，叶片水势、含水量及相对含水量均在复水1 d后显著上升，之后上升幅度逐渐减小，束缚水与饱和亏则相反.

高通量捕获测序提示CLCNKB基因c.1389delA纯合突变。Sanger测序验证父亲携带该位点杂合突变，而母亲未发现该位点突变(图1)。MLPA检测证实先证者与母亲均存在CLCNKB基因1-18号外显子杂合缺失(图2)，先证者父亲无片段缺失。明确先证者致病突变及父母来源后分别采用Sanger测序与MLPA检测羊水胎儿DNA，发现胎儿基因型与先证者一致。

图1 干旱胁迫对山定子茎、根组织含水量的影响 Figure 1 Effect of drought stress on water content of stem and root in Malus baccata

干旱胁迫对山定子茎及根系含水量有显著影响(图1).随着干旱胁迫程度的加重，山定子茎组织含水量急剧下降，至重度胁迫时，茎含水量为46.867 9%，下降幅度为30.47%.

复水1 d后，茎含水量上升幅度最大，为16.5%；之后趋于平缓，复水3 d后，茎组织含水量为58.392 5%(图1,A).类似地，根系含水量随干旱胁迫程度变化的幅度更大，至重度胁迫时，其根系水分为50.702 4%，下降幅度为20.73%.复水后，根系组织含水量恢复度较高，水分吸收量大，至复水第3天时为62.732 3%，基本与胁迫前水平一致(图1,B).

图2 不同胁迫处理及复水对山定子叶片水势、叶片含水量、自由水、束缚水、叶片相对含水量及饱和亏的影响 Figure 1 Effects of different stress treatments and rewatering on Malus baccata water potential,leaf water content,free water,bound water,relative water content and saturation deficit

2.2 山定子水分生理与基质水分的相关性分析

为了进一步检验水分胁迫对山定子水分生理的影响，我们对山定子盆栽基质水分与其水分生理指标进行了相关性分析(表2).相关分析表明，基质水分含量与山定子叶片水势相关系数为0.989，与叶片组织含水量相关系数为0.975，与叶片自由水相关系数为0.983，与叶片相对含水量相关系数为0.907，与茎组织含水量相关系数为0.977，与根系含水量相关系数为0.969，相关分析显示基质水分与上述水分生理存在相关或显著正相关性.叶片水势与叶片组织含水量和叶片自由水相关系数分别为0.969和0.951，为显著正相关；叶片自由水含量与茎、根组织含水量相关系数分别为0.963和0.948，呈显著正相关；叶片相对含水量与茎、根组织含水量相关系数为0.889和0.921，存在极显著正相关；叶片饱和亏与叶片相对含水量、叶片组织含水量、叶片自由水含量及茎、根系含水量呈极显著负相关性(表2).

2.3 不同干旱胁迫对山定子AQPs相对表达量的影响

干旱胁迫能够显著影响AQPs的表达水平(图3).每个AQPs在山定子叶片和根系中的表达情况均有所差异.MdPIP2;4在山定子叶片中的表达量显著高于根部，且随着干旱胁迫程度的加重，总体呈现表达量上调的趋势，在重度胁迫时表达量最高(图3,A).MdPIP1;4在山定子叶片中未表达，其在中度胁迫时表达量最高，重度胁迫时显著下调(图3,B).MdNIP5;1在叶片和根部均表达，且在轻度胁迫时表达量最高，表达量随胁迫程度的加重显著下调(图3,C).MdNIP4;2在叶片中的表达量显著高于根部，轻度胁迫时表达量最高，中度及重度胁迫时叶片中不再表达，中度胁迫较轻度胁迫下，其根部的表达量上调(图3,D).轻度胁迫时MdTIP2;2在叶片和根部均表达，且根部表达量高于叶片，中度胁迫时根部表达量较轻度胁迫表达量上调，叶片中不再表达(图3,E).重度胁迫时Mdβ-TIP在叶片中的表达量最高，轻度胁迫时表达量较高，在中度胁迫时未表达；根部在中度胁迫时表达量较高，Mdβ-TIP在山定子叶片和根部的表达量随胁迫程度加重而上调(图3,F).MdNIP4;1的表达量在山定子叶片及根部随干旱程度加重而上调，但在重度胁迫时不再表达，且叶片中的表达量高于根部(图3,G).MdNIP4;1在根部未表达，中度胁迫时在叶片中的表达量最高，重度胁迫时不再表达(图3,H).MdTIP1;3在山定子叶片和根部的表达量相反，在叶片中随胁迫程度的加重表达量下调，在根部则上调，且叶片中的表达量高于根部(图3,I).中度胁迫时MdTIP1;3在叶片未表达，且随胁迫程度的不同表达量小幅下调，在根部的表达则相反，其表达量呈上调的趋势，重度胁迫时根部未表达(图3,J).Mdδ-TIP在轻度胁迫时的叶片及根部表达量最高，重度胁迫时根部不再表达，中度胁迫时叶片中不再表达(图3,K).MdNIP1;2在3个胁迫程度的叶片中均表达，且表达量呈下调的趋势，根部只在轻度胁迫时表达(图3,L).

采用Microsoft excel 2010进行数据整理，SPSS 16.0对数据进行相关性分析、单因素方差分析法(one-way ANOVA)和Duncan法进行方差分析和多重比较(α=0.05)，采用Origin 8作图软件作图.

表2 山定子基质含水量与各水分生理相关性分析

Table 2 Malus baccata’ s analysis of the correlation between water content and water physiology

水分生理指标基质水分叶片水势叶片组织含水量叶片自由水叶片相对含水量叶片饱和亏茎组织含水量根系组织含水量基质水分10.989*0.975**0.983**0.907**-0.907**0.977**0.969**叶片水势10.969*0.951*0.332-0.3320.6620.848叶片组织含水量10.963**0.811**-0.811**0.953**0.918**叶片自由水10.891**-0.891**0.963**0.948**叶片相对含水量1-1.000**0.889**0.921**叶片饱和亏1-0.889**-0.921**茎组织含水量10.983**根系组织含水量1

图3 不同干旱胁迫对山定子AQPs相对表达量的影响 Figure 3 Effects of different drought stress on relative expression of AQPs in Malus baccata

3 讨论

3.1 干旱胁迫对山定子水分生理的影响

试验结果表明，干旱胁迫使得山定子叶片水势、含水量、自由水等水分生理发生显著变化.对多种植物的相关研究结果表明，土壤水分亏缺能够引起植物叶片水势下降.植物自由水含量高，其代谢活动相对强，束缚水含量多，则代谢活动减弱但抗逆性增强[19].植物组织相对含水量(RWC)可以反映植物组织在干旱胁迫条件下的水分状况，植物叶片的相对含水量在遭受干旱胁迫时降低[20].干旱胁迫引起植物体内水分亏缺，水分亏缺的大小用自然饱和亏(WSD)表示，其值越大说明植物体内水分亏缺越严重[21-22].干旱胁迫下，山定子叶片水势、含水量、自由水及相对含水量均显著降低，束缚水及饱和亏则显著升高.根系是对干旱胁迫最为敏感的部位，干旱胁迫下根系组织含水量下降，且随着基质水分的亏缺其含水不断下降.同时，山定子茎及根系组织含水量也下降.基质含水量与山定子水分生理存在相关或显著的相关性.其中基质水分与山定子茎、根组织含水量及叶片组织含水量、叶片水势及自由水含水量显著相关.当土壤水分亏缺时，植物组织水势下降，植物需要吸收更多水分来维持自身组织水势的稳定[23].水势与土壤水分关系密切，Castel等[24]发现扁桃在不同田间干旱期，其叶片水势在干旱初期开始下降.彭守兰等[25]对极端干旱条件下策勒绿洲引种植物水分生理特征的研究表明，水势随着水分亏缺而发生明显的变化.杨朝选等[26]对干旱过程中桃树茎和叶水势的变化做了研究，结果表明随着土壤水分的不断亏缺，桃叶片水势呈下降的趋势.本研究表明，干旱胁迫时土壤(基质)水分的亏缺引起山定子水分生理的一系列变化.

(2) 深入开展CFRP基础性研究。轨道车辆对材料的力学性能、环保性能、防火性能、抗冲击性能、耐极端环境性能、耐老化性能、隔音隔热性能、减振阻尼性能、电磁兼容性、生命周期环境友好性以及安全可靠性等都有特殊要求，开展满足轨道车辆应用的材料性能研究，解决目前复合材料存在的防火、隔声隔热、抗冲击性能局限性，可大大提高复合材料的应用广度。

3.2 干旱胁迫对山定子AQPs表达量的影响

本试验研究了山定子叶片及根在不同干旱胁迫下AQPs的表达情况，结果表明苹果AQPs在山定子叶片及根部的表达存在较大差异，如山定子叶片中MdNIP1;2和MdNIP4;2的表达水平显著高于根部，这是AQPs表达存在组织差异的一方面；另一方面是部分基因，如MdPIP1;4只在山定子根部叶片中表达，叶片中未表达.本试验结果表明苹果AQPs的组织差异性主要表现在表达量的差异，同时进一步验证了AQPs的表达存在着组织差异性.Liu等[15]在两个苹果属海棠和平邑甜茶水分胁迫下水通道蛋白与抗旱性的研究中指出，干旱胁迫下MdTIPs(MdTIP2;1除外)在二者叶片及根部的表达量增高，而本研究中MdTIPs只在山定子根中的表达量随干旱胁迫的加重而升高.韩晓毓[27]对M26等5种苹果砧木导水性和水通道蛋白对干旱胁迫与盐胁迫的响应研究中指出，水通道蛋白基因MdPIPs和MdTIPs在叶片中的表达水平高于根部，与本研究结果不同的是，MdTIPs在山定子根部的表达水平高于叶片，上述基因表达水平不同的原因是干旱胁迫处理时间不同造成的.山定子根系完整且侧根发达[28]，在干旱胁迫下根系吸收水分能力造成AQPs响应干旱胁迫的不同反应.同时，AQPs的表达存在植物不同生长阶段和环境中的各种器官、组织、细胞中的时空表达特异性的现象[29].研究表明，山定子每个AQPs基因在叶片和根部的表达均不相同，说明其对干旱胁迫的响应机制及作用也不尽相同[30].Alexandersson等[31]利用cDNA微阵列和实时定量逆转录PCR技术研究了拟南芥35个AQPs在干旱胁迫下的表达模式，结果表明其在拟南芥叶片和花中的表达量差异较大，没有AQPs在叶片中特异表达，存在组织差异性，并指出干旱胁迫下AQPs可能被不同的启动子元件调控.

4 结论

不同干旱胁迫处理下，山定子水分生理均受到显著影响，叶片水势、含水量、自由水、相对含水量及茎、组织含水量均下降，复水后逐渐恢复.干旱胁迫下，AQPs在山定子中的表达存在组织差异性，主要表现为基因表达量的显著差异.

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