应用石斛EST序列对SNP位点开发与分析1)

单核苷酸多态性(SNP)是指基因组范围的单个核酸碱基的插入、缺失、转换、颠换等突变引起的DNA序列多态性。由于其密度高、遗传稳定性强，易于自动化分析等特点，已经成为第三代分子标记，目前已广泛应用于动植物的遗传多样性分析[1]、遗传连锁图谱构建[2]、品种鉴定[3]及重要性状的基因定位[4]等相关研究中。但SNP标记开发前期需要测序的成本费用较高导致其未能被大规模开发，因此，利用已知数据，通过生物信息学分析进行SNP标记进行前期位点开发挖掘、再通过试验进行候选SNP位点检测验证，是SNP标记降低成本的快捷高效的开发途径之一[5]。

EST(表达序列标签)是来源于功能基因表达的cDNA片段，也是识别转录区多态性的重要资源。随着研究的深入，公共数据库中EST序列以飞快的速度递增，极大地促进了以EST序列为基础的分子标记的开发，目前EST-AFLP、EST-RFLP、EST-SSR、EST-SNP等分子标记手段已经非常普遍[6]。这些基于EST序列开发出的分子标记除具有一般常用分子标记的特点之外还具有通用性好、信息量大、开发方法简单快捷、成本低等优点。特别是综合多种优点的EST-SNP，其研究结果很可能与表达基因紧密相关，可直接运用于动植物分子育种等相关研究领域的实践应用[7]。对于没有全基因序列信息的动植物来讲，利用EST序列进行候选SNP位点的挖掘具有非常重要的研究意义。

施工方案：地下通道施工可采用明挖法，盖挖法和顶管施工方法。综合考虑管线影响、工期和交通影响，采取顶管施工方案。

石斛属(Dendrobium Sw.)是兰科植物中仅次于石豆兰属(Bulbophyllum Thou.)的第二大属，也是兼具较高药用价值和观赏价值的一个属，全球有1 000～1 400个种，广泛分布于亚热带及热带地区。我国是石斛的重要分布地区之一，由于品种数量庞大，对于其品种鉴定前人尝试了多种方法[8]，但至今对于石斛的分子鉴定及分类还是存在极大困难，严重限制了石斛育种进程及其产业的发展，因此，对于石斛的品种鉴定、分类及遗传多样性的研究仍旧是石斛研究当务之急。利用石斛在NCBI中的dbEST数据库进行候选SNP位点的挖掘，开发石斛SNP分子标记对石斛育种、分类及遗传多样性分析都具有重要意义。本研究从NCBI的EST数据下载石斛EST序列，通过生物信息学方法筛选候选SNP位点，为石斛EST-SNP标记的开发及后续石斛的遗传多样性分析、品种鉴定、性状基因定位及分子育种等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 石斛EST序列获取及聚类簇分析

从NCBI的dbEST数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucest/?term=Dendrobium)下载16 183条石斛EST序列，所有EST序列均以FASTA格式保存，序列信息来源见表1。序列下载后，采用DNASTAR 7.1.0(44.1)软件包中的SeqMan程序检测去除全部EST序列的载体序列，然后组装拼接叠连群。

表1 石斛EST序列来源信息

基因型组织类型EST序列数目/个金叉石斛(Dendrobium nobile)腋芽;幼苗15383铁皮石斛(D. candidum)种子800

1.2 石斛EST-SNP位点筛选及分析

通过DNASTAR软件中的SeqMan程序对含有4条EST序列以上的621个叠连群进行候选SNP位点筛选，结果表明：共有342个叠连群含有候选SNP位点1 083个，平均580.28个bp含有1个SNP位点，每个叠连群含有3.25个SNP位点，SNP位点发生频率为0.17%。其中含SNP位点最多的叠连群(叠连群规模为8)共有22个SNP位点，30.70%的叠连群只含有1个SNP侯选位点，含3个以下候选SNP位点的叠连群占全部候选SNP位点的总叠连群数的69.59%，含3个以上候选SNP位点的叠连群只占总叠连群的30.41%，多数叠连群包含的SNP位点并不丰富，这可能与石斛的遗传背景紧密联系(表2)。

筛出的候选SNP位点有转换、颠换及插入缺失3类型，其中转换类型位点为655个，占总数的60.5%，颠换类型位点为408个，占总数的37.7%，二者比值约为1.6∶1.0，插入缺失为20个，占总数的1.8%(表4)。在转换类型中C-T转换的频率(37.0%)远远大于A-G转换频率(23.5%)。颠换类型中以AT和GT颠换类型为主，二者分别占候选SNP位点总数的10.3%和10.5%，CG和CA颠换占少数，比例分别为8.1%和8.7%。

图1 候选SNP位点的人工筛选原则

1.3 候选SNP所在核苷酸序列同源性比对

提取筛选得到的SNP位点两侧各约50 bp的EST序列，采用NCBI上的BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)进行核酸序列比对，从比对结果中提取与比对序列相似性最高的序列注释信息，对SNP靶向基因产物及物种来源进行分析。

2 结果与分析

2.1 石斛EST序列聚类

无机化学及实验方面的教材较多，同时版本更新也较快，然而创新和改革较少．近些年，先进的技术不断发展，而相对应的教学内容并没有同步更新，如很多的无机化学教材中，在讲解氧化还原反应内容时，涉及铅电池的反应只是使用一些化学反应，仍然套用十几年前的内容和相应的技术手段．而且实验内容不够贴近生活，缺乏趣味性，反映了教学内容没有与时俱进和先进教学手段的薄弱[3-4]，趣味性的缺乏在一定程度上降低了课堂的教学气氛[5]．购置一定数量的成品，使学生更易接受相关知识点．结合铅蓄电池的具体结构（见图2）消化相关知识，铅蓄电池中的反应方程式的解释为：

2.2 石斛EST序列SNP频率

采用SNASTAR中的SeqMAn程序中的SNP工具对拼装好的叠连群进行候选SNP位点筛选。筛选原则：①候选SNP位点两侧至少有5 bp完全保守序列；②拼接组装含有4条(包括4条)以上EST序列的叠连群；③候选SNP位点中的次要等位基因频率至少为30%(图1)[9-10]。

从NCBI的dbEST数据库中下载得到石斛EST序列16 183条，参与拼接的EST序列为9 756条，拼接聚类后共得到叠连群2 267个，其中含4条及4条以上EST序列的叠连群621个，占总数的27.4%，总长度628 444 bp，未参与拼接的序列6 427条，拼接效率为60.3%。

近几十年来，我国生态文明建设水平不断提高，环境与经济、社会之间的协调发展能力不断加强[1-2]。“大力推进生态文明建设”是党的十八大提出的战略决策，十八届三中全会进一步提出了“建设生态文明，必须建立系统完整的生态文明制度体系，用制度保护生态环境。要健全自然资源资产产权制度和用途管制制度，划定生态保护红线，实行资源有偿使用制度和生态补偿制度，改革生态环境保护管理体制”，把保护生态环境、建立生态文明放在了突出的地位。

表2 包含不同数量SNP位点数的叠连群数量统计

叠连群中包含SNP位点/个叠连群/条占总叠连群的比例/%110530.70 27321.35 36017.54 4339.65 5247.02 6164.68 772.05 882.34 941.17 1030.88 1120.58 1220.58 1320.58 1410.29 1710.29 2210.29

随着叠连群规模不断增加，叠连群包含的候选SNP位点总数呈下降趋势，整体上显示小规模叠连群包含的候选SNP位点数最多，其中叠连群规模为4～6的包含的候选SNP位点数占候选SNP位点总数的42.7%，在规模为4的叠连群中包含150个SNP位点，这些位点的阳性率可能会很高[11](表3)。包含SNP候选位点的叠连群规模在4～6的占总叠连群的48.8%(表3)，通过统计分析每种规模叠连群平均包含候选SNP位点数与叠连群规模之间并没有相关性，平均含量分别在叠连群规模为19时最大，15、21、43次之(表3)。综合以上数据说明虽然大规模叠连群容易筛选到更多的SNP位点，但其总量却远远不如小规格叠连群。

2.3 候选SNP位点类型

SNP频率=(候选SNP数目/叠连群长度)×100%。

2.4 候选SNP位点所在核酸序列同源性比对

提取筛选得到的1 063个转换和颠换SNP位点两侧各50 bp序列在NCBI核酸比对数据库中进行同源性比对，发现共有25个SNP候选位点所在的10条核酸序列无比对结果，可能是还未发现的基因，但也需要进一步验证。在具比对结果的SNP位点中有2个SNP位点所在核酸序列与梵净山石斛叶绿体DNA具99%的同源性，1个SNP位点所在核酸序列与金钗石斛叶绿体DNA具99%的同源性，3个SNP位点所在核酸序列与流苏石斛叶绿体DNA具99%的同源性，6个SNP位点所在核酸序列与小兰屿蝴蝶兰(Phalaenopsis equestris)的细胞色素蛋白具86%的同源性，另外3个SNP位点所在核酸序列与小兰屿蝴蝶兰的休眠相关蛋白同源物具87%的同源性，1个SNP位点所在核酸序列与建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus)的外壳蛋白具99%的同源性，共有1 021个SNP所在核酸序列与铁皮石斛的不同基因序列存在高度同源性(表5，表6)，说明同科属植物存在较高的同源性。唯一一个SNP位点所在核酸序列与绿豆的60 S核糖体蛋白具有98%的同源性(表7)。

纠缠账本的问题集中在账本安全性和激励机制2个方面：在账本安全性上，交易速度的假设还需要实践检验；在激励机制上，在没有交易费的情况下如何激励节点存储大量的IoT交易也是需要经过实践检验的。

表3 叠连群规模与SNP位点数目的关系

叠连群规模(EST序列数目)/个SNP/个叠连群/个每种叠连群含SNP位点平均值/个 4150642.35165622.76147413.67130393.3884194.4980243.31029122.41149114.51236103.61359144.2141052.0152655.2161142.8171472.0181033.3192546.3201434.7211025.022933.023212.024623.025422.028313.033212.035212.043515.0246111.0

表4 SNP候选位点类型

突变类型突变数目/个SNP类型数量/个比例/%合计比例/%转换655A-G25423.560.5C-T40137.0颠换408C-A948.737.6G-T11410.5C-G888.1A-T11210.3插入与缺失20A-30.31.9C-80.7G-40.4T-50.5

表5 同源比对位于铁皮石斛核酸序列的280个石斛SNP位点

叠连群编号基因产物相似度/%E值 登录号SNP位点/个696核糖核酸酶3979×10-57XM_020838566.152101晚期胚胎发育丰富蛋白906×10-33XM_020820963.154273-磷酸甘油醛脱氢酶2983×10-57XM_020840662.110109高迁移率族蛋白B996×10-95XM_020828999.111234γ谷氨酰环化转移酶2941×10-77XM_020833808.11963铁硫簇支架蛋白941×10-87XM_020822509.12278半胱氨酸蛋白酶982×10-111XM_020840054.14192茎特异性蛋白993×10-109XM_020845116.121131蓖麻毒素B凝集素990XM_020839367.132135MLP蛋白972×10-90 XM_020843097.121285S-腺苷甲硫氨酸合成酶990XM_020848679.15694小泛素相关修饰物979×10-171XM_020832911.11162质体蓝素980XM_020840846.1110472-链烯还原酶970XM_020821158.113795膜类固醇结合蛋白2963×10-77XM_020833459.112176组织蛋白酶S970XM_020816564.141475磷脂过氧化氢谷胱甘肽过氧化物酶970XM_020819456.112121结瘤素相关蛋白1976×10-147XM_020849349.122191丙二烯氧化物合酶2941×10-88XM_020839450.141338三级醇脱氢酶970XM_020816385.1226142,3-二磷酸甘油酸独立磷酸甘油酸变位酶990XM_020833725.16691鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β亚基蛋白990XM_020817558.121296聚泛素11950XM_020838609.112111321 ku蛋白960XM_020828663.12940生育酚甲基转移酶960XM_020849152.18578UBP1相关蛋白2C988×10-161XM_020836002.13160含有YTH结构域的蛋白家族2982×10-90XM_020830951.11700细胞色素b5970XM_020847752.1234鸟氨酸氨甲酰转移酶990XM_020821231.111164乙烯应答转录因子1979×10-104XR_002302650.132102花粉特异蛋白C13980 XM_020819889.131043RNA聚合酶Ⅱ转录亚单位的可能介体37b980XM_020827253.122172果胶酯酶抑制剂9960XM_020839827.131124谷胱苷肽S-转移酶3976×10-106XM_020840572.18860洛杉矶相关蛋白990XM_020830656.13924肉桂烯醛基-CoA还原酶1980 XM_020841945.16902锚蛋白重复结构域含有蛋白2B990 XM_020830679.12351胞浆三磷酸异构酶980 XM_020827272.168051,2-二羟3酮5甲硫戊烯双加氧酶990XM_020846353.16393氧蛋白质强化剂2980 XM_020826972.121618冷休克结构域蛋白4992×10-120 XM_020849886.111827谷氨酰胺合成酶同工酶980 XM_020817050.171437休眠相关蛋白同源物3975×10-148XM_020843986.13938与重金属相关的植物异戊二烯蛋白37990XM_020850234.12294网格蛋白轻链2998×10-94XM_020821851.132093CCR4相关因子1同源物11970XM_020846643.1322085'-腺苷酰硫酸还原酶5991×10-55XM_020835751.11213FRIGIDA蛋白4b974×10-66XM_020817841.121035酯酶/脂肪酶992×10-80XM_020833464.111244磷酸2-脱氢-3-脱氧辛酸醛缩酶2983×10-56XM_020840110.112137酸性磷酸酶1992×10-148 XM_020832007.13522Remorin蛋白(植物丝状蛋白家族)985×10-101 XM_020826940.131116细胞质果糖-二磷酸醛缩酶1991×10-87 XM_020847592.11675核融合缺陷蛋白970 XM_020840111.12338翻译因子SUI1同源蛋白980XM_020840642.121554双向糖转运蛋白SWEET4984×10-118 XM_020831893.11363核酸内切酶2980 XM_020835036.12

续(表5)

叠连群编号基因产物相似度/%E值 登录号SNP位点/个204信号肽酶11002×10-99XM_020842508.11352链烷酸1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶970 XM_020834519.141388V型质子ATP酶催化亚单位A923×10-41 XM_020820487.131384RNA聚合酶II、IV和V亚基6a1005×10-59XM_020841781.111004DDB1-和CUL4相关因子8972×10-64XM_020826155.111186甲基转移酶PMT2982×10-85 XM_020847465.112127亚油酸9s脂氧合酶5942×10-54XM_020838492.11551MFP1附着因子1976×10-48XM_020832358.11538谷氨酸丰富蛋白980XR_002305042.142109RNA聚合酶Ⅱ亚单位4986×10-126XM_020836098.132218过氧化物酶42962×10-48 XM_020826405.11542RNA聚合酶II转录亚单位18989×10-158 XM_020830626.161140过氧化物酶42983×10-56 XM_020826405.121256苹果酸酶997×10-100XM_020849155.111876FLX3蛋白990XM_020820097.141804MICOS复合物亚基mic10980XM_020845731.121473转录因子PCF1990XM_020830471.121524WVD2蛋白994×10-44XM_020828213.11365核内小核糖核蛋白质G962×10-152 XM_020836774.131669UTP-葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶990XM_020818943.131682BUD31同源体2996×10-162 XM_020835411.131342组蛋白脱乙酰基酶982×10-47 XM_020831582.11660DCN1蛋白1995×10-168 XM_020824291.141670二硫键异构酶2-2993×10-109 XM_020842392.1129信号肽复合物亚单位1985×10-158XM_020833233.121023快速碱化因子973×10-139 XM_020840549.12579柠檬酸合成酶α链蛋白激酶2992×10-100XM_020829117.122194端锚聚合酶992×10-104XM_020834491.111065mago nashi同源蛋白987×10-63 XM_020838151.122161犬尿氨酸甲酰胺酶970 XM_020817152.182212核转录因子y亚单位C-9991×10-81 XM_020829167.11

表6 同源比对位于铁皮石斛核酸序列的741个石斛SNP位点

基因来源基因/个SNP位点/个基因产物线粒体622线粒体解耦蛋白、磷酸载体蛋白、甲酸脱氢酶、ATP、ADP载体蛋白、ATP合酶、丝氨酸羟甲基转移酶叶绿体2699光诱导蛋白、叶绿素a/b结合蛋白、光系统I、II反应中心蛋白、叶绿体伴侣蛋白、果糖二磷酸醛缩酶、超氧(化)物歧化酶、生物素羧化酶、促氧增强子等有确定的基因序列号25113未确定泛素代谢相关1135泛素蛋白、泛素结合酶、泛素连接酶、泛素受体等核糖体蛋白基因248660S核糖体蛋白核糖体蛋白基因163840S核糖体蛋白锌指蛋白基因序列629锌指蛋结构域蛋白、锌指蛋白组蛋白基因序列525组蛋白水代谢相关925水通道蛋白、脱水蛋白、疏水蛋白异黄酮还原蛋白216异黄酮还原蛋白微管蛋白414微管蛋白不同链网状蛋白314网状蛋白生长素相关基因序列312生长素反应蛋白、生长素抑制蛋白热休克蛋白基因序列312热休克蛋白、热休克同族蛋白蛋白酶体412蛋白酶体亚基钙代谢相关411钙调蛋白、钙周期素结合蛋白、阳离子钙交换器肌动蛋白相关311肌动蛋白、肌动蛋白解聚因子IN2-1蛋白同源物211IN2-1蛋白同源物2型金属硫蛋白3102型金属硫蛋白

续(表6)

基因来源基因/个SNP位点/个基因产物F-box蛋白210F-box蛋白乳酰谷胱甘肽裂解酶210乳酰谷胱甘肽裂解酶DNA结合蛋白110DNA结合蛋白核酮糖二磷酸羧化酶29核酮糖二磷酸羧化酶60S酸性核糖体蛋白3860S酸性核糖体蛋白富含甘氨酸的RNA结合蛋白28富含甘氨酸的RNA结合蛋白病理相关蛋白28病理相关蛋白膜联蛋白28膜联蛋白GTP结合蛋白27GTP结合蛋白胞浆磷酸甘油酸激酶17胞浆磷酸甘油酸激酶翻译起始因子36翻译起始因子应激蛋白35ADP核糖基化因子超氧(化)物歧化酶15超氧(化)物歧化酶自噬相关蛋白25自噬相关蛋白甘露糖相关34甘露糖凝集素、甘露糖脱氢酶延伸因子34延伸因子肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶34肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶托品酮还原酶24托品酮还原酶非特异性脂质转运蛋白14非特异性脂质转运蛋白ADP核糖基化因子33ADP核糖基化因子丝氨酸相关33丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、丝氨酸/精氨酸剪接体硫氧还蛋白23硫氧还蛋白Ras相关蛋白23Ras相关蛋白多聚腺苷酸结合蛋白23多聚腺苷酸结合蛋白跨膜蛋白23跨膜蛋白DNA J同源物12DNAJ同源物

表7 不与铁皮石斛同源的SNP位点所在核酸序列比对

叠连群编号基因产物物种相似度/%E值 登录号SNP位点/个1305细胞色素P450蛋白小兰屿蝴蝶兰863×10-49XM_020744359.161768叶绿体DNA流苏石斛993×10-82LC193521.132111叶绿体DNA梵净山石斛990LC193523.11335叶绿体DNA梵净山石斛990LC193523.112197叶绿体DNA金钗石斛990LC011413.111688外壳蛋白建兰花叶病毒994×10-65KX960746.11828休眠相关蛋白同源物3小兰屿蝴蝶兰872×10-124XM_020733967.1314160S核糖体蛋白L23绿豆984×10-12XM_014656766.21

进行软件或人工筛选开发EST-SNP位点过程中，筛选原则是影响筛选结果准确度和候选SNP位点阳性率高低的关键因素，而EST来源的品种数量对SNP开发频率有重要影响[20]。研究者在甘蔗[11]、玫瑰[15]中对采用的葡萄SNP位点筛选原则进行了改良，筛选SNP位点的候选叠连群规模提高到20，从而提高SNP候选位点的阳性率，但他们的研究结果显示这种修改仅适于EST序列品种来源丰富的物种，且容易漏掉部分候选SNP位点。故本研究基于dbEST数据库中现有的石斛EST序列品种来源较少，EST序列较少的情况，完全参照在葡萄[9]上经试验验证的筛选原则对石斛SNP位点进行预测，在降低SNP位点假阳性率的同时提高候选SNP位点数量，以便为后期开展验证试验提供充足的可选位点。

3 结论与讨论

数据统计分析显示，预测的石斛SNP候选位点含量超过3个的叠连群仅占所有获取的叠连群的30.93%，超过60%的叠连群包含的候选SNP位点不丰富，推测可能与本试验中获取的石斛EST序列的来源品种数量较少和遗传背景差异较小有关。此外，本研究发现预测的石斛SNP候选位点总数及包含SNP候选位点的相同规模叠连群数量随叠连群规模增大而呈下降趋势，这一趋势与已报道的葡萄[9]、芸薹属[17]植物中预测的SNP位点及其叠连群数量与叠连群规模的相关性一样，而与甘蔗[11]、大麦(Hordeum vulgare L.)[20]等禾本科植物中的同类研究结果差异较大；获得的石斛叠连群中包含的SNP位点平均数与叠连群规模之间未显示任何相关性，该结果与玫瑰[15]的SNP位点预测分析结果相似，但有别于菊花[14]、葡萄[9]、芸薹属[17]植物的同类研究结论，故推测不同物种SNP位点在基因上的分布可能存在较大差异。

观察组患者导管留置时间、护理满意度均高于对照组，组间比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

1 021个SNP位点所在核酸序列与铁皮石斛的302个基因同源，其中有相同基因产物或基因所在细胞位置一致的总结归纳后详见表3。经统计共有280个SNP位点分别与铁皮石斛中的88条相关蛋白基因序列存在高度同源，同源性均在90%以上，113个SNP位点所在核酸序列与25条铁皮石斛的未知功能基因序列具有较高的同源性，但基因产物还待进一步验证，有22个SNP位点所在核酸序列与铁皮石斛线粒体的6个核酸序列具有较高同源性，99个SNP位点所在核酸序列与26条叶绿体基因序列同源性较高，剩余507个SNP位点所在核酸序列分别与157条铁皮石斛中某些酶基因或代谢活动相关酶基因序列存在高度同源，同源性均在89%以上。

SNP是动植物基因中广泛、随机分布的一种可遗传变异，具有很多独特的优点，自问世以来不断取得研究者的重视。利用公共数据库的已知EST序列进行SNP位点的开发不仅可以降低成本、快捷高效，而且开发得到的SNP位点还可能位于转录基因的功能区域，对于物种的遗传多样性分析、品种鉴定和遗传育种都具重要意义。目前利用EST序列进行SNP位点开发已经广泛应用于甘蔗(Saccharum officinarum L.)[11]、枇杷(Eriobotrya japonica Lindl.)[12]、葡萄(Vitis vinifera L.)[9]、板栗(Castanea mollissima BL.)[13]、菊花(Dendranthema morifolium (Ramat.) Tzvel.)[14]、玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)[15]、梅(Armeniaca mume Sieb.)、杏(Armeniaca vulgaris Lam.)、桃(Amygdalus persica L.)[16]，芸薹属(Brassica)[17]等多种植物中，但在对石斛的EST-SNP开发方面还未见报道。本研究利用dbEST数据库中的16 183条石斛EST序列，采用SeqMan拼接，最终统计得出石斛的SNP位点平均出现频率为0.17%，SNP发生频率与菊花的SNP发生频率比较接近，与其他植物相比相对较低[11-13,15-17]，这主要是因为不同植物的遗传背景差异不同造成的，遗传背景差异性越大，SNP发生频率越高[18]。另有研究表明，SNP频率与EST来源的品种数量呈相关性，开发的EST序列来源的品种数目越多，SNP位点开发频率就越高[19]。目前对石斛的基因组学研究较少，dbEST数据库中的EST序列品种来源仅有两个，与菊花EST序列来源品种一致，这也是造成在石斛中开发出的SNP频率与菊花相似的重要原因。

对预测的石斛候选SNP位点进行归类，结果显示预测的石斛EST-SNP以转换类型为主，颠换次之，这与葡萄[9]、甘蔗[11]、菊花[14]、玫瑰[15]等已报道候选SNP位点归类分析研究结论相似，但本研究发现预测的石斛SNP位点的插入或缺失突变率低于葡萄[9]、甘蔗[11]、菊花[14]、玫瑰[15]等，这可能与本研究所选取的石斛EST序列来源品种的数量较少、遗传背景差异不明显有关。此外，本研究结果显示石斛SNP位点的C-T转换率为37.0%，高于A-G转换频率(23.5%)，推测可能是由于C在生物体中多以甲基化形式存在，容易脱氨后转换为T，进而导致了转换类型高于颠换类型[21]。

筛选的1 063个置换与颠换类型的SNP候选位点中有1 038个SNP位点被注释到398个基因上，但有25个基因属于铁皮石斛未知基因产物基因序列，需要进一步验证其功能。另外有25个SNP位点所在的10条核酸序列未被注释，需要进一步验证其全长mRNA和基因功能。

我接了名片。她又要了我的手机号，然后动了动手指头，说阿坤，晚安！车子缓缓开走了。保安趁机和我套近乎，说课长好魅力呀，在外傍富婆了？我说开玩笑！没本事的男人才去傍富婆呢，俺这么靓仔，美女傍俺还差不多。然后扬了扬名片，刚才这个够靓吧？我顺便在路灯下瞅瞅名片，吓了我一跳，这个送我回厂的女孩，竟是景花抛光厂的老板。

采用合理的人工筛选原则从提取的16 183条石斛EST序列得出1 083个SNP候选位点，为提高候选SNP位点的阳性率，只筛选了叠连群规模为4以上的EST序列，另外72.6%的叠连群并未参与筛选，这些叠连群中也可能存在着潜在的SNP位点，需采用测序等其他手段进行开发。接下来本研究将根据已获得的研究结果设计相应的SNP位点引物，采用测序、荧光定量或酶切手段进一步验证候选SNP位点的可靠性，为石斛的多样性分析、品种鉴定及遗传育种提供参考。

参 考 文 献

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