结直肠癌生殖器官移植性肿瘤动物模型的建立

运用试验动物建立疾病模型可模拟活体状态下疾病的特征，为癌症的诊疗和抗肿瘤药物的研究提供试验材料[1].结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是常见的严重威胁人类生命健康的高发恶性肿瘤之一[2].随着人口老龄化日趋严重和医疗检测技术水平的提高，近10年来流行病学调查表明其发病率呈明显上升，已成为全球第三大与我国第四大常见癌症杀手[3].我国每年约有16万患者死于此病和其术后转移，且该类患者一旦发生转移，病死率大幅度提高[4].肝脏、肺脏为该类疾病的主要转移灶，已多有成熟有效的建模方法例如小鼠肝脏门静脉注射法、脾脏静脉注射法等建模方式.根据各自优劣势分析并结合临床偶见结直肠癌症出现生殖器官转移现象.本试验在参考近几年结直肠癌转移性肿瘤动物模型建立基础上(如诱发性模型、转基因模型、原位移植免疫缺陷型裸鼠模型等[5])针对结直肠癌生殖器官部位产生的转移性癌症，尝试采用2种不同手术方法进行对比，以建立有效的CT26细胞株生殖器官移植性肿瘤动物模型.以便为该种癌症转移的诊疗提供高质量且价格低廉的动物模型建立方法.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 BALB/c近交系小鼠280只，鼠龄7～8周，体质量(20.0±2.0)g，雌雄各半，由解放军军事医学科学院实验动物中心提供(许可证编号SCXK，2015-0019，SPF级).位于全军肛肠外科研究所实验动物中心采用恒温(25～27 ℃)，恒湿(45%～50%)无特定病原SPF环境内.试验组动物置于超净生物层流架IVC系统内，严格无菌操作，饮用水、饲料经无菌处理供动物自由饮食，垫料和笼具定期紫外线消毒更换，每饲养盒内4～6只小鼠.

1.1.2 肿瘤细胞 BALB/c小鼠结肠腺癌细胞株(CT26)，购自上海榕柏生物技术有限公司，形态为贴壁成纤维细胞.胎牛血清培养基和添加剂:RPMI-1640.

1.1.3 试剂耗材 胰蛋白酶(Gibco USA)，医用胎牛血清培养基液(创研生物公司)，双抗试剂(青霉素10×104U/L和链霉素100 mg/L)，DMEM/F12培养液(国药控股)，人纤维蛋白凝胶Fibrin Glue(230 mg/dL标准品，上海榕柏生物技术有限公司)，非吸收性外科缝合线(杭州华威医疗公司)，一次性无菌注射器(1 mL规格，江苏苏云医疗器械公司)，6#无菌手术刀片(江苏苏云医疗器械公司).

1.1.4 设备仪器 CO2水浴恒温培养箱中培养(苏州净化医疗设备公司)，倒置显微镜(卡尔蔡司Axiovert40C)，医用净化工作台(苏州净化设备公司)，台式高速冷冻离心机(美国热电BIOFUGE STRATOS).

1.2 试验方法

1.2.1 鼠源CT26细胞悬液制备 将成品CT26细胞培养于含5%胎牛血清培养基液的DMEM营养液(含青霉素10×104U/L和链霉素100 mg/L)中，置于37 ℃、5% CO2的培养箱内.细胞贴壁生长，取指数生长期的细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，机械吹打成细胞悬液，2 000 r/min离心5 min弃上清液加适量生理盐水调整细胞浓度至107个/mL，台盼蓝测定细胞活力在90%以上，备用.

1) 诱发性结直肠癌模型 诱发性肿瘤模型是人为地经口服、肛门放置栓剂等方式将致癌物二甲肼(DMH)、乙基-亚硝基尿素(ENU)、黄曲霉素、芳香族胺和烷基亚硝胺等送入动物消化道内，化学诱导结直肠致癌[10].此种方法较为简单且试验重复性好，运用广泛，但该类模型造模历时较长且转移率不高导致无法有效获取目的性生殖器官转移肿瘤模型.

1.2.2 CT26细胞株皮下传代培养 1 mL无菌注射器注射CT26细胞悬液0.2 mL至BALB/C小鼠双侧腋下[6].待皮下肿瘤生长至直径5 mm(约12～15 d)，超净台内取皮下肿瘤，PBS洗涤后剪碎，医用网形纱布过滤为单细胞悬液，2 000 r/min，5 min离心，加适量无菌生理盐水稀释后台盼蓝染色测定活细胞浓度107个/mL.同法接种子代小鼠，每次传代 5只共传3代[7].

1.2.3 纤维蛋白凝胶移植接种 将50只雄性试验组小鼠尾部标记为A组，50只雌性试验组小鼠尾部标记为B组分笼饲养.异氟烷吸入性深度雾化麻醉状态下在净化工作台内用无菌手术刀在腹部生殖器表面皮肤开3～5 mm微切口，在A组小鼠贴近睾丸部位B组小鼠贴近卵巢部位分别接种0.1 mL传代后的CT26细胞悬液(细胞活性90%浓度107个/mL)，切口处用人纤维蛋白凝胶约3 mL粘合手术创口，表面纱布缠绕，术前术后小鼠腹部务必涂抹碘伏消毒处理.稳妥放回IVC层流系统饲养笼盒，以待留观.

纤维蛋白凝胶移植接种小鼠共100只，成瘤成活72只，平均成功率72%(72/100).荷包缝合移植接种小鼠共100只，成瘤成活59只，平均成功率59%(59/100).手术过程中每只麻醉时间控制在30 min内，术后第1天察情C组死亡1只小鼠.术后9 d各组均出现部分小鼠行动不便，声音刺激活动减弱，毛发出现暗淡.各组陆续出现小鼠死亡情况.截止接种手术后第30天对试验成瘤小鼠除部分取用以完成抗肿瘤药物研发研究外，均处以人道主义终点处理，成瘤小鼠平均生存天数为25.86 d(图3).

研究发现，PCR扩增和测序成功率是评判DNA条形码序列优劣的标准之一。本研究对4条候选条形码序列的PCR扩增和测序结果进行了统计(表3)，结果显示，psbA-trnH和psbK-psbI的扩增成功率为100%，matK和rbcL的扩增成功率为97.3%；matK和psbA-trnH的测序成功率为100%，psbK-psbI和rbcL测序成功率分别为97.3%和96.4%。各条形码中，matK扩增的序列最长，psbK-psbI最短；rbcL序列的GC含量最高。

2 结果与分析

2.1 成瘤期体表观察和病理切片检查

2) 转基因动物模型 转基因动物技术可使外源基因导入小鼠受精卵，产生携带目的基因的小鼠品系或敲除特定基因达到致癌作用.APC、hMSH2、hPSM1等基因剔除模型剔除的小鼠可发生肠道息肉样腺瘤，比较好地模拟家族性腺瘤疾病的发生[11].部分复合基因突变模型，如Tgfb1-Rag2联合突变、Apc716-Smad4联合突变小鼠肠道成瘤比较接近遗传性非腺瘤，但几乎未见肿瘤转移.由于现阶段原位成癌及转移概率低，且试验周期长，目前尚无法广泛应用以获取目的模型.

图1 A组成瘤小鼠体表观察(20 d) Figure 1 Subcutaneous tumor model of A group BALB/c mice

2.2 接种小鼠术后成活情况

1.2.4 荷包缝合移植接种 将50只雄性试验组小鼠尾部标记为C组，50只雌性试验组小鼠尾部标记为D组，分笼饲养.麻醉状态下在腹部生殖器表面皮肤开3～5 mm微切口，在C组小鼠贴近睾丸部位D组小鼠贴近卵巢部位分别接种0.1 mL传代后的CT26细胞悬液(细胞活性90%浓度107个/mL).创口微小忽略肌浆层不做处理，皮肤表层切口处用半月形手术缝合针非和吸收性外科缝合线，采用全荷包手术缝合法围绕开口处作连续缝合，在从荷包处将皮肤组织向内翻入同时，拉紧缝线打结.创口表面纱布缠绕，术前术后小鼠腹部同样做涂抹碘伏消毒处理.放回饲养笼盒，以待留观，6～9 d可视创口愈合情况做拆线处理.

图2 镜检成瘤石蜡切片的HE染色 Figure 2 Pathological characteristic of organ metastases of CT26 colorectal adenocarcinoma mice model(HE×100)

图3 各试验组小鼠成活率 Figure 3 The survival rate of experimental mice statistical figure

2.3 接种小鼠术后成瘤情况

粮食安全关系国家的安危。在2012年“世界水日”“中国水周”到来之际，本刊以“水·农田水利·粮食安全”为主题，采访了国际灌排委员会主席高占义。

2.4 小鼠接种后肿瘤成长速率

自接种之日起每天观察接种创口愈合情况，自小鼠拆线之日起测量并合理计算移植肿瘤体积.以组为单位，每天测量并估算记录瘤体体积并以每5 d为节点制作统计，记录统计分析可得A、B组约在移植第10天起就可测得可触及的肿瘤瘤体生成，而C、D组成瘤潜伏期明显多出2～3 d.由于荷包缝合术拆线后需多日等待创口皮肤自然愈合，部分出现炎症，对肿瘤观测产生一定影响.而潜伏期过后各组均呈现均匀稳定的瘤体体积增大(图4).

1.2.5 肿瘤体积测定和HE染色 潜伏期约10 d左右，在术前备皮并捏起上皮用游标卡尺测量厚度.成瘤后每2 d用游标卡尺测量肿瘤的最大直径(Dmax)和最小直径(Dmin)参考公式V=1/2Dmax×(Dmin)2计算肿瘤体积≥0.5 cm3记录为成瘤小鼠[8].从而制作肿瘤体积时间生长曲线图，取部分成瘤组织留样做病理学检查.用颈部脱臼法处理小鼠，肿瘤组织用甲醛固定，制作石蜡切片，HE染色，光镜下对成瘤组织进行病理定性检查.见明显深染肿瘤细胞核，呈椭圆形密集分布，少数肿瘤细胞的胞浆占比较多，一部分细胞呈现裸核状态，与周围的器官组织有异形性差别明显.

表1 各组小鼠术后成瘤情况

Table 1 The condition of mice groups with tumor growth after the operation

组别接种动物数/只成活数/只成活率/%平均成瘤天数/dA组50346813.37±3.06B组50387612.33±2.45C组50285615.66±3.77D组50316114.25±2.08

采用SPSS 19.0对成瘤时间统计对比差异有统计学意义(P<0.05).试验A组B组平均成功率(72%)与C组D组平均成功率(59%)差异显著有统计学意义(P<0.01).

图4 移植肿瘤生长体积趋势 Figure 4 Transplanted tumor growth volume trend chart

3 讨论

结直肠癌生殖器官移植性肿瘤动物模型的建立在国内外鲜有报道.理想的移植性肿瘤动物模型应该具有高重复性、高成瘤成功率、稳定的特点[9].目前，建立动物体内结直肠癌生殖器官移植性肿瘤动物模型的方法主要有：

SPSS21.0统计分析,计量资料数值用±s表示,比较用t检验。组内治疗前后采用配对t检验,两组组间比较则用独立样本t检验。计数资料率用卡方检验。P<0.05:差异有统计学意义。

1.3 磨损颗粒的粒度分析 将磨损颗粒用PBS+2%小牛血清重悬，孵育3-6h后用超声粉碎仪（艾克森AIX-C1002）使其均匀混合。校准激光测度仪（BT-9300H型激光粒度分布仪分析系统），试样槽用酒精浸泡15min，等待自然蒸发后，蒸馏水反复冲洗3次。取颗粒混悬液4ml置入测度仪后进行分析[9]。

每日定期观察试验组小鼠饮食、活动、体表形态等生理情况，接种一周后即可观察成瘤情况(图1).根据肿瘤体积测定方法对成瘤情况进行估值记录，并将中途死亡小鼠和荷瘤成活小鼠的瘤体组织均做HE染色，得到切片如图2.

3) 移植性结直肠癌模型 莫非卡瓦等[12]于1986年将人结肠癌细胞移植到裸鼠盲肠浆膜下，建成首例大肠癌原位移植模型.将外源性肿瘤细胞移植到实验动物体内生长而成的肿瘤根据移植部位的不同可分为原位移植和皮下移植较为常见.

参考已有建模标准以肿瘤体积达到0.5 cm3成瘤为标准点，A组平均成瘤时间(13.37±3.06)d，B组平均成瘤时间(12.33±2.45)d，C组平均成瘤时间为(15.66±3.77)d，D组平均成瘤时间为(14.25±2.08)d，见表1.

刘宁要求，当前水利抗震救灾要做好六方面的工作：一是加快核查水电站大坝受损情况，确保工程安全。二是高度重视防止次生灾害的发生，最大限度地降低灾害损失。三是加快水电站发电外送设备和电网的修复，积极恢复水电站供电。四是抓紧抢修饮水工程。断水地区要紧急制定实施临时供水方案，采取临时供水措施，确保当下灾区群众和抢险人员饮水安全。有水地区要加强水质监测，严防饮用污染水源。抓紧抢修震损人饮工程，尽快恢复安全供水。五是加快做好水文、水保等涉水设施的受损排查工作，抢修震损的拦沙坝，防止汛期泥石流发生。六是做好玉树震区的水利震损设施恢复重建各项准备工作。

原位移植肿瘤模型是将来自人体的肿瘤组织块或细胞株植进入试验动物的相应部位.霍夫曼等[13]创立了外科原位移植方法，通过手术原位移植手术标本进入裸鼠盲肠浆膜下部(0.1 mL的癌细胞1×106/mL).该模型近人体肿瘤发生、发展过程的模型，也是建立人大肠癌肝转移的理想模型，适合大肠癌晚期和远处转移的研究.目前常见盲肠造疝原位接种瘤块法；原位显微注射法(OCMI)；其他原位植入模型[14].采用细胞悬液法，将HCT-116、SW-620、DLD-1细胞悬液在解剖显微镜引导下，微量注射到盲肠壁黏膜和肌层间，肿瘤生成率为75%～88%，但转移部位难以掌握，无法有效形成定向转移模型[15].但由于人源性肿瘤细胞株与小鼠机体存在高度的排异性，极易被动物体自身免疫系统清除，无法高效形成转移性肿瘤模型，可复制性较差无法广泛应用于医学研究.

25.35%的学生认为周围同学平时抄袭作业现象比较严重，7.04%的学生认为抄袭作业现象非常严重，近65%的学生认为同学中考试作弊的情况较多，60%的学生表示周边同学上课迟到、早退、旷课的现象严重。20.73%的教师认为培养优良学风，应该首先解决学生的迟到、早退、旷课问题，14.63%和7.32%的教师认为抄袭作业、考试作弊也较为严重。所以，建设优良学风，培育浓厚的校园学习氛围，必须及时采取措施控制以上不良现象，加强纪律检查，帮助学生养成良好的学习习惯。

CT26细胞是由N-亚硝基-N-甲麦角新碱诱导的小鼠低分化大肠癌细胞株[16].1997年,Darshini等[17]应用该细胞株建立了近交系小鼠大肠癌肝转移模型[18].在总结前人已有研究的基础上，本试验采取现在被广泛认可的CT26细胞株传代培养移植接种法，通过纤维蛋白凝胶粘合创口移植接种建立转移模型并与以往常见的荷包缝合移植接种建模进行比较.在成本低廉的BALB/c近交系小鼠上，可有效的模拟出大肠癌生殖器官转移.本实验建立的BALB/C小鼠结肠癌术后转移生殖器官动物模型在已有的国内外未见报道，同时具有操作简单、成瘤率高、直观性好等特点.采用CT26细胞株小鼠体内传代培养反复筛选的方法建立的小鼠结肠癌细胞具成瘤率高、稳定、操作简单的特点[19]，同时进行了相应的生物学特性观察和研究.分别尝试采用的2种手术方式都是在外科临床常见的方式.便于试验动物从业者和医学院校和科研单位的生物学、动物学、生命科学类专业研究者常规操作.尤其是纤维蛋白凝胶的商业化广泛应用，价格实惠，为肿瘤学试验的动物模型提供了很好的前景.从小鼠结肠癌C26细胞系中分离、纯化了高成瘤系，并建立了相应的动物模型，体内、外试验均验证了该细胞系保持了高侵袭、高成瘤的特性.所建立的模型为结肠癌基础研究提供稳定可靠的动物模型.为肿瘤转移的相关遗传基因、肿瘤转移机制、新抗癌转移药物的发现等提供切实可靠且价格低廉的动物模型.

试验过程中应注意肿瘤细胞接种量不宜过多，容易引起排异反应导致建模小鼠高死亡率；接种术后C组小鼠出现互相撕咬创口现象，应尽量分笼处理；切忌建模成瘤过程中揉搓按压接种创口位置，可导致成瘤组织成散开状分布，甚至增大死亡率.

4 结论

1) 通过CT26细胞株小鼠皮下体内传代培养的细胞接种在试验小鼠皮下的成瘤情况相较于原代肿瘤细胞直接接种的小鼠具有更好的成瘤能力和稳定的成瘤效果.

泡沫混凝土应符合《泡沫混凝土》［4］的标准要求，28 d抗压强度不小于2.0 MPa；所使用的外加剂（水泥强度激发剂、减水剂和发泡剂等）亦应满足规范要求。

2) 建立的BALB/C小鼠结肠癌术后转移生殖器官动物模型创意新颖，同时进行了相应的生物学特性观察和研究可认定其具有操作简单、成瘤率高、直观性好等特点.

3) 从小鼠结肠癌C26细胞系中分离、纯化了高成瘤系，并建立了相应的动物模型，体内、外试验均验证了该细胞系保持了高侵袭、高成瘤的特性.为肿瘤转移的相关研究提供经济实用的动物模型.

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